5 ±0.01 Mpa、通气比 1:0.8 vvm，300 rpm揽摔，发酉孝96 h。
[0039]发酵结束后，经检测杆菌肽的发酵单位为847U/ml。结果见表1。
[0040]实施例4、500mL摇瓶发酵制备杆菌肽 地衣芽孢杆菌菌株种子液的制备 将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，28°C、240 rpm、培养24 h获得 种子液。
[0041] 其中所述的种子培养基按以下方法制得:玉米淀粉3.0克、葡萄糖20.0克、酵母粉 20.0克、硫酸铵1.0克、氯化钠2.0克、七水硫酸镁1.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.5,121 °C 灭菌 30min。
[0042] 本发明所述杆菌肽产生菌为编号ATCC 10716的菌株。
[0043]发酵培养基组成： 玉米淀粉30.0克、葡萄糖20.0克、棉籽蛋白粉30.0克、酵母粉10.0克、硫酸铵3.0克、玉 米浆5.0克、磷酸二氢钾1.0克、氯化钠2.0克、七水硫酸镁1.0克，加自来水定容至1000mL， pH6 · 5，121°C 灭菌 30min。
[0044] 摇瓶发酵条件:500 ml装量三角瓶6个，每瓶装50ml培养基，种子培养24小时后接 种，接种量为10%，温度28 °C、转速220 rpm，发酵培养25小时后，每瓶加入粒径为ΙΟμπι的 超顺纳米微球介质〇.5g，发酵周期72 h。
[0045] 发酵结束后，将6瓶发酵液合并后，磁性分离发酵液中的超顺磁性微球，在超顺磁 性微球中加入18ml的4%氨水洗脱吸附的杆菌肽，分别测定洗脱液与发酵液中的杆菌肽。计 算杆菌肽的发酵单位为885U/ml。结果见表1。
[0046]实施例5、5L罐发酵制备杆菌肽 地衣芽孢杆菌菌株种子液的制备 将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，30°C、200 rpm、培养20 h获得 种子液。
[0047] 其中所述的种子培养基按以下方法制得:玉米淀粉5.0克、葡萄糖10.0克、酵母粉 10.0克、硫酸铵2.0克、氯化钠2.0克、七水硫酸镁1.5克，加自来水定容至1000mL，pH7.0,121 °C 灭菌 30min。
[0048] 本发明所述杆菌肽产生菌为编号ATCC 10716的菌株。
[0049]发酵培养基组成： 玉米淀粉90.0克、葡萄糖60.0克、棉籽蛋白粉45.0克、酵母粉45.0克、硫酸铵6.0克、玉 米浆12.0克、磷酸二氢钾4.5克、氯化钠7.5克、七水硫酸镁6.0克，加自来水定容至3L， pH6.8，121°C灭菌30min，5L自动发酵罐发酵培养。
[0050] 发酵条件:装料量3L，种子培养20小时后接种，接种量为6%，罐温29 °C、罐压0.05 ±0.01 Mpa、通气比l:1.2vvm，400 rpm搅拌，在培养至15小时后，加入粒径为30μηι的超顺 纳米微球介质60g，培养周期96 h。
[0051 ]发酵结束后，磁性分离发酵液中的超顺磁性微球。在超顺磁性微球中加入360ml的 4%氨水洗脱吸附的杆菌肽，分别测定洗脱液与发酵液中的杆菌肽。计算杆菌肽的发酵单位 为1068U/ml。具体结果见表1。
[0052] 实施例6、10L罐发酵制备杆菌肽 地衣芽孢杆菌菌株种子液的制备 将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，28°C、220 rpm、培养28 h获得 种子液。
[0053] 其中所述的种子培养基按以下方法制得:玉米淀粉4.0克、葡萄糖15.0克、酵母粉 15.0克、硫酸铵1.0克、氯化钠1.0克、七水硫酸镁1.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.8,121 °C 灭菌 30min。
[0054] 本发明所述杆菌肽产生菌为编号ATCC 10716的菌株。
[0055]发酵培养基组成： 玉米淀粉200.0克、葡萄糖50.0克、棉籽蛋白粉150.0克、酵母粉100.0克、硫酸铵10.0 克、玉米浆15.0克、磷酸二氢钾5.0克、氯化钠15.0克、七水硫酸镁5.0克，加自来水定容至 5L，pH7.0，121°C灭菌30min，10L自动发酵罐发酵培养。
[0056] 发酵条件:装料量5L，种子培养28小时后接种，接种量为8%，罐温30 °C、罐压0.05 ±0.01 Mpa、通气量l:0.8vvm，300 rpm搅拌，在培养至20小时后，加入粒径为20μπι的超顺 纳米微球介质l〇〇g，发酵周期96 h。不同发酵培养时间的菌体形态见图1和图2。
[0057]发酵结束后，磁性分离发酵液中的超顺磁性微球，在超顺磁性微球中加入600ml 4%的氨水溶液洗脱吸附的杆菌肽，分别测定洗脱液与发酵液中的杆菌肽。计算杆菌肽发酵 单位为1228U/ml。结果见表1。
[0058]对比例1、5L罐发酵制备杆菌肽 地衣芽孢杆菌菌株种子液的制备 将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，28°C、220 rpm、培养28 h获得 种子液。
[0059]其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉3.0克、葡萄糖20.0克、酵母粉 20.0克、硫酸铵1.0克、氯化钠1.0克、七水硫酸镁1.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.5,121 °C 灭菌 30min。
[0060] 本发明所述杆菌肽产生菌为编号ATCC 10716的菌株。
[0061] 发酵培养基组成： 玉米淀粉120.0克、葡萄糖60.0克、花生饼粉90.0克、酵母粉60.0克、硫酸铵6.0克、玉米 浆9.0克、磷酸二氢钾3.0克、氯化钠6.0克、七水硫酸镁3.0克，加自来水定容至3L，pH6.5， 121°C 灭菌 30min。
[0062] 发酵条件:装料量3L，种子培养28小时后接种，接种量为8%，罐温29 °C、罐压0.05 ±0.01 Mpa、通气比1:1.0 vvm，300 rpm搅拌，发酉孝％ h，5L自动发酉孝罐发酉孝培养。
[0063]发酵结束后，经检测杆菌肽的发酵单位为550U/ml，结果见表1。
[0064]表1有机氮源及超顺磁性微球对微生物制备杆菌肽对比
将表1中结果比较计算可知： 有机氮源为棉籽蛋白粉、酵母粉时，比为花生饼粉、酵母粉时，可使发酵单位至少提高 (651-550)/550=18%，且杂质 F 降到 2% 以下。
[0065]棉籽蛋白粉:酵母粉为3:2时，比其它比例最多可使发酵单位提高(847-651)/651 = 30%，杂质F最低。
[0066]其它条件相同的情况下，添加超顺磁性微球相比不添加，实施例2相比对比例1，发 酵单位提高（885-651)/651=36%;实施例3相比对比例2,发酵单位提高（1068-752)/752= 42%;实施例4相比实施例1，发酵单位提高（1228-847)/847=45%。可见添加超顺磁性微球使 发酵单位提高均在36%以上。
[0067] 实施例6相比对比例1，即综合优化后可使发酵单位提高（1228-550)/550=123%。
【主权项】
1. 一种发酵生产杆菌肽的方法，包括以下步骤： a、 制备地衣芽孢杆菌菌株的种子液 将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，28-30°C、200-240rpm，培养 20-28h获得种子液； 其中所述的种子培养基按以下方法制得:玉米淀粉3.0-5.0克、葡萄糖10.0-20.0克、酵 母粉10.0-20.0克、硫酸铵1.0-2.0克、氯化钠1.0-2.0克、七水硫酸镁1.0-1.5克，加水定容 至 1000mL，pH6·5-7·0，121°C灭菌 30min; b、 制备地衣芽孢杆菌菌株的发酵液 将上述种子液以体积百分比6-10%的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发 酵，发酵时间72-96h，发酵温度28 -30 °C，得到发酵液； 其中所述发酵培养基按以下方法制得:玉米淀粉30.0-40.0克、葡萄糖10.0-20.0克、棉 籽蛋白粉15.0-30.0克、酵母粉10.0-20.0克、硫酸铵2.0-3.0克、玉米浆3.0-5.0克、磷酸二 氢钾1.0-1.5克、氯化钠2.0-3.0克、七水硫酸镁1.0-2.0克，加水定容至1OOOmL，pH6.5-7.0， 121°C灭菌 30mi。2.根据权利要求1所述的方法，步骤b中所述棉籽蛋白粉和酵母粉加入比例为3:2。3. 根据权利要求1或2所述的方法，步骤b中发酵15-25小时之间添加经过灭菌后的超顺 磁性微球。4. 根据权利要求1所述的方法，步骤b中所述发酵压力为0.05±0.01Mpa、搅拌速度为 300_400rpm，通气比为1:0 · 8-1 · 2vvm。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超顺磁性微球的粒径为10_30um，粒径 分布为单分散，表面的功能基团为羧基基团。6. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，每升发酵液添加10-20g所述超顺磁性微 球。
【专利摘要】本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种提高微生物发酵生产杆菌肽产量的方法。该方法通过优化有机复合氮源和发酵条件，保证了批次间发酵单位的稳定性，降低了杂质F含量。通过在杆菌肽合成期间添加超顺磁性微球吸附发酵液中的杆菌肽，降低发酵产物对产生菌的反馈抑制。发酵结束后，杆菌肽的发酵单位可达1228U/ml，比优化前可使杆菌肽产量提高123%，提高了产能，降低了能耗及废弃物的排放。
【IPC分类】C12P21/00, C12R1/10, C12N1/20
【公开号】CN105483064
【申请号】CN201610097983
【发明人】任风芝, 张雪霞, 王耀耀, 耿文飞, 郑智慧, 杨海静, 高任龙, 段宝玲, 张炜
【申请人】华北制药集团新药研究开发有限责任公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年2月23日