多肽固相合成基质及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种多肽固相合成基质，属于多肽/蛋白质合成技术领域。
【背景技术】
[0002] 小分子肽合成是蛋白质和多肽化学中的一个很活跃的领域，基本合成方法可分为 液相合成和固相合成两大类。固相法是Robert Bruce Merrifield在1963年提出的，现在称 之为固相肽合成(SPPS)，是肽化学的一个重大突破。与传统的液相工艺相比，固相法具有很 多优势，例如缩短了生产周期，且通常具有较高的得率和纯度。它在许多肽类药物研究的进 程中起到重要作用。随着新缩合方法和新型树脂的出现，固相法的整体效率普遍地提高。
[0003] 在固相合成中，具有优良性能的载体往往是成功的关键，带有各种连接功能基的 低交联聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂化学性质稳定，溶胀率适度，热稳定性和机械性能较好， 是目前国内外最广泛使用的固相载体，而这其中又以Wang树脂的使用较为广泛。
[0004] 传统的Wang树脂多以聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物(PS)为骨架，通过氯甲基化制 得氯甲基化聚苯乙烯树脂(Merridield树脂，PS-CH 2-Cl),再通过与对羟基苯甲醇的反应引 入功能基团（Lu GS，et al .J.Org.Chem. 1981,46,3433-3436)。但是目前这样的树脂有以下 的缺点：1)合成原料氯甲基化的聚苯乙稀反应中要用到强致癌的氯甲醚为原料(Roland LD,et al ,Chemistry .&Industry, 1993,4(1): 10);2)氯甲基化反应中会伴随氯甲基的多取 代和二次交联，会影响到树脂的性能(Barrett J，et al, US 3812061,1997) ;3)在后续和对 羟基苯甲醇的反应中，传统的合成方法都要用到甲醇钠，由于甲氧基的强亲核能力，易取代 活性氯而发生副反应(Lu GS，et al.J.Org.Chem. 1981,46,3433-3436)，进而影响固相载体 在后续固相合成反应中的负载率。
【发明内容】
[0005] 目的：为解决现有技术的不足，本发明提供一种多肽固相合成基质，提供一种固相 合成基质;利用该固相合成基质可以更好的合成多肽。
[0006] 技术方案:为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
[0007] -种多肽固相合成基质，其特征在于，所述固相合成基质是以BVA化合物制备的， 所述BVA化合物选自式I、式II、式III中的一种或几种；
[0009] 1，3_双对乙稀节氨基丙烷I，4_bi s (4-viny lbenzy l-amino)propane，简称为 BVAPro；
[0011] I，3_双对乙稀节氨基丁烧I，4-bis(4-vinylbenzyl_amino)butane，简称为BVAB;
[0013] 1，3_双对乙稀节氨基戊烧I，4_bi s (4-vinyl benzyl-ami no) pentane，简称为 BVAPen;所述的多肽固相合成基质，其特征在于:通过BVA化合物与苯乙烯共聚制备而成，制 备过程选自：
[0014] (a)在含聚乙烯醇的水溶液中加入苯乙烯、BVA化合物、和过氧化苯甲酰，搅拌后保 温于0~90°C (优选为50~65°C，最优选为60°C)，再过滤，洗涤，干燥，筛分选得粒径为50~ 250目（优选为100~200目）的微球;然后，向微球加入二氯甲烷溶胀，再加入1，4_二氯甲氧 基丁烷并滴加无水四氯化锡进行反应，之后抽滤，洗涤，干燥;然后加入二甲基乙酰胺溶胀， 搅拌，再加入含对羟基苯甲醇的二甲基乙酰胺溶溶液和甲醇钠，在N 2保护下，在40~60°C (优选为45~55°C，最优选为50°C)下搅拌反应，过滤，洗涤，干燥，由此制备获得固相合成基 质；
[0015] (b)在含聚乙烯醇的水溶液中加入苯乙烯、BVA化合物、和过氧化苯甲酰，搅拌后保 温于0~90°C (优选为50~65°C，最优选为60°C)，再过滤，洗涤，干燥，筛分选得粒径为50~ 250目（优选为100~200目）的微球;然后，向微球加入二氯甲烷溶胀，再加入含三氯化铁的 硝基苯溶液和N-氯甲基邻苯二甲酰亚胺，于40~50°C (优选为45°C)反应，抽滤，洗涤，再加 入水合肼的甲醇溶液回流，再抽滤，洗涤，干燥;然后加入二甲基甲酰胺中溶胀，再加入含 Fmoc-Rinker Linker、N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、HOBT、和DIEA的二甲基甲酰胺溶液，在N2 保护下反应，再抽滤，洗涤，干燥，由此制备获得固相合成基质；
[0016] (c)在含聚乙烯醇的水溶液中加入苯乙烯、BVA化合物、和过氧化苯甲酰，搅拌后保 温于0~90°C (优选为50~65°C，最优选为60°C)，再过滤，洗涤，干燥，筛分选得粒径为50~ 250目（优选为100~200目）的微球;然后，向微球加入无水二氯甲烷溶胀，滴加氯乙酰氯和 无水三氯化铝，在N 2保护下反应，再抽滤，洗涤，干燥，由此制备获得固相合成基质；
[0017] (d)在含聚乙烯醇的水溶液中加入苯乙烯、BVA化合物、和过氧化苯甲酰，搅拌后保 温于0~90°C (优选为50~65°C，最优选为60°C)，再过滤，洗涤，干燥，筛分选得粒径为50~ 250目（优选为100~200目）的微球;然后，向微球加入二氯甲烷溶胀，再加入无水氯化铝和 硝基苯，滴加含1-氯-2-二氯苯甲基苯和二氯甲烷的混合物反应，洗涤，再加入亚硫酰氯和 二氯甲烷搅拌，抽滤，洗涤，干燥，由此制备获得固相合成基质；
[0018] 所述的多肽固相合成基质，其特征在于:制备过程具体包括以下步骤：
[0019] (1)在5000ml四口瓶中加入3000ml含0 · 5 %w/w聚乙烯醇的水溶液，加入由594g苯 乙烯、32g BVA化合物、1.5g过氧化苯甲酰组成的有机相溶液，搅拌，控制搅拌速度使液珠粒 径维持在100-200目之间达到稳定，然后升温至80°C，保温8小时，过滤，用热水洗3次，烘干， 筛分选得粒径100~200目的微球载体基球，即PS-BVA白球;称取上述制备的PS-BVA白球 I Og，加入100mL二氯甲烷溶胀40分钟，加入含0.6M三氯化铁的硝基苯溶液5ml、N-氯甲基邻 苯二甲酰亚胺2.2g，45°C反应3小时，抽滤，依次用二氯甲烷、二氧六环、甲醇洗，然后加入 5 % v/v水合肼的甲醇溶液IOml，回流4小时，抽滤，依次用乙醇、50 % v/v乙醇水溶液、二甲基 甲酰胺、二氯甲烷、甲醇洗，真空干燥得产品，测得氨基含量:〇.94mmol/g;称取上述制备的 产品50g，溶于500ml二甲基甲酰胺中搅拌溶胀30分钟，N 2保护下，加入含Fmoc-Rinker Linker40g、N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑148、!1(?1'13.58、0此六4〇1111的二甲基甲酰胺溶液，反 应2小时，抽滤，用异丙醇，二氯甲烷，甲醇洗，真空干燥；
[0020] (2)在1000 ml四口瓶中加入600ml含0.5%w/w聚乙烯醇的水溶液，60g苯乙烯，25g 乙烯基苯甲酸，5. IgBVA化合物，过氧化苯甲酰0.3g，搅拌并使液珠粒径维持稳定在200-400 目之间，然后升温至80°C，反应8小时，过滤，用热水洗3次，烘干，筛分选取200-400目微载体 基球；
[0021 ] (3)在1000 ml四口瓶中加入600ml含5 % w/w氯化钠和0.5 % w/w聚乙烯醇的水溶液， 40g苯乙稀，28g对氯甲基苯乙稀，5. Ig BVA化合物，过氧化苯甲酰0.3g，搅拌并使液珠粒径 维持稳定在100-200目之间，然后升温至80°C，反应8小时，过滤，用热水洗3次，烘干，筛分选 取100-200目微球载体基球，测得微载体氯含1.25mmol/g;称取上述制备的100-200目微球 载体基球IOg，用丙酮IOml溶胀，加入I .Og哌嗪，0.5g碳酸钾，40°C下搅拌反应12小时，抽滤， 用四氢呋喃，二氯甲烷，二氧六环，甲醇洗载体树脂，真空干燥得到固相合成基质。
[0022] 作为优选方案，所述固相合成多肽采用Fmoc固相多肽合成法制成。
[0023] 作为优选方案，所述Fmoc固相多肽合成法中每一氨基酸连接步骤的时间不超过30 分钟。
[0024] 本发明还提供了 BVA化合物(式I、式II、式III)在制备固相合成方法中所用的固相 合成基质的应用。
[0025] 有益效果:本发明具有以下优点：通过BVAPr〇、BVAB、BVAPen制备的固相合成基质， 适应性强，能够针对不同原料的基团；溶胀性优良，固相合成产物的产率高；反应动力学性 质良好，合成速度快;不易产生碎片，产物纯度高;制备成本较低，便于推广。
【具体实施方式】
[0026]下面结合实例对本发明做具体说明：
[0027]实施例1:苯乙烯与BVA聚合微球载体基球的制备
[0028] 在5000ml四口瓶中加入3000ml含0.5% (w/w)聚乙烯醇的水溶液，加入由594g [0029]苯乙稀、32g实施例1制备(无需进一步提纯，直接应用）的BVA、1.5g过氧化苯甲酰 组成的有机相溶液，搅拌，控制搅拌速度使液珠粒径维持在100-200目之间达到稳定，然后 升温至60°C，保温8小时。过滤，用热水洗3次，烘干，筛分选得粒径100~200目的微球载体基 球(简称PS-BVA白球）。在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷(DCM)等溶剂中进行溶胀性测 试：溶胀度分别为6.4ml/g(DMF)和8.3ml/g(DCM)，