生长相关蛋白grp3在调控植物生长中的应用
【专利摘要】本发明公开了生长相关蛋白GRP3在调控植物生长中的应用。本发明所提供的生长相关蛋白GRP3为a)或b)：a)氨基酸序列是序列表中序列5的蛋白质；b)将序列表中序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同蛋白功能的蛋白质。实验证明，生长相关蛋白GRP3及其编码基因能促进植物的营养生长和生殖生长，可以利用生长相关蛋白GRP3及其编码基因调控植物的营养生长和生殖生长或培育转基因植物。
【专利说明】
生长相关蛋白GRP3在调控植物生长中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域中生长相关蛋白GRP3在调控植物生长中的应用。
【背景技术】
[0002] 倒伏问题和光周期反应敏感一直是困扰植物高产稳产的主要问题。倒伏发生在植 物的生殖生长时减产率会更高。不同纬度地区间引种会因日照长度的变化导致植物的开花 期、成熟期提前或延迟，均会造成植物的产量下降。因此，迫切需要采用分子育种手段，通过 外源基因的引入或对内在基因的遗传操作，定向调节植物的株型和光周期反应敏感性，加 快抗倒伏和广适应植物的选育进程。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是如何促进植物的生长。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了名称为GRP3的蛋白质。
[0005] 本发明所提供的GRP3为如下a)或b)的蛋白质：
[0006] a)氨基酸序列是序列表中序列5的蛋白质；
[0007] b)将序列表中序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加得到的与植物生长相关的蛋白质。
[0008] 其中，序列5由474个氨基酸组成。
[0009] 为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列5所示的蛋白质的氨基末端或 羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0010] 表1、标签的序列
[0011]
[0012] 上述b)中的GRP3可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上 述b)中的GRP3的编码基因可通过将序列表中序列6所示的DNA序列中缺失一个或几个 氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或 3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0013] 为解决上述技术问题，本发明还提供了与GRP3相关的生物材料。
[0014] 本发明所提供的与GRP3相关的生物材料，为下述A1)至A20)中的任一种：
[0015] A1)编码所述GRP3的核酸分子；
[0016] A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
[0017] A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
[0018] A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
[0019] A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
[0020] A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
[0021] A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
[0022] A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
[0023] A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0024] A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0025] All)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0026] A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0027] A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；
[0028] A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
[0029] A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
[0030] A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
[0031] A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；
[0032] A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
[0033] A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
[0034] A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
[0035] 上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下al)或a2)或a3)所示的基因：
[0036] al)核苷酸序列是序列表中序列6的cDNA分子或DNA分子；
[0037] a2)与al)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一'丨生，且编码氨基酸序列为 序列5的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
[0038] a3)在严格条件下与al)限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为序列5的蛋 白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
[0039] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也 可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0040] 其中，序列6由1425个核苷酸组成，编码序列5所示的氨基酸序列。
[0041] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码GRP3的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分 离得到的GRP3的核苷酸序列55%或者更高同一性的核苷酸，只要编码GRP3且具有GRP3功 能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0042] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的编码序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75%或更高，或85% 或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机 软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％)表示， 其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0043] 上述生物材料中，所述严格条件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下杂交 并洗膜2次，每次5min，又于0. 5 X SSC，0. 1 % SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每 次15min ;或，0· 1XSSPE (或0· 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
[0044] 上述75%或75%以上同一性，可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0045] 上述生物材料中，B2)所述的含有编码GRP3的核酸分子的表达盒（GRP3基因表 达盒），是指能够在宿主细胞中表达GRP3的DNA，该DNA不但可包括启动GRP3基因转录 的启动子，还可包括终止GRP3基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子 序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启 动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子 35S :来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶（"LAP"，Chao等人（1999) Plant Physiol 120:979-992);来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸 和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯）诱导）；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子（PIN2) 或LAP启动子（均可用茉莉酮酸甲酯诱导）；热休克启动子（美国专利5,187,267);四环 素诱导型启动子（美国专利5,057, 422);种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子 pF128 (CN101063139B (中国专利200710099169. 7))，种子贮存蛋白质特异的启动子（例如， 菜豆球蛋白、napin，oleosin 和大豆 beta conglycin 的启动子（Beachy 等人（1985)EMB0 J.4 :3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参 考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子（N0S 终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸 和章鱼氨酸合酶终止子（参见，例如：0dell等人（I985)Nature 313:810 ;Rosenberg等人 (1987)Gene，56:125;Guerineau 等人（1991)Mol. Gen. Genet, 262:141 ;Proudfoot(1991) Cell, 64:671 ;Sanfacon 等人 Genes Dev.，5:141 ;Mogen 等人（1990)Plant Cell, 2:1261 ; Munroe 等人（1990)Gene, 91:151 ;Ballad 等人（1989)Nucleic Acids Res. 17:7891 ;Joshi 等人（1987)Nucleic Acid Res. ,15:9627)。
[0046] 可用现有的表达载体构建含有所述GRP3基因表达盒的重组载体。所述植物 表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如PAHC25、pBin438、 PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA139卜Xa 或 pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的Υ端非翻译 区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷 酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导（Ti)质粒基因（如 胭脂碱合成酶基因 Nos)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3'端转录的非翻译区均具有类 似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录 增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码 序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源 是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基 因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工， 如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光 素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因，赋 予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲 喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如 抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全 性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0047] 上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
[0048] 上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
[0049] 上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均 不包括繁殖材料。
[0050] 在本发明的一个实施方式中，GRP3的编码基因（即序列6所示的DNA分子）通过 含有GRP3的编码基因的表达盒的重组载体导入根癌农杆菌GV3101中。所述重组载体为用 序列6所示的DNA分子替换pTFlOl. 1-GFP的Xbal I和Sac I识别序列间的片段得到的重 组载体 pTFlOl. l-GRP3，pTF101. 1-GRP3 表达序列 5 所示的 GRP3 蛋白。所述 pTFlOl. 1-GRP3 与pTFlOl. 1-GFP的差别仅在于将pTFlOl. 1-GFP的Xbal I和Sac I识别序列间的DNA替 换为序列6所示的DNA分子。
[0051] 为解决上述技术问题，本发明还提供了所述蛋白质、或所述生物材料在调控植物 生长中的应用。
[0052] 上述应用中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为十字 花科植物，如拟南芥（Arabidopsis thaliana)。
[0053] 为解决上述技术问题，本发明还提供了 一种培育生长增加的转基因植物的方法。
[0054] 本发明所提供的一种培育生长增加的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入 所述GRP3的编码基因得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比生长 增加。
[0055] 上述培育生长增加的转基因植物的方法中，所述GRP3的编码基因的编码序列是 序列表中序列6的DNA分子。
[0056] 上述培育生长增加的转基因植物的方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植 物。所述双子叶植物可为十字花科植物，如拟南芥（Arabidopsis thaliana)。
[0057] 在本发明的实施例中，所述GRP3的编码基因（即序列6所示的DNA分子）通过含 有GRP3基因表达盒的GRP3基因重组表达载体导入目的植物中。
[0058] 上述培育生长增加的转基因植物的方法中，其中所述GRP3基因可先进行如下修 饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：
[0059] 1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所 偏爱的密码子，在保持本发明所述GRP3基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植 物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实 现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35%、多于45%、多于50%或多于约 60% ；
[0060] 2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中 已知的有效的序列进行修饰；
[0061] 3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括 组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的 选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性 表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多 启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于 双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
[0062] 4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于 CaMV的tml，来源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发 明基因进行连接；
[0063] 5)引入增强子序列，如内含子序列（例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序 列（例如来源于TMV, MCMV和AMV)。
[0064] 所述GRP3基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转 化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞（Weissbach, 1998, Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press, New York, pp. 411-463 ；Geiserson and Corey，1998,Plant Molecular Biology (2nd Edition)·)。
[0065] 上述培育生长增加的转基因植物的方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所 述GRP3基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可 以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种， 特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
[0066] 为解决上述技术问题，本发明还提供了扩增编码所述GRP3的核酸分子全长或其 片段的引物对。
[0067] 本发明中，所述生长具体可为营养生长和/或生殖生长。所述营养生长可为根系 的生长、茎的生长、叶的生长和/或果荚的生长。所述根系的生长具体可体现在根长和/或 侧根数量上，所述茎的生长具体可体现在株高上，果荚的生长具体可体现在果荚的长度上。 所述植物为种子植物，所述生殖生长可体现在开花时间和/或果荚的长度上。
[0068] 在本发明的一个实施例中，所述调控植物生长为促进拟南芥生长。所述植物生长 体现在所述植物株高的增加、所述植物总根长的增加、和/或所述植物侧根数目的增加、所 述植物开花时间的缩短、所述植物果荚长度的增加。
[0069] 实验证明，本发明的生长相关蛋白GRP3及其编码基因能促进植物的营养生长：转 GRP3基因植株的株高为受体植株的8. 69倍，总根长为受体植株的2. 67倍，侧根数目为受 体植株的2. 33倍。本发明的生长相关蛋白GRP3及其编码基因能促进植物的生殖生长：转 GRP3基因植株的开花时间为受体植株的0. 69倍，果荚长度为受体植株的4. 09倍。实验证 明，可以利用本发明的生长相关蛋白GRP3及其编码基因调控植物的营养生长和生殖生长 或培育转基因植物。
【附图说明】
[0070] 图 1 为重组载体 pTFlOl. 1-GRP1、pTFlOl. 1-GRP2、pTFlOl. 1-GRP3 和 pTFlOl. 1-GRP4示意图。其中，图A为重组载体pTFlOl. 1-GRP1示意图，图B为重组载 体pTFlOl. 1-GRP2示意图，图C为重组载体pTFlOl. 1-GRP3示意图，图D为重组载体 pTFlOl. 1-GRP4 示意图。
[0071] 图2为转基因拟南芥植株在基因组水平上的鉴定结果。其中，图A为转GRP1基 因拟南芥植株中GRP1基因的鉴定结果，泳道Μ为Direct-load? Star Marker Plus (D2000 Plus) (M121)的DNA分子量标准，泳道1为水，泳道2为拟南芥cpd，泳道3-5为T3代转 GRP1基因拟南芥植株的三个株系；图Β为转GRP2基因拟南芥植株中GRP2基因的鉴定结果， 泳道 Μ 为 Direct-load? Star Marker Plus (D2000 Plus) (Μ121)的 DNA 分子量标准，泳道 1为水，泳道2为拟南芥cpd，泳道3和4为T3代转GRP2基因转基因植株的两个株系；图C 为转GRP3基因拟南芥植株中GRP3基因的鉴定结果，泳道Μ为Direct-load? Star Marker Plus (D2000 Plus) (M121)的DNA分子量标准，泳道1为水，泳道2为拟南芥cpd，泳道3-5 为T3代转GRP3基因拟南芥植株的三个株系；图D为转GRP4基因拟南芥植株中GRP4基因 的鉴定结果，泳道 Μ 为 Direct-load? Star Marker Plus (D2000 Plus) (Μ121)的 DNA 分子 量标准，泳道1为水，泳道2为拟南芥cpd，泳道3-5为T3代转GRP4基因拟南芥植株的三个 株系。
[0072] 图3为利用半定量PCR鉴定转基因拟南芥植株中的目的基因的表达。其中，图A 为转GRP1基因拟南芥植株中GRP1基因的表达检测结果，从左至右的泳道依次为水，拟南芥 cpd，T3代转GRP1基因拟南芥植株；图B为转GRP2基因拟南芥植株中GRP2基因的表达检测 结果，从左至右的泳道依次为水，拟南芥cpd，Τ 3代转GRP2基因拟南芥植株；图C为转GRP3 基因拟南芥植株中GRP3基因的表达检测结果，从左至右的泳道依次为水，拟南芥cpd，1~ 3代 转GRP3基因拟南芥植株；图D为转GRP4基因拟南芥植株中GRP4基因的表达检测结果，从 左至右的泳道依次为水，拟南芥cpd，T 3代转GRP4基因拟南芥植株。
[0073] 图4为转基因拟南芥植株的表型检测结果。其中，Α为转GRP1基因拟南芥植株的 表型，B为转GRP2基因拟南芥植株的表型，C为转GRP3基因拟南芥植株的表型，D为转GRP4 基因拟南芥植株的表型。
【具体实施方式】
[0074] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为 常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0075] 下述实施例中的载体pTFlOl. 1为美国爱荷华州立大学王侃实验室馈赠 ，（Margie M. Paz,Juan Carlos Martinezm, Andrea B.Kalvig, Tina M.Fonger, Kan Wang. (2006) Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation. Plant Cell Reports. Plant Cell Reports 25:206-213)，公众可从中国农业科学院作物科学研 究所（即
【申请人】）获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使 用。
[0076] 下述实施例中的拟南芥cpd突变体（Szekeres M，Nemeth K，KonczKalman Z，Mathur J，Kauschmann A，et al. (1996)Brassinosteroids rescue the deficiency of CYP90, a cytochrome P450, controlling cell elongation and de-etiolation in arabidopsis. Cell 85:171-182.)公众可从中国农业科学院作物科学研究所（即
【申请人】） 获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。拟南芥cpd突 变体以下简称拟南芥cpd。
[0077] 实施例1、利用生长相关蛋白基因培育生长增加的转基因拟南芥植物
[0078] 本实施例提供了四个来源于大豆 Williams 82 (Haun，W. J.，Hyten，D. L.，Xu，W. ff. , Gerhardt, D. J. , Albert, T. J. , Richmond, T. , Jeddeloh, J. A. , Jia, G. F. , Springer, N. M. , Vance, C. P. &Stupar,R.M. (2011). The Composition and Origins of Genomic Variation among Individuals of the Soybean Reference Cultivar Williams 82. Plant Physiology 155,645-655.国家种质库编号：I2A12645,统一编号：WDD00587)的生长相关 蛋白基因，分别是生长相关蛋白GRP1基因、生长相关蛋白GRP2基因、生长相关蛋白GRP3基 因和生长相关蛋白GRP4基因。
[0079] 制备序列表中序列2所不的DNA分子（即生长相关蛋白GRP1基因，简称GRP1基 因），序列2所示的DNA分子编码序列1所示的蛋白质（即生长相关蛋白GRP1，简称GRP1 蛋白）。
[0080] 制备序列表中序列4所不的DNA分子（即生长相关蛋白GRP2基因，简称GRP2基 因），序列4所不的DNA分子编码序列3所不的蛋白质（即生长相关蛋白GRP2,简称GRP2 蛋白）。
[0081] 制备序列表中序列6所不的DNA分子（即生长相关蛋白GRP3基因，fg]称GRP3基 因），序列6所不的DNA分子编码序列5所不的蛋白质（即生长相关蛋白GRP3,简称GRP3 蛋白）。
[0082] 制备序列表中序列8所不的DNA分子（即生长相关蛋白GRP4基因，fil]称GRP4基 因），序列8所不的DNA分子编码序列7所不的蛋白质（即生长相关蛋白GRP4,简称GRP4 蛋白）。
[0083] 1、重组载体和重组农杆菌的构建
[0084] 载体pTFlOL 1-GFP的制备：将载体pTFlOL 1的Hind III和EcoR I识别序列 间的片段替换为序列9所示的DNA分子（即GFP表达盒）得到重组载体pTFlOl. 1-GFP， pTFlOL 1-GFP与pTFlOL 1的差别仅在于将pTFlOL 1的Hind III和EcoR I识别序列间的 DNA替换为序列9所示的DNA分子。序列9所示的GFP表达盒中，序列9的第25-859位核 苷酸为35S启动子的序列，序列9的第880-1596位核苷酸为GFP基因的序列，序列9的第 1640-1894位核苷酸为N0S终止子的序列。
[0085] 将pTFlOl. 1-GFP的Xba I和Sac I识别序列间的片段替换为GRP1基因（即序列 2所示的DNA分子）得到重组载体pTFlOL 1-GRP1 (图1中A)，pTFlOL 1-GRP1表达序列1 所示的GRP1 蛋白，pTFlOl. 1-GRP1 与 pTFlOl. 1-GFP 的差别仅在于将pTFlOl. 1-GFP 的 Xba I 和Sac I识别序列间的DNA替换为序列2所示的DNA分子。将重组载体pTFlOl. 1-GRP1导 入根癌农杆菌GV3101 (天根生化科技有限公司产品）中，得到含有重组载体pTFlOl. 1-GRP1 的重组农杆菌 GV3101/pTF101. 1-GRP1。
[0086] 将pTFlOl. 1-GFP的Xba I和Sac I识别序列间的片段替换为GRP2基因（即序列 4所示的DNA分子）得到重组载体pTFlOl. 1-GRP2 (图1中B)，pTFlOl. 1-GRP2表达序列3 所示的GRP2蛋白，pTFlOL 1-GRP2与pTFlOL 1-GFP的差别仅在于将pTFlOL 1-GFP的Xba I和Sac I识别序列间的DNA替换为序列4所示的DNA分子。将重组载体pTFlOl. 1-GRP2 导入根癌农杆菌GV3101中，得到含有重组载体pTFlOl. 1-GRP2的重组农杆菌GV3101/ pTFlOl. 1-GRP2。
[0087] 将pTFlOl. 1-GFP的Xba I和Sac I识别序列间的片段替换为GRP3基因（即序列 6所示的DNA分子）得到重组载体pTFlOL 1-GRP3 (图1中C)，pTFlOL 1-GRP3表达序列5 所示的GRP3蛋白，pTFlOL 1-GRP3与pTFlOL 1-GFP的差别仅在于将pTFlOL 1-GFP的Xba I和Sac I识别序列间的DNA替换为序列6所示的DNA分子。将重组载体pTFlOl. 1-GRP3 导入根癌农杆菌GV3101中，得到含有重组载体pTFlOl. 1-GRP3的重组农杆菌GV3101/ pTFlOl. 1-GRP3。
[0088] 将pTFlOl. 1-GFP的Xba I和Sac I识别序列间的片段替换为GRP4基因（即序列 8所示的DNA分子）得到重组载体pTFlOL 1-GRP4(图1中D)，pTFlOL 1-GRP4表达序列7 所示的GRP4蛋白，pTFlOL 1-GRP4与pTFlOL 1-GFP的差别仅在于将pTFlOL 1-GFP的Xba I和Sac I识别序列间的DNA替换为序列8所示的DNA分子。将重组载体pTFlOl. 1-GRP4 导入根癌农杆菌GV3101中，得到含有重组载体pTFlOl. 1-GRP4的重组农杆菌GV3101/ pTFlOl. 1-GRP4。
[0089] 2、转基因拟南芥的构建
[0090] 将步骤1的重组农杆菌GV3101/pTF101. 1-GRP1接种于含有抗生素的LB培养基 (该含有抗生素的LB培养基为向LB培养基中加入壮观霉素、卡那霉素、氯霉素和利福平得 到的液体培养基，其中，壮观霉素的浓度为50mg/L，卡那霉素的浓度为50mg/L，氯霉素的浓 度为25mg/L，利福平的浓度为20mg/L)上，于28°C下250rpm振荡培养至0D 6。。值为0· 6-0. 8， 收集菌液置于离心管中，于5000rpm下离心5min并收集菌体，用MS液体培养基重悬菌体， 得到 GV3101/pTF101. 1-GRP1 悬浮液，GV3101/pTF101. 1-GRP1 悬浮液的 0D6。。值约为 0. 6,向 GV3101/pTF101. 1-GRP1悬浮液中加入Silwet L-77(北京五洲元业科贸公司产品，货号为 SL77080596)，得到 GV3101/pTF101. 1-GRP1 侵染液。
[0091] 米用沾花浸染法（Clough SJ, Bent AF(1998)Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant Journal 16:735-743.)用 GV3101/pTF101. 1-GRP1 侵染液转化拟南芥 cpd 收获 1\代转 GRP1 基因种子。将代转GRP1基因种子在含Bastar (日本明治公司）的MS培养基（Bastar 在MS培养基中的浓度为10mg/L)上进行筛选，得到?\代转GRP1基因拟南芥幼苗。将T 1 代转GRP1基因拟南芥幼苗在温度为22°C、光周期为16h光照和8h黑暗的长日照人工气候 室中进行培养，得到T 2代转GRP1基因拟南芥种子。将T 2代转GRP1基因拟南芥种子在含 Bastar (日本明治公司）的MS培养基（Bastar在MS培养基中的浓度为10mg/L)上进行筛 选，得到T2代转GRP1基因拟南芥幼苗。将T 2代转GRP1基因拟南芥幼苗在温度为22°C、光 周期为16h光照和8h黑暗的长日照人工气候室中进行培养，得到T 3代转GRP1基因拟南芥 种子。
[0092] 按照上述方法，将上述重组农杆菌GV3101/pTF101. 1-GRP1分别替换为重组农杆 菌 GV3101/pTF101. 1-GRP2、重组农杆菌 GV3101/pTF101. 1-GRP3 和重组农杆菌 GV3101/ pTFlOl. 1-GRP4,其他步骤均不变，分别得到T3代转GRP2基因拟南芥种子、T 3代转GRP3基 因拟南芥种子和Τ3代转GRP4基因拟南芥种子。
[0093] 将Τ3代转GRP1基因拟南芥种子、Τ 3代转GRP2基因拟南芥种子、Τ 3代转GRP3基 因拟南芥种子、Τ3代转GRP4基因拟南芥种子和拟南芥cpd种子播种到培养土中，在温度为 22°C、光周期为16h光照和8h黑暗的长日照人工气候室中进行培养，分别得到T 3代转GRP1 基因拟南芥植株、Τ3代转GRP2基因拟南芥植株、Τ 3代转GRP3基因拟南芥植株、Τ 3代转GRP4 基因拟南芥植株和拟南芥cpd植株。
[0094] 3、转基因拟南芥的鉴定
[0095] 3. 1、在基因组水平上鉴定步骤2的转基因拟南芥植株，具体方法如下：
[0096] 以步骤2的拟南芥cpd植株和水为对照，分别鉴定步骤2的T3代转GRP1基因 拟南芥植株的3个株系（1-1U-2和1-3)、Τ 3代转GRP2基因拟南芥植株2个株系（2-1 和2-2)、T3代转GRP3基因拟南芥植株3个株系（3-1、3-2和3-3)和T 3代转GRP4基因 拟南芥植株3个株系（4-1、4-2和4-3)。鉴定Τ3代转GRP1基因拟南芥植株的引物对为： ATGGCATCTTTCATCATCATACCAC 和 TCATGGCGATTTACTTAGTCTGGAC。鉴定 Τ3代转 GRP2 基因 拟南芥植株的引物对为：ATGGCATCTTTCATCTTCACACCTG 和 TCATGGCGATTTACTTAGTTTGGAC。 鉴定Τ3代转GRP3基因拟南芥植株的引物对为：ATGGCTTCTTTGCCAGCTTTGCCAA和 CTAGTCTCTACGCTGCACAATAATT。鉴定T3代转GRP4基因拟南芥植株的引物对为： ATGGCTTCTTTGCCAACACTTCTCT 和 CTAATGTCTACGCTGCACAATAATA。
[0097] 实验结果见图2,结果表明，步骤2的Τ3代转GRP1基因拟南芥植株三个株系的PCR 产物中均有大小为1437bp的目的条带（图2中Α泳道3、4和5)，而对照中无目的条带（图 2中A泳道1和2)，说明步骤2的T 3代转GRP1基因拟南芥植株中均含有GRP1基因；步骤 2的Τ3代转GRP2基因拟南芥植株的两个株系PCR产物中均有大小为1440bp的目的条带 (图2中B泳道3和4)，而对照中无目的条带（图2中B泳道1和2)，说明步骤2的1~ 3代 转GRP2基因拟南芥植株中均含有GRP2基因；步骤2的T3代转GRP3基因拟南芥植株的三 个株系PCR产物中均有大小为1425bp的目的条带（图2中C泳道3、4和5)，而对照中无目 的条带（图2中C泳道1和2)，说明步骤2的T 3代转GRP3基因拟南芥植株中均含有GRP3 基因；步骤2的Τ3代转GRP4基因拟南芥植株的三个株系PCR产物中均有大小为1419bp的 目的条带（图2中D泳道3、4和5)，而对照中无目的条带（图2中D泳道1和2)，说明步 骤2的T 3代转GRP4基因拟南芥植株中均含有GRP4基因。
[0098] 3. 2、利用半定量PCR鉴定步骤2的转基因拟南芥植株中的目的基因的表达，具体 方法如下：
[0099] 以步骤2的拟南芥cpd植株和水为对照，分别鉴定步骤2的Τ3代转GRP1基因拟南 芥植株株系1-1、Τ 3代转GRP2基因拟南芥植株株系2-1、Τ 3代转GRP3基因拟南芥植株株系 3-1和Τ3代转GRP4基因拟南芥植株株系4-1中目的基因的表达，内参为拟南芥的ACTIN2， 内参的引物为 actctcccgctatgtatgtcgc 和 agaaaccctcgtagattggcac。鉴定 Τ3代转 GRP1 基因拟南芥植株的引物对为：GCATCTTTCATCATCATACCACTCC 和 CAACAAAGGGGAGTCCGAGC。 鉴定T3代转GRP2基因拟南芥植株的引物对为：ATGGCATCTTTCATCTTCACACCTG 和CGAAGGGGAGCCCGAGTGTAC。鉴定T3代转GRP3基因拟南芥植株的引物对为： ATGGCTTCTTTGCCAGCTTTGC 和 CGGCGGAGGAAGAGGAGGAG。鉴定 Τ3代转 GRP4 基因拟南芥植株 的引物对为：ATGGCTTCTTTGCCAACACTTCTCT 和 GAACACGCGGCGGAGGTATAAG。
[0100] 实验结果见图3,结果表明，步骤2的T3代转GRP1基因拟南芥植株株系1-1的PCR 产物中含有目的条带（图3中Α泳道左3)，而对照中无目的条带（图3中Α泳道左1和左 2)，说明步骤2的T3代转GRP1基因拟南芥植株株系1-1中有GRP1基因的表达；步骤2的 Τ3代转GRP2基因拟南芥植株株系2-1的PCR产物中含有目的条带（图3中Β泳道左3)，而 对照中无目的条带（图3中Β泳道左1和左2)，说明步骤2的Τ 3代转GRP2基因拟南芥植 株株系2-1中有GRP2基因的表达；步骤2的Τ3代转GRP3基因拟南芥植株株系3-1的PCR 产物中含有目的条带（图3中C泳道左3)，而对照中无目的条带（图3中C泳道左1和左 2)，说明步骤2的Τ3代转GRP3基因拟南芥植株株系3-1中有GRP3基因的表达；步骤2的 Τ3代转GRP4基因拟南芥植株株系4-1的PCR产物中含有目的条带（图3中D泳道左3)， 而对照中无目的条带（图3中D泳道左1和左2)，说明步骤2的Τ 3代转GRP4基因拟南芥 植株株系4-1中有GRP4基因的表达。
[0101] 4、转基因拟南芥的表型检测
[0102] 实验重复三次，每次重复的具体步骤如下：
[0103] 将步骤2的T3代转GRP1基因拟南芥三个株系的种子播种到培养土中，每个株系 随机选取20株生长至13天的拟南芥植株，对各拟南芥植株的总根长和侧根数目进行统计 得到Τ 3代转GRP1基因拟南芥的总根长和侧根数目统计结果。
[0104] 按照上述方法，将Τ3代转GRP1基因拟南芥三个株系替换为Τ 3代转GRP2基因拟南 芥两个株系、Τ3代转GRP3基因拟南芥三个株系、Τ 3代转GRP4基因拟南芥三个株系和拟南 芥cpd，其他步骤均不变，分别得到Τ3代转GRP2基因拟南芥的总根长和侧根数目统计结果、 Τ3代转GRP3基因拟南芥的总根长和侧根数目统计结果、Τ 3代转GRP4基因拟南芥的总根长 和侧根数目统计结果和拟南芥cpd的总根长和侧根数目统计结果。
[0105] 将步骤2的T3代转GRP1基因拟南芥三个株系的种子播种到培养土中，每个株系随 机选取20株生长至55天的拟南芥植株，对各拟南芥植株的株高和果荚长度进行统计得到 Τ3代转GRP1基因拟南芥的株高和果荚长度统计结果，同时对各个拟南芥植株从萌发到初花 的天数（即开花时间）也进行统计得到Τ 3代转GRP1基因拟南芥的开花时间。
[0106] 按照上述方法，将Τ3代转GRP1基因拟南芥三个株系替换为Τ 3代转GRP2基因拟南 芥两个株系、Τ3代转GRP3基因拟南芥三个株系、Τ 3代转GRP4基因拟南芥三个株系和拟南芥 cpd，其他步骤均不变，分别得到Τ3代转GRP2基因拟南芥的株高、果荚长度和开花时间的统 计结果，Τ 3代转GRP3基因拟南芥的株高、果荚长度和开花时间的统计结果，Τ 3代转GRP4基 因拟南芥的株高、果荚长度和开花时间的统计结果和拟南芥cpd的株高、果荚长度和开花 时间的统计结果。
[0107] T3代转GRP1基因拟南芥植株株系1-1、T 3代转GRP2基因拟南芥植株株系2-1、T 3 代转GRP3基因拟南芥植株株系3-1、Τ3代转GRP4基因拟南芥植株株系4-1和拟南芥cpd植 株的表型如图4所示。T 3代转GRP1基因拟南芥植株、T 3代转GRP2基因拟南芥植株、T 3代 转GRP3基因拟南芥植株、Τ3代转GRP4基因拟南芥植株和拟南芥cpd植株的株高、总根长、 侧根数目、开花时间和果荚长度如表2所示。
[0108] 表2、转基因拟南芥的表型
[0111] 结果表明，生长相关蛋白GRP1、GRP2、GRP3和GRP4及其对应的编码基因均能促进 拟南芥的营养生长：转GRP1基因拟南芥植株的株高为拟南芥cpd的5. 53倍，总根长为拟南 芥cpd的3. 78倍，侧根数目为拟南芥cpd的5. 33倍；转GRP2基因拟南芥植株的株高为拟 南芥cpd的8. 09倍，总根长为拟南芥cpd的3. 18倍，侧根数目为拟南芥cpd的3. 00倍；转 GRP3基因拟南芥植株的株高为拟南芥cpd的8. 69倍，总根长为拟南芥cpd的2. 67倍，侧根 数目为拟南芥cpd的2. 33倍；转GRP4基因拟南芥植株的株高为拟南芥cpd的5. 48倍，总 根长为拟南芥cpd的3. 58倍，侧根数目为拟南芥cpd的4. 00倍。
[0112] 生长相关蛋白GRP1、GRP2、GRP3和GRP4及其对应的编码基因均能促进拟南芥的 生殖生长：转GRP1基因拟南芥植株的开花时间为拟南芥cpd的0. 79倍，果荚长度为拟南芥 cpd的3. 22倍；转GRP2基因拟南芥植株的开花时间为拟南芥cpd的0. 71倍，果荚长度为拟 南芥cpd的4. 04倍；转GRP3基因拟南芥植株的开花时间为为拟南芥cpd的0. 69倍，果荚 长度为拟南芥cpd的4. 09倍；转GRP4基因拟南芥植株的开花时间为为拟南芥cpd的0. 73 倍，果荚长度为拟南芥cpd的4. 04倍。
[0113] 实验证明，生长相关蛋白GRP1、GRP2、GRP3和GRP4及其对应的编码基因均能促进 植物的营养生长和生殖生长，可以利用生长相关蛋白GRP1、GRP2、GRP3和GRP4及其对应的 编码基因调控植物的营养生长和生殖生长或培育转基因植物。
【主权项】
1. 如下a)或b)的蛋白质： a) 氨基酸序列是序列表中序列5的蛋白质； b) 将序列表中序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加得到的与植物生长相关的蛋白质。2. 与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述A1)至A20)中的任一种： A1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子； A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒； A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体； A4)含有A2)所述表达盒的重组载体； A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物； A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物； A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物； A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物； A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系； A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系； All)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系； A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系； A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织； A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织； A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织； A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织； A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官； A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官； A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官； A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。3. 根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下al)或a2) 或a3)所示的基因： al)核苷酸序列是序列表中序列6的cDNA分子或DNA分子； a2)与al)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码氨基酸序列为序列 5的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子； a3)在严格条件下与al)限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为序列5的蛋白质 的cDNA分子或基因组DNA分子。4. 权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在调控植物生长中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。6. -种培育生长增加的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入权利要求1所述蛋 白质的编码基因得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比生长增加。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：权利要求1所述蛋白质的编码基因的编 码序列是序列表中序列6的DNA分子。8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植 物。9. 根据权利要求4或5所述的应用、或权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于： 所述生长为营养生长和/或生殖生长。10. 扩增编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子全长或其片段的引物对。
【文档编号】C07K14/415GK105985420SQ201510050601
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年1月30日
【发明人】王妙, 韩天富, 孙 石, 武婷婷, 吴存祥, 蒋炳军, 侯文胜
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所