E3分别用SalI和 NruI双酶切后，用胶回收试剂盒收集4016bp、27147bp片段。在T4连接酶下连接两种片段， 将连接产物转化感受态细胞DH5a获得更多的克隆子，用去内毒素大提试剂盒提取质粒，经 核酸定量检测仪检测浓度及纯度，将合格的重组质粒pP〇ly2-CAV2-HA置于-20°C备用， pPoly2-CAV2-AE3质粒的SalI和NruI酶切位点之间插入的基因片段序列如SEQIDN0:2 所示。
[0031] 实施例2重组病毒pPoly2-CAV2-HA的包装及鉴定 本实施例中使用的Canine/Guangdong/1/2006(H3N2)细胞由华南农业大学兽医学院外 科教研室分离留存;CAV-2病毒由广州华南农业大学寄生虫教研室袁子国老师惠赠。
[0032] 一、重组病毒pPoly2-CAV2_HA的包装：用Pme I和Asc I双酶切重组质粒pPoly2-CAV2-HA，通过大片段胶回收试剂盒纯化线性化的大片段，长约28000bp。在纯化酶切后的大 片段时必须轻柔操作，最后用洗脱液进行洗脱时，应将同样的洗脱液重复利用洗脱2~3次， 可提高洗脱浓度。经紫外分光光度计核酸检测仪测定片段的浓度及0D260/0D280的比值，其 比值介于1.7~2.1则结果可行，此法同样适用于重组质粒的定量。
[0033]将定量好的重组质粒和线性化片段同时转染MDCK，要求MDCK的转染密度在70~ 80%，转染前用PBS润洗3次，再加入2mL的无血清的MEM以备用。以6孔板转染为例，用Opti-MEM稀释核酸（总量2.5ug(质粒:片段=1:1))至125nL，按照脂质体Lip2000的量为3μ!7孔与 122μ!7孔的Opti-MEM混合，最后将125UL的核酸稀释液与125UL脂质体稀释液混匀后，室温 静置5min。将混合物加入预先润洗好的细胞培养液中，无需换液，每24小时观察一次细胞， 以PBS空白对照组的细胞为参照。当空白组细胞死亡50%以上时，可终止观察，并收集实验组 细胞和上清液，经反复冻融3次后，将冻融液用0.22μπι过滤膜过滤后-80°C保存备用。
[0034]本发明解决了大片段、大质粒转染细胞需借用电转或Ca2+等高效率较麻烦的难题， 完成了脂质体轻松介导转入大基因的工作。需注意的是1)转染的条件，实则根据载体与大 片的摩尔比值来优化，η质粒:η片段=1:1~3之间进行优化，本发明结果显示1:1最佳，1:2次 之，故该比值范围可做参考。2)转染操作手法需特别注意，将脂质体稀释液加入核酸稀释液 时，应将枪头插入液面，缓缓打入，混合时不可用枪吹打，轻柔旋转ΕΡ管即可。应用该发明中 的操作方法可提高转染效率。
[0035]二、重组病毒pP〇ly2-CAV2-HA的鉴定 1、重组病毒pP〇ly2-CAV2-HA在MDCK细胞上的细胞病变:将步骤一中疑似包装好的冻融 液和对照组(CAV2和PBS)的冻融液分别接种MDCK。37°C、5%C02培养箱孵育lh后，更换成病毒 维持液，每隔24h进行观察，直到正常细胞对照组死亡50%，则可收集细胞及上清液进行冻融 处理。如此盲传3~6代，直到重组病毒致使MDCK细胞出现明显的CAV2病变情况，即在48h后 出现明显的细胞肿胀变圆，葡萄串样典型的腺病毒病变(见图5)。
[0036] 2、重组病毒pP〇ly2-CAV2-HA的PCR鉴定:收集病变细胞，用基因组抽提试剂盒抽提 病毒DNA，并以此为模版进行PCR鉴定。PCR扩增引物如下： HA(F):5'-GCTAGCATGAAAACTGTTATTGCTTTAAGC-3'； HA(R):5'-GGATCCTCAAATGCAAATGTTGCACC-3'。
[0037]PCR扩增程序:94°C预变性lmin; 94°C变性15s，60°C退火15s，72°C延伸lmin，循环 35次;72°C终延伸1Omin。将PCR产物进行凝胶电泳检测（图6 )。
[0038] 3、电镜观察重组病毒pPoly2-CAV2_HA的病毒样颗粒:重组病毒感染MDCK细胞后， 经6次盲传纯化后，取第7代病变细胞的上清液。用腺病毒纯化试剂盒进行纯化，配制0.5%磷 钨酸溶液进行负染色，置于电镜下观察病毒形态。可见病毒粒子呈正二十面体结构，病毒表 面由五邻粒和六邻粒构成的衣壳，此为腺病毒样病毒粒子特征(见图7)。
[0039] 4、重组病毒pPoly2-CAV2-HA (rCAV2-HA)的血凝特性：收集重组病毒致80% MDCK 细胞明显病变的上清液，经〇.22μπι过滤膜过滤后。与大鼠、猪、豚鼠、兔、人"0"型血进行血凝 反应。结果显示，重组腺病毒只与大鼠、人"0"型血凝集，不与其他血发生凝集(见表1)。
[0040] 表1重组病毒pPoly2-CAV2-HA的血凝特性检测
5、间接免疫荧光检测HA在重组病毒pPoly2-CAV2-HA中的表达:重组病毒感染MDCK后， 待细胞发生50%的葡萄串样病变时，弃掉上清液，用PBS轻柔洗涤细胞3次。用4%多聚甲醛固 定细胞l〇min，PBS洗三遍，每次5min， 用0.2~0.5%tritonX-100(PBS配制）对细胞进行透化处理lOmin，PBS洗三遍，每次 5min，10%的山羊血清封闭30min，PBS洗涤两遍，加入一抗（鼠源HA单克隆抗体），室温孵育1 h，PBS洗三遍，每次5min，加入羊抗鼠IgG-FITC二抗，室温孵育30~45min，PBS洗四遍，每次 5min。倒置荧光显微镜下观察HA表达情况(见图8)。
[0041] 6、蛋白免疫印迹法检测HA在重组病毒pPoly2-CAV2-HA中的表达：重组病毒感染 MDCK后，待细胞发生50%的葡萄串样病变时，弃掉上清液，收集病变细胞和正常细胞，总蛋白 提取试剂盒提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。灌制10%的SDS-PAGE凝胶，蛋白 上样量为2〇ug/孔，蛋白上样前加入5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100°C孵育5min，恢复室 温后再上样。上层胶电压为80V，下层胶电压为100V。以200mA45min中的湿转法将胶上蛋白 转印到硝酸纤维素膜上。对膜做如下处理:1XTBST洗涤3次，每次lOmin; 5%的脱脂奶粉封闭 2h; 1XTBST洗涤3次，每次lOmin;孵育一抗(犬源的CIV(H3N2)多抗），4°C过夜；1XTBST洗 涤3次，每次lOmin;孵育二抗(羊抗狗IgG-HRP抗体)37°C摇床孵育lh; 1XTBST进行洗涤3 次，每次lOmin;采用ECL化学发光检测试剂盒进行曝光(如图9)，曝光时间为4h。
[0042] 7、重组病毒pPoly2-CAV2-HA在MDCK中的病毒滴度稳定性检测:经过鉴定成功后的 重组腺病毒被接种到MDCK细胞上，待80%细胞出现明显的细胞病变后，收集上清液和细胞， 反复冻融三次后，经〇. 22μπι过滤膜过滤，用于继续传代，如此收集第6代到13代之间的病毒， 进行TCID5Q检测，采用Reed-Muench法计算TCID5Q值（如图10) 8、HA基因在重组病毒pP〇ly2-CAV2-HA中的表达稳定性检测：按照步骤7中病毒传代的 方法，将病毒传至30代，并收集第10代、20代、30代的感染细胞，用总蛋白提取试剂盒提取总 蛋白，BCA定量法标定蛋白量，蛋白加入5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲，100°C孵育5min，恢复室 温后再上样，上样量为30此/孔。按照步骤6中方法进行SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白转印。对膜 对如下处理：1XTBST洗涤3次，每次1〇1^11;5%的脱脂奶粉封闭211;1乂了831'洗涤3次，每次 lOmin;孵育一抗（鼠源的HA(CIVH3N2)单克隆抗体），4°C过夜；1XTBST洗涤3次，每次lOmin; 孵育二抗（IRDye800CWGoatanti-mouseIgG(H+L))37°C摇床孵育lh; 1XTBST进行洗涤3 次，每次1Omin。近红外成像仪中采集蛋白表达信息(如图11)。
【主权项】
1. 一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体，其特征在于，在pPoly2-CAV2-AE3质粒的SalI和Nru頂每切位点之间插入SEQIDN0:2所示基因片段。2. -种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法，其特征在于，包 括如下步骤： 51.PCR扩增获得SEQIDN0:1所示的犬流感病毒H3N2亚型的HA基因序列；52. 将权利要求1所述的HA基因插入pMD18-T质粒中，构建重组质粒pMD18-T-HA;53. 同时双酶切重组质粒pMD18-T-HA和pEGFP-Cl载体，酶切产物连接后构建重组质粒 pEGFP-Cl-HA；54. 同时双酶切重组质粒pEGFP-Cl-HA和pVAXE3载体，酶切产物连接后构建重组载体 pVAXE3-HA〇3. 根据权利要求1的构建方法，其特征在于，PCR扩增的引物序列如SEQIDNO: 3~4所 7Jn〇
【专利摘要】本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法。本发明将犬流感HA基因依次插入pMD18-T、pEGFP-C1、pVAX-E3质粒后，成功将HA基因进行修饰后，再将修饰后的HA基因片段重组到pPoly2-CAV2-△E3载体中，成功构建及病毒包装后在MDCK细胞中获得稳定遗传的pPoly2-CAV2-HA疫苗载体，扩大了犬流感疫苗的研发市场，为后期犬流感疫苗的研制及相关的基础研究提供支持。
【IPC分类】C12N15/861, C12N15/44, C12N15/66
【公开号】CN105463021
【申请号】CN201510988157
【发明人】李守军, 涂黎晴, 袁子国
【申请人】华南农业大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月25日