表达h3n2犬流感ha蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法
【技术领域】
[00011本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组 犬腺病毒疫苗载体的构建方法。
【背景技术】
[0002] 2004年（Crawfordetal.，2005)首次在美国佛罗里达州猎狗身上分离到马源 H3N8病毒，揭示该病毒可通过跨物种转播。时隔一年，人类在犬身上发现H3N8犬流感。之后 几年在欧美几个国家均不间断的出现H3N8犬流感，然而在亚洲板块各国却鲜见该亚型病的 流行。根据报道，在亚洲主要以H3N2亚型为主。2002年在南韩、2006年中国广州等地先后报 道出H3N2犬流感，中国广州华南农业大学兽医学院外科教研室，历经10年不间断地进行犬 流感流行情况进行跟踪调查，结果显示，在中国主要以H3N2犬流感流行为主，通过基因序列 比对发现，各流行病毒株的基因同源性极其高，毒力检测均未见大幅变化，检测发现TCID50 介于103~104之间。面对H5N1、H1N1在犬身上发现的个别案例，及各地逐年递增的H3N2犬流 感流行病例，其流行控制仍是重点、不容小视。
【发明内容】
[0003]本发明从本国国情出发，针对主要流行亚型H3N2病毒，开展疫苗研制的前期工作， 旨在提供一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体，为犬流感防疫做出实施有 效的技术参考。
[0004]本发明的另一个目的是提供一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载 体的构建方法。
[0005]为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的： 一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体，在pP〇ly2-CAV2-AE3质粒的SalI和Nru頂每切位点之间插入SEQIDN0:2所示基因片段。
[0006] 一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法，包括如下步 骤： 51.PCR扩增获得SEQIDN0:1所示的犬流感病毒H3N2亚型的HA基因序列； 52. 将权利要求1所述的HA基因插入pMD18-T质粒中，构建重组质粒pMD18-T-HA; 53. 同时双酶切重组质粒pMD18-T-HA和pEGFP-Cl载体，酶切产物连接后构建重组质粒 pEGFP-Cl-HA； 54. 同时双酶切重组质粒pEGFP-Cl-HA和pVAXE3载体，酶切产物连接后构建重组载体 pVAXE3-HA〇
[0007] 优选地，PCR扩增的引物序列如SEQIDN0:3~4所示。
[0008]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 本发明将犬流感HA基因依次插入pMD18-T、pEGFP-Cl、pVAX-E3质粒后，成功将HA基因进 行修饰后，再将修饰后的HA基因片段重组到pP〇ly2-CAV2-AE3载体中，成功构建并获得稳 定遗传的pP〇ly2-CAV2-HA疫苗载体，扩大了犬流感疫苗的研发市场，为后期犬流感疫苗的 研制及相关的基础研究提供支持。
【附图说明】
[0009]图1为HA基因的PCR扩增产物的凝胶电泳图，1为基因Marker，2为扩增产物条带；3 为阴性对照。
[0010]图2为PMD18-T-HA质粒酶切鉴定结果，1为Marker:6000bp;2，3为PMD18-T-HA经Nhe I和BamH I双酶切结果;4为pMD18-T-HA质粒。
[0011]图 3 为pEGFP-Cl-HA质粒酶切鉴定结果，1为Marker:6000bp; 2 为pEGFP-Cl-HA质粒 经AseI和MluI双酶切结果；3为pEGFP-Cl-HA质粒。
[0012]图4为PVAXE3-HA质粒酶切鉴定结果，1为NheI单酶切质粒;2为XhoI单酶切质粒； 3为PpuMI单酶切质粒;4、质粒；5、Marker:lkb;6、Marker: 2000bp〇
[0013]图5为重组病毒pP〇ly2-CAV2-HA在MDCK细胞上的细胞病变（100X)。
[0014]图6为重组病毒pPoly2-CAV2-HA的PCR鉴定，M、Marker: 2000bp; 1、CAV2 病毒DNA为 模版;2、H20为模版;3、重组病毒pPoly2-CAV2-HADNA为模版;4、重组pPoly2-CAV2-HA质粒 为模版。
[0015]图7为电镜观察重组病毒pPoly2-CAV2-HA的病毒样颗粒(68000X)。
[0016]图8为间接免疫荧光检测HA在重组病毒pPoly2-CAV2-HA中的表达，A:PBS感染MDCK; B:重组病毒pPoly2-CAV2-HA感染MDCK; C: CAV-2感染MDCK。
[0017]图9为WB检测HA在重组病毒pPoly2-CAV2-HA中的表达。
[0018]图10为重组病毒pPoly2-CAV2-HA在MDCK中的病毒滴度稳定性检测。
[0019]图11为HA基因在重组病毒pPoly2-CAV2-HA中的表达稳定性检测。
【具体实施方式】
[0020]下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例 只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特 殊说明，均为常规方法;所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂 和材料。
[0021] 下列实施例中使用到的MDCK细胞购买于ATCC细胞库，PVAXE3载体、pPoly2-CAV2-ΛΕ3载体由华南农业大学兽医学院寄生虫教研室袁子国老师惠赠;pMD18T载体购自大连宝 生物工程公司；感受态DH5a(天根)购自广州真知生物有限公司。
[0022] 实施例1 1、HA基因的扩增:通过NCBI上ClVH3N2亚型的HA基因进行比对分析，选取同源系数较 高的一株病毒(Canine/Guangdong/1/2006(H3N2))为模版，设计HA基因的0RF序列扩增引 物。上游引物加入Nhe頂每切位点，下游引物加入BamH頂每切位点。
[0024]PCR扩增反应的体系和条件参考本领域常规的方法，PCR产物经凝胶电泳检测后结 果见图1，切胶回收PCR扩增产物，经测序正确后备用，HA基因的核苷酸序列如SEQIDN0:1 所示。
[0025] 2、pMD18T-HA重组质粒的构建及鉴定:配置下列反应:无菌水1.8UUPMD18-T载体 0.2uL、PCR扩增产物3.OyUSolutionI5uL，以上成分混匀后，16°C连接过夜，将连接产物 转化感受态细胞DH5a，通过液态培养基扩繁，质粒提取试剂盒，获得PMD18T-HA质粒，经Nhe I和BamHI酶切鉴定（图2)并送件测序结果正确后进行后续实验。
[0026] 3、pEGFP-Cl-HA重组质粒的构建及鉴定：用NheI和BamHI同时双酶切pEGFP-Cl 载体和PMD18T-HA重组质粒，胶回收纯化载体大片段和HA片段，载体大片段长约4000bp。通 过T4连接酶将酶切后的载体大片段和切下的HA片段16°C连接过夜，连接产物转化感受态细 胞DH5a，通过液态培养基扩繁，质粒提取试剂盒，获得PEGFP-C1-HA重组质粒，质粒经AseI 和MluI双酶切鉴定（如图3)，胶回收试剂盒回收酶切后的目的片段，经测序后发现酶切后 目的片段长2537bp，-20°C保存用于后续实验。
[0027] 4、pVAXE3_HA重组质粒的构建及鉴定 去磷酸化及粘性末端补平：SspI酶切pVAXE3载体，获得7003bp的线性化片段Λ PVAXE3。用小肠碱性磷酸酶CIAP进行去磷酸化。具体操作如下：目的片段1~20pmol、 10XCIAPbuffer5yL、CIAP(10~30U/yL)l~2yL、无菌水补齐到50yL，将该体系溶液置于37 °C水浴锅30min;在加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25 : 24 : 1)混合液充分混匀后， lOOOOprm离心5min，弃掉上清，如此重复一次；加入氯仿/异戊醇（24:l)50yL充分混勾后， lOOOOprm离心5min，弃掉上清；依次加入5yL的3MNaAc、125μΙ^7_Κ乙酸，_20°C预冷30min， lOOOOprm离心10min，弃掉上清；加入200yL预冷的70%无水乙醇洗涤沉淀，lOOOOprm离心 10min，弃掉上清，如此重复一次;超净台中自然晾干;用15tiL的无菌水溶解沉淀。-20°C存储 备用。
[0028] 步骤3中回收的2537bp的目的片段含有"CMV-HA-polyA"。用KlenowFragment酶进 行补粘性末端。具体操作如下25uL体系：目的片段25ng，无菌水补齐到19uL后，依次加入 10)(KlenowFragmentbuffer2.5yL、dNTP2.5yL、KlenowFragmentlyL，将该体系溶液置 于37°C水浴锅3h;在转入65°C水浴锅5min;用无水乙醇沉淀法收集去磷酸化片段。-20°C存 储备用。
[0029]连接:将平端处理的"CMV-HA-polyA"片段与去磷酸化的ApVAXE3按照摩尔数比值 为1:1的比例混合，在T4连接酶的作用下，16°C连接过夜，将连接产物转化感受态细胞DH5a， 通过液态培养基扩繁，质粒提取试剂盒，获得PVAXE3-HA重组质粒。分别用NheI、XhoI、 卩口11]\11酶切鉴定（图4)，他6 1酶切得到42526?、21776?、12886?、14326?、3976?片段411〇1 酶切得到6100bp、2446bp、1000bp片段；PpuMI酶切得到4396bp、2424bp、1795bp、381bp、 332bp、172bp、36bp片段。将鉴定正确的质粒送样测序。
[0030] 5、pPoly2-CAV2-HA的构建及鉴定:pVAXE3-HA与pPoly2-CAV2-A