>[0050] 最后一次免疫结束7天后采取颈动脉放血，采血前应禁食12h，保证饮水充足，血液 37°C培养箱放置Ih后，再放置4°C冰箱过夜，第二天离心收集血清，血清分装后置于_80°C保 存。
[0051 ]对比实施例
[0052] 禽结核高免血清的常规制备方法如下：
[0053] -、免疫抗原的制备
[0054] (1)将30ml液体培养基增菌培养的禽结核杆菌分装入50ml离心管中，8000g离心 15min，巴氏吸管轻轻吸取上清液弃之；
[0055] (2)加入30ml灭菌后的PBS缓冲液，9000g离心15min，巴氏吸管轻轻吸取上清液弃 之；
[0056] (3)加入30ml灭菌后的PBS缓冲液，1000 Og离心15min，巴氏吸管轻轻吸取上清液弃 之；
[0057] (4)加入15ml质量分数0.3 %的甲醛溶液，37°C培养箱中放置24h，再室温下放置 24h；
[0058] (5)10000g离心15min，巴氏吸管轻轻吸取上清液弃之；
[0059] (6)加入30ml灭菌后的PBS缓冲液，1000 Og离心15min，巴氏吸管轻轻吸取上清液弃 之，该步骤重复至少三次，直至甲醛被洗净；
[0060] (7)加入适量灭菌后的PBS缓冲液制成悬浮液，悬浮液OD6(X)约为0.5;
[0061] (8)取7.5ml悬浮液加入7.5ml弗氏不完全佐剂，用匀浆机进行乳化;乳化完成后， 取一滴乳化过的液滴滴在冰水里，看此液滴在一分钟内是否分散，如果不分散则表明乳化 完全，否则继续乳化;乳化完全后作为免疫抗原，置于4°C备用；
[0062] 二、动物免疫
[0063] 选取2-3月龄健康雄性新西兰兔，采用多点皮下注射进行免疫，具体免疫程序按表 2进行免疫；
[0064] 表2制备兔抗禽结核高免血清的免疫程序
[0065]
[0066] C、采血及血清收集
[0067]最后一次免疫后14天采血，采血前应禁食12h，保证饮水充足，血液37°C培养箱放 置Ih后，再放置4°C冰箱过夜，第二天离心收集血清，血清分装后置于-80°c保存。
[0068] 采用试管凝集试验测定实施例和对比实施例获得的高免血清抗体效价，测定方法 见表3,其中阴性对照1为不加血清，仅有抗原；阴性对照2为不加抗原，仅有血清，结果判定 时对照1和对照2均无凝集现象产生。
[0069] 表3试管凝集试验测定抗体效价
[0070]
[0071] 试管放置于37°C培养箱中孵育过夜，抗体效价测定结果为:实施例获得的高免血 清抗体检测效价达到1/128,对比实施例获得的高免血清抗体检测效价达到1/16。
[0072] 由两个实施例对比可知，实施例1所述方法制备免疫抗原时不需要佐剂，也不需要 乳化操作，整个制备高免血清的过程只需26天(常规方法需要57天），获得的高免血清抗体 效价达1/128。
[0073] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 禽结核高免血清，其特征在于，通过W下步骤制备:直接采用灭活的禽结核杆菌作为 免疫抗原，采用耳缘静脉注射法进行免疫，每3天免疫一次，共免疫屯次，最后一次免疫完毕 后7天采血并收集血清。2. 根据权利要求1所述的禽结核高免血清，其特征在于，所述高免血清的抗体效价为1/ 128。3. 根据权利要求1所述的禽结核高免血清，其特征在于，所述免疫抗原的制备过程为： 将禽结核杆菌收集后用灭菌的PBS缓冲液清洗两次，加入质量分数0.3 %的甲醒溶液37°C放 置24h后再室溫放置24h灭活，然后用灭菌的PBS缓冲液将甲醒洗净，最后用灭菌的PBS缓冲 液配制成ODs日日为0.5的悬浮液即可。4. 根据权利要求1所述的禽结核高免血清，其特征在于，所述免疫抗原的制备过程具体 如下： (1) 将禽结核杆菌装入50ml离屯、管中，SOOOg离屯、15min，己氏吸管吸弃上清液； (2) 加入灭菌后的PBS缓冲液，9000g离屯、15min，己氏吸管吸弃上清液； (3) 加入灭菌后的PBS缓冲液，1000 Og离屯、15min，己氏吸管吸弃上清液； (4) 加入质量分数0.3 %的甲醒溶液，37°C培养箱放置24h，再室溫下放置24h; 1000 Og离 屯、15min，己氏吸管吸弃上清液； (5) 加入30ml灭菌后的PBS缓冲液，1000 Og离屯、15min，己氏吸管吸弃上清液，重复操作 至甲醒被洗净； (6) 加入灭菌后的PBS缓冲液制成ODsqq为0.5的悬浮液即可。5. 根据权利要求1所述的禽结核高免血清，其特征在于，免疫所用动物为2-3月龄健康 雄性新西兰兔。6. 根据权利要求1所述的禽结核高免血清，其特征在于，所述免疫的程序具体为：7. 权利要求1~6任一项所述禽结核高免血清的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： A、免疫抗原的制备 a) 将禽结核杆菌装入50ml离屯、管中，SOOOg离屯、15min，己氏吸管吸弃上清液； b) 加入灭菌后的PBS缓冲液，9000g离屯、15min，己氏吸管吸弃上清液； C)加入灭菌后的PBS缓冲液，1000 Og离屯、15min，己氏吸管吸弃上清液； d)加入质量分数0.3%的甲醒溶液，37°C培养箱放置24h，再室溫下放置24h; 1000 Og离 屯、15min，己氏吸管吸弃上清液； e) 加入30ml灭菌后的PBS缓冲液，1000 Og离屯、15min，己氏吸管吸弃上清液，重复操作至 甲醒被洗净； f) 加入灭菌后的PBS缓冲液制成ODsqq为0.5的悬浮液即可； B、 动物免疫 选取2-3月龄健康雄性新西兰兔，采用耳缘静脉注射法进行免疫，免疫程序具体为：C、 采血及血清收集 最后一次免疫结束7天后采取颈动脉放血，血液37°C培养箱放置化后，再4°C冰箱放置 12h，离屯、收集血清，血清分装后置于-80°C保存。
【专利摘要】本发明公开一种禽结核高免血清及其制备方法，制备步骤包括：直接采用灭活的禽结核杆菌作为免疫抗原，采用耳缘静脉注射法进行免疫，每3天免疫一次，共免疫七次，最后一次免疫完毕后7天采血并收集血清。本发明只用灭活的菌体通过静脉注射免疫动物即可制备出高效价血清，无需乳化操作，整个制备高免血清过程仅需26天，试管凝集试验测抗体效价达1/128，与常规高免血清制备方法相比，本发明所述方法免疫抗原制备的条件要求低，免疫程序操作更简单，所需时间更短，且能获得高效价抗体水平。
【IPC分类】C07K16/12, C07K16/06
【公开号】CN105504054
【申请号】CN201610053878
【发明人】朱德康, 陈泓汐, 程安春, 汪铭书, 宋晓恒
【申请人】四川农业大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月26日