一种从木质纤维素汽爆水解液中获得漆酶天然介体的方法
【专利说明】
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化工领域，特别涉及一种从木质纤维素汽爆水解液中获得漆酶天然介体的方法。
【【背景技术】】
[0002]漆酶及漆酶介体催化的反应被认为是绿色反应。因为，漆酶与其他木质素降解酶相比，对有机物的氧化催化不需要任何辅助条件(LiP和MnP均需要H2O2的参与)，空气中的氧气就能满足其需要;而且反应的副产物只有H2O,没有二次污染，因此利用漆酶来去除环境中的污染物有着独特的优势。因此它是未来工业生物催化领域最重要及最具产业化前景的氧化还原酶之一，并引发了国内外对漆酶的研究热潮。但是，由于低氧化还原电势(0.5?
0.8V)的漆酶仅能直接氧化降解具低氧化还原电势的酚型木素结构单元。对于占木质素总量中绝大部分的非酸型结构单元则不能被氧化。1990年，Paice和Bourbonnai s首次发现了一些小分子化合物可以作为氧化还原介体(redox mediator)，充当漆酶与底物之间的电子梭(electron shuttle)，以不同的催化机制实现漆酶与非酚类及大分子木质素类等底物间的电子传递，从而使漆酶所催化的底物种类和程度都将大大增加。自此，漆酶/介体体系的应用和催化机理的研究开始如火如荼地进行。
[0003]有效的漆酶催化介体通常是一些带有N-OH或N = O基团的N-杂环物。同时，理想的介体应该是一类能够产生不被酶失活的稳定的自由基(以氧化态形式存在)，且经过多次循环利用能够保持其活性的小分子化合物。另外，从工业应用和环保的角度，介体应该是环境友好并且低廉的。然而，目前大多数漆酶的介体都是来自人工合成的小分子物质，如2，2 ’ -连氮-3-乙苯-二噻挫_6横酸(ABTS)、1-轻基苯并三挫(l-hydroxybenzotriazole，HBT)等。这些人工合成的介体市场价格昂贵，且难确保其本身或其衍生物不具有毒性，造成至今漆酶-介体体系仍未应用于工业生产。近年来，漆酶催化天然介体的挖掘已经成为国内外学者研究的热点。一些木素降解产物作为漆酶催化反应的天然介体，由于具有环境和生态的优势而引起了国内外学者浓厚的研究兴趣。已知的天然漆酶催化介体，如丁香醛、乙酰丁香酮、香草醛、香草乙酮、香草酸甲酯、对香豆酸、二甲基苯酚、乙基香草醛、甲基香草酸酯、三甲氧基苯酚等酚类化合物。从现有的研究来看，许多天然介体的催化降解效果与人工合成介体相当，甚至优于合成介体。因此，近年来，国内外许多学者已经开始从多种途径寻找漆酶催化天然介体。
[0004]蒸汽爆破预处理是目前应用较广泛的木质纤维素预处理技术。研究发现，在汽爆的汽相蒸煮作用下，木质素会发生软化和部分降解，不仅发生了酯键的断裂，同时还伴随着愈创木基断裂，从而产生酚酸、醇、醛等物质，如酚类化合物(邻苯二酚);醇类化合物(2-羟基苯乙醇)；酮类化合物(4-(4-甲氧酚基)-2_ 丁酮)；醛类化合物(4-羟基苯甲醛、香草醛和紫丁香醛等)；酸类化合物(4-甲氧基苯乙酸、4-羟基苯甲酸、4-羟基苯乙酸、香草酸、3-甲氧基-4羟基苯乙酸、紫丁香酸和4-羟基苯乙烯酸)等。这些天然漆酶催化介体最本质的催化机理是漆酶催化酚类底物产生的苯氧自由基(Ph0.)电子之间的传递，该自由基具有和合成介体催化产生的氮氧自由基(ΝΝ-0.)类似的作用。
[0005]虽然已有关于从木质纤维素原料获得天然介体的方法，但都是通过复杂的提取纯化过程得到单一的酚类物质，与漆酶构建成漆酶/介体体系。这种方法的问题在于由于水解液中酚类物质的含量通常都较低，且物质组成复杂，造成单一酚类物质的分离很困难，纯化成本较高。因此，得到的天然介体在成本上并无优势。而实际上，最近的研究还表明不同介体组成的“鸡尾酒”混合物比单个介体更能提高漆酶氧化的能力，在多种介体同时存在时，可以显著地加快底物的氧化，并伴随着电子从一种底物到另一个底物自由基的转移，从而通过漆酶和这些介体之间连续的电子传递提高催化效率。因此，本发明提出从木质纤维原料预处理水解液中获得漆酶介体。
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【发明内容】
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[0006]【发明目的】
[0007]本发明的目的在于针对现有漆酶介体成本高的问题，提供一种从木质纤维素原料汽爆水解液中分离漆酶天然介体的方法，以期充分利用木质纤维素原料水解液中多种天然介体共存的特点，克服现有方法中天然介体分离纯化成本高、单一介体催化效率低的问题，通过构建“漆酶/天然介体鸡尾酒”催化体系，提高漆酶催化效率。
[0008]【发明构思】
[0009]木质纤维素原料预处理水解液是极复杂的有机类聚物混合体，包含了来自半纤维素、木质素等的降解产物，如糖类、小分子酚类、有机酸类、呋喃类等物质。其中的小分子酚类物质虽然可以作为漆酶潜在的天然介体，但是存在着浓度低、种类多的特点。现有报道的从木质纤维素原料获得天然介体的方法，都是针对单一酚类介体分离的，因此存在着分离难度大、纯化成本高等问题。本发明将木质纤维素预处理水解液看作是多种酚类天然介体共存的复杂体系，根据这些酚类物质的分子量差异和极性差异，选择适宜的方法通过分级分离得到具有相似性质的一类酚类物质。进而通过构建漆酶/天然介体“鸡尾酒”催化体系，实现降低介体分离纯化成本，提高漆酶/介体体系的催化效率的目的。
[0010]【本发明的技术方案】
[0011]本发明所述的一种从木质纤维素原料汽爆水解液中获得漆酶天然介体的方法，包括如下步骤:
[0012](I)木质纤维素原料汽爆预处理:原料切至约3-5cm，并以去离子水水洗3边去除泥土和灰尘等。切短的原料与水按照固液比1: 0.5?1: 2 (W / W)混合，放入汽爆罐，在1.0?
2.0MPa压力下维压2?I Omin进行蒸汽爆破处理；
[0013](2)汽爆预处理水洗液的制备:上述得到的汽爆预处理原料加入蒸馏水浸泡进行水洗，重复水洗三次，合并水洗液，调节最终汽爆原料干重与水洗液的固液比为1:5?1: 15(W/W)，水洗液离心去除固体杂质，得到汽爆预处理水洗液；
[0014](3)水洗液膜过滤分级分离:步骤(2)中得到水洗液以膜过滤装置，按照不同分子量进行分级分离，分别得到膜截留组分和膜过滤组分；
[0015](4)膜过滤组分有机溶剂连续萃取分级分离:步骤(3)中得到的膜分级分离组分，分别按照有机溶剂极性的大小依次进行萃取，即得到富含酚类物质的漆酶天然介体。
[0016]本发明中步骤(I)所述的木质纤维素原料包括:玉米秸杆、麦杆、稻杆、木材、林地荒草。
[0017]本发明中步骤(3)所述的过滤膜分子量范围500?5000Da;
[0018]本发明中步骤(4)所述的有机溶剂包括:石油醚(0.0I)、正己烷(0.06)、甲苯(2.4)、乙醚(2.9)、二氯甲烷(3.4)、乙酸乙酯(4.3)、氯仿(4.4)。
[0019]【本发明的优点】
[0020]本发明具有如下优点:
[0021]1、针对木质纤维素原料汽爆预处理水洗液中酚类物质含量较低，且物质组成复杂，克服现有从水解液中获得单一漆酶天然介体存在的分离难度大，纯化成本高的问题，从水洗液分子量和极性差异出发，提出膜分离和有机溶剂连续萃取相结合的漆酶天然介体“鸡尾酒”混合物分离方法，从而有助于降低从汽爆水洗液中分离天然漆酶介体的成本，并显著提高漆酶介体体系的催化效率。
[0022]2、本发明将木质纤维素原料汽爆预处理水洗液视作资源，而非废弃物，实现其绿色资源化利用。
【具体实施方法】
[0023]实施例1
[0024](I)木质纤维素原料汽爆预处理:原料切至约3-5cm，并以去离子水水洗3边去除泥土和灰尘等。切短的原料与水按照固液比1:0.5(W/W)混合，放入汽爆罐，在1.0MPa压力下维压2min进行蒸汽爆破处理；
[0025](2)汽爆预处理水洗液的制备:上述得到的汽爆预处理原料加入蒸馏水浸泡进行水洗，重复水洗三次，合并水洗液，调节最终汽爆原料干重与水洗液的固液比为I:5(ff/ff)，水洗液离心去除固体杂质，得到汽爆预处理水洗液；
[0026](3)水洗液膜过滤分级分离:步骤(2)中得到水洗液以膜过滤装置，选取膜的分子量为500Da，分别收集膜截留组分和膜过滤组分；
[0027](4)膜过滤组分有机溶剂连续萃取分级分离:步骤(3)中得到的膜分级分离组分，分别以石油醚(0.01，极性参数，后同)、甲苯(2.4)、二氯甲烷(3.4)、乙酸乙酯(4.3)依次进行萃取，最终得到乙酸乙酯萃取物即为漆酶天然介体。
[0028]实施例2
[0029](I)木质纤维素原料汽爆预处理:原