异环磷酰胺的药物组合物及其在生物医药中的应用
【专利摘要】本发明公开了异环磷酰胺的药物组合物及其在生物医药中的应用，本发明提供的异环磷酰胺的药物组合物中含有异环磷酰胺和一种结构新颖的天然产物化合物(Ⅰ)，异环磷酰胺、化合物(Ⅰ)单独作用时，对男性不育症具有治疗作用；异环磷酰胺和化合物(Ⅰ)联合作用时，治疗效果进一步提高，可开发成治疗男性不育症的药物，与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。
【专利说明】
异环磷酰胺的药物组合物及其在生物医药中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及异环磷酰胺的新用途，具体涉及异环磷酰胺的药 物组合物及其在生物医药中的应用。
【背景技术】
[0002] 异环磷酰胺与环磷酰胺不同，有一个氯乙基连接恶唑磷酰胺环上，此一结构的差 异使其理化性质改变，如异环磷酰胺的溶解度增加，使代谢活性亦增强。异环磷酰胺的活化 过程主要是第4位碳的水解，4-羟基异环磷酰胺自动形成醛异环磷酰胺，后者分解成磷酰胺 氮芥及丙烯醛。异环磷酰胺的细胞毒作用是与DNA发生交叉联结。异环磷酰胺是细胞周期非 特异性药物。给予异环磷酰胺后，细胞周期示G2+M比例增加，使细胞经过G2期延迟。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种异环磷酰胺的药物组合物，该药物组合物中含有异环 磷酰胺和一种结构新颖的天然产物，异环磷酰胺和该天然产物可协同治疗男性不育症。
[0004] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0005] 一种具有下述结构式的化合物（I)，
[0007] -种异环磷酰胺的药物组合物，包括异环磷酰胺、如权利要求1所述的化合物（I) 和药学上可以接受的载体，制备成需要的剂型。
[0008] 进一步地，药学上可以接受的载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、 崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂。
[0009] 进一步地，所述剂型包括片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、 膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
[0010] 上述化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将肉豆蔻粉碎，用60~70%乙 醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃 取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中正丁醇萃取物 用大孔树脂除杂，先用1 〇 %乙醇洗脱12个柱体积，再用70 %乙醇洗脱15个柱体积，收集70 % 洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70%乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶 分离，依次用体积比为50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d) 步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为10:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇 梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积 百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集7~13个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到 化合物(I)。
[0011]进一步地，化合物（I)的制备方法中，步骤(a)用65%乙醇热回流提取，合并提取 液。
[0012]进一步地，化合物（I)的制备方法中，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0013]进一步地，化合物（I)的制备方法中，步骤(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯进行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0014] 上述化合物(I)在制备治疗男性不育症的药物中的应用。
[0015] 上述异环磷酰胺的药物组合物在制备治疗男性不育症的药物中的应用。
[0016] 本发明的优点：
[0017] 本发明提供的异环磷酰胺的药物组合物中含有异环磷酰胺和一种结构新颖的天 然产物，异环磷酰胺和该天然产物单独作用时，具有治疗男性不育症作用；二者联合作用 时，治疗男性不育症效果进一步提高，可以开发成治疗男性不育症的药物。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。
[0019] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0020]分离方法：（a)将肉豆蔻(2kg)粉碎，用65%乙醇热回流提取(20LX 3次），合并提取 液，浓缩至无醇味（4L)，依次用石油醚(4L X 3次）、乙酸乙酯（4L X 3次）和水饱和的正丁醇 (4LX3次）萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中 正丁醇萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱12个柱体积，再用70%乙醇洗脱 15个柱体积，收集70 %洗脱液，减压浓缩得70 %乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70 %乙醇洗 脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为50:1 (8个柱体积）、25:1 (8个柱体积）、15:1 (8个 柱体积)和5:1(10个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步骤(c)中组分4 用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为10:1(8个柱体积）、5:1(10个柱体积)和2:1(5个柱 体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的 反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的甲醇水溶液等度洗脱，收集7~13个柱体积洗脱 液，洗脱液减压浓缩得到化合物(I)(纯度大于98% )。
[0021] 结构确证:册431-]\^显示[]\?^]+为111/2 345.2432，结合核磁特征可得分子式为 C20H34〇3，不饱和度为4。核磁共振氢谱数据δΗ(ρρπι，DMS〇-d 6，500MHz):H-Ια(〇 · 84，m)，Η-1β (1.52，m)，H-2a(1.56，m)，H-20(1.29，m)，H-3a(l.〇〇，m)，H-30(1.17，m)，H-5a(〇.82，m)，H-6 a(4.31，br，d，J = 2.3)，H-7a(1.48，m)，H-70(1.83，br，d，J=13.8)，H-9a(l.〇l，m)，H-lla (1.51，m)，H-110(1.36，m)，H-12a(1.97，m)，H-120(1.91，m)，H-140(3.12，dd，J=5.O,3.6)， H-15a(2.54，dd，J = 7.0,3.6)，H-15b(2.66，dd，J = 7.0,5.0)，H-16a(5.31，s)，H-16b(5.20， 8)，!1-17(1.27,8)，!1-18(0.87,8)，!1-19(1.06,8)，!1-20(1.05,8);核磁共振碳谱数据6 0 (ppm，DMS0-d6，125MHz):41.2(CH2,卜C)，18·1(CH2,2-C)，43.5(CH 2,3-C)，32.8(C，4-C)， 56.4(CH，5-C)，67.7(CH，6-C)，50.3(CH2,7-C)，72.8(C，8-C)，61.6(CH，9-C)，38.6(C，10-C)，17.4(CH2，11-C)，38.8(CH2，12-C)，149.3(C，13-C)，59.9(CH，14-C)，49.1(CH2，15-C)， 113.1(CH2，16-C)，25.1(CH3，17-C)，32.5(CH3，18-C)，22.7(CH3，19-C)，16.1(CH 3,20-C)。红 外光谱表明该化合物含有羟基(3432cm-4和环氧基团（1273和867cm-4 ,Η-NMR谱显示了四 个甲基信号[3!11.27(3!1，8，]\^-17)，0.87(3!1，8，]\^-18)，1.06(3!1，8，]\^-19)和1.05(3!1，8， 1〇-20)]，一个含氧亚甲基质子信号[5!12.54(1!1，(1(1，1 = 7.0,3.6抱，!1-153)和2.66(1!1，(1(1，了 = 7.0,5.0Hz，H-15b)]，一个末端双键质子信号[δH5·31(lH，s，H-16a)和5·20(lH，s，H-l6b)]，两个含氧次甲基质子信号[δH4.31(lH，br，d，J=2.3H Z，H-6α)和3.12(lH，dd，J= 5.0,3.6抱，!1-1你）]。此外，13(：-匪1?谱显示出20个碳信号，包括四个甲基，八个亚甲基(一个 含氧亚甲基和一个烯属亚甲基），四个次甲基(两个含氧次甲基），以及四个季碳(一个烯烃 季碳，一个含氧季碳）谱中，H_5a和H_7a与C-6，以及H-6与C-8和C-10之间的相关性表 明C-6位连有一个羟基。通过H-6的耦合常数(J = 2.3Hz)，可知C-6位的羟基为β构型。NOESY 谱中，Η-6与Η-5和H-7ax的相关性验证了上述推论。末端双键质子信号[δΗ5.31(1Η，8，Η-16a)和 5.20(lH，s，H-16b)]以及碳信号 RC149.3(C-13)和113.1(C-16)]表明该化合物含有 一个两取代双键。此外，次甲基碳(SC59.9)和末端亚甲基〇C49.1)信号以及氢质子信号[δ H3.12(lH，dd，J = 5.O,3.6Hz，H-140)，2.54(lH，dd，J = 7.O,3.6Hz，H-15aWP2.66(lH，dd，J =7.0，5. OHz，H-l5b)]表明了 14，15-环氧结构的存在。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱， 以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD 试验确定，理论值与实验值基本一致。
[0022]该化合物化学式及碳原子编号如下：
〇
[0024] 实施例2:药理作用
[0025]本实施例使用雷公藤多苷建立生殖系统损害大鼠模型，观察药物对不育大鼠模型 内分泌及生殖器官作用的影响。
[0026] 1、材料与方法
[0027] 1.1动物
[0028] Wistar雄性成年大鼠（山东大学实验动物中心提供），2.5个月，体质量190-220g， 自由摄食全价饲料、饮水，驯养1周后使用。
[0029] 1.2试剂与样品
[0030] 异环磷酰胺购自中国药品生物制品检定所。化合物（I)自制，制备方法见实施例1。 黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、睾酮(T)激素放免测定试剂盒（中美天津九鼎医学生物 工程有限公司）；皮质醇放免测定试剂盒(北京北方放免试剂研究所）；雷公藤多苷(黄石飞 云制药有限公司）；细胞培养液(DMEM，上海杰美基因医药科技有限公司）。
[0031] 1.3仪器
[0032]低温冰箱(MDF-U332SANY0,日本）；图像分析系统（TD3000,北京天地科技有限公 司）；组织切片机(RM-2016,徕卡，德国）；机械分析天平(TG328A，上海天平仪器厂）；放射免 疫γ_θ计数器(GC1200,中国科技大学中加光电仪器公司）；PEMS3.1统计软件包。
[0033] 1.4大鼠分组及模型制备
[0034] 68只Wistar大鼠留取20只分为2组健康组，分别供模型评价及药物研究健康对照 使用，48只随机平均分为4组供造模使用。6组大鼠体质量分布无显著性差异(P>0.05)。采用 雷公藤多苷（以下简称GTW)灌胃造模，剂量25mg · kg"1 · cf1，共30cLGTW临用前混悬于0.5% 羧甲基纤维素(CMC)中。大鼠每周统计体质量调整给药量。末次给药GTW24h后，4组造模大鼠 中每组随机抽取2只，与健康组对比评价造模效果，组织学观察见明显不同为造模成功纳入 实验。4组模型大鼠分为模型对照组、异环磷酰胺组(80mg · kg<)、化合物（I)组(80mg · kg 4)、异环磷酰胺与化合物（I)组合物组【40mg · kg^1异环磷酰胺+40mg · kg^1化合物（I)】。分 别将药物混悬于2.5ml浓度0.5 % CMC中，1次/d，灌胃饲服，连续用药30d。每周统计体质量1 次，调整给药剂量。模型对照组及健康组，1次/d，给予2.5ml浓度0.5 % CMC混悬液灌胃，连续 30d〇
[0035] 1.5实验材料的制备
[0036] 末次给药24h后大鼠称质量，颈椎脱白法处死，迅速分离睾丸、附睾、精囊腺、前列 腺，摘除脂肪组织，分析天平称质量。剪开股动脉取血，移入肝素抗凝试管30min内离心 (3000r/min，10min)，分离血清，检查血清激素。
[0037] 1.6大鼠血清激素测定
[0038] 取大鼠血清，按试剂盒说明书操作，放免法测定大鼠血清黄体生成素(LH)、卵泡刺 激素(FSH)、睾酮(T)、皮质醇（cortisol，Co) 〇
[0039] 1.7统计学方法
[0040] 计量资料均数比较采用t检验，计数资料率比较采用X2检验，等级计数资料采用 Ridit分析。采用PEMS 3.1医学统计软件包统计处理。
[0041 ] 2、实验结果
[0042] 2.1对大鼠血清激素的影响
[0043]与健康对照组比，模型对照组大鼠血清FSH、LH、T及Co含量都显著降低(P〈0.01)说 明造模成功;与模型对照组比，异环磷酰胺与化合物（I)组合物组大鼠血清FSH、LH、T及Co含 量都显著升高(P〈〇.01);与模型对照组比，异环磷酰胺组和化合物（I)组大鼠血清FSH、LH、T 及Co含量都升高(P〈0.05)。结果见表1。
[0044] 表1对大鼠血清FSH、LH、T及Co含量的影响(η = 10，无土s)
[0046] 睾丸曲细精管是精子发生基础，约占睾丸总体积98%，睾丸质量反映睾丸曲细精 管质量。附睾分泌的唾液酸、肉毒碱、甘油磷酸胆碱与精子成熟、获能密切相关，测量大鼠附 睾腺壁管厚度可提示附睾上皮修复及损伤情况，了解附睾分泌功能。前列腺特异性抗原 (PSA)、ACP由前列腺腺管上皮细胞分泌进入精液，主要生理作用是裂解精液凝固物质中的 SemenogelinI、Π ，精衆PSA水平与精子活率呈显著正相关。精囊腺分泌果糖(fructose)是 精子能量主要来源。血清生殖激素反映丘脑-垂体-性腺轴功能。FSH主要作用睾丸曲细精 管;LH作用睾丸间质细胞，对精子生成有影响;T促进生殖器官发育与生精细胞分化，刺激精 子生成与成熟。模型对照组LH、FSH、T均较健康组、药物组降低。血中T浓度降低，说明睾丸间 质细胞功能受到影响。一般认为血中T浓度降低可通过下丘脑-垂体-性腺轴反馈调节作用 引起LH和FSH增高，但本研究所测模型对照组LH和FSH均明显降低，给药组LH、FSH、T均明显 升高，与健康组比较无明显差异。
[0047] 结果表明，异环磷酰胺、化合物（I)单独作用时，对男性不育症具有治疗作用；异环 磷酰胺和化合物(I)联合作用时，治疗效果进一步提高，可开发成治疗男性不育症的药物。
[0048] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种具有下述结构式的化合物α)，2. -种异环磷酰胺的药物组合物，其特征在于:包括异环磷酰胺、如权利要求1所述的 化合物(I)和药学上可以接受的载体，制备成需要的剂型。3. 根据权利要求2所述的异环磷酰胺的药物组合物，其特征在于:药学上可以接受的载 体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载 体或润滑剂。4. 根据权利要求2所述的异环磷酰胺的药物组合物，其特征在于:所述剂型包括片剂、 胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射 剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。5. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于，包含以下操作步骤：（a)将肉 豆蔻粉碎，用60~70%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙 酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b) 步骤(a)中正丁醇萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱12个柱体积，再用70%乙醇洗 脱15个柱体积，收集70 %洗脱液，减压浓缩得70 %乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70 %乙醇 洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脱得到4个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为10:1、5:1 和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的 反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的甲醇水溶液等度洗脱，收集7~13个柱体积洗脱 液，洗脱液减压浓缩得到化合物(I)。6. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)用65%乙醇热回 流提取，合并提取液。7. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。8. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)中用二氯甲烷代 替乙酸乙酯进行萃取，得到二氯甲烷萃取物。9. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗男性不育症的药物中的应用。10. 权利要求2~4任一所述的异环磷酰胺的药物组合物在制备治疗男性不育症的药物 中的应用。
【文档编号】A61K31/336GK105949150SQ201610335177
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】蒋灵锟
【申请人】蒋灵锟