神经元星形胶质细胞共培养板的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及细胞培养实验器材，具体地说涉及一种神经元星形胶质细胞共培养板。
【背景技术】
[0002]神经元原代培养是体外研究神经系统疾病的重要手段之一，也是对神经系统损伤进行细胞分子水平研究的基础。建立神经元和星形胶质细胞共培养模型对研究神经系统疾病，特别是星形胶质细胞在神经元发育、损伤和修复中的作用尤为重要。
[0003]目前存在的神经元和星形胶质细胞共培养的装置主要是:传统Banker装置和Transwell小室。传统的Banker法是利用烙铁在盖玻片上滴入四个高度约1_2 mm石錯，SP在盖玻片上安放支持物以建立共培养体系，但该装置不利于盖玻片上的神经元进行下一步实验。刘利等于《中华神经外科疾病研究杂志》2006年04期发表了 “神经元和胶质细胞共培养方法的建立”，公开了一种改进的Banker法，利用烙铁将石錯(0.1 mm)安放在培养板的底面而不是盖玻片上，这样相对更容易建立共培养体系。
[0004]以上两种方法均存在共同的缺陷:1、利用烙铁在培养皿底部滴入石蜡，由于操作人员的关系，每次构建的体系，甚至同一批次的体系都可能会出现较大差异。2、石蜡的熔点较低(47°C -64°C)，且密度(0.9 g/cm3)低于细胞培养基，在共培养体系建立的过程中，势必降低装置的稳定性。3、石蜡溶于汽油、二硫化碳、二甲苯、乙醚、苯、氯仿、四氯化碳、石脑油等非极性溶剂，同时极易溶于细胞实验常用的溶剂二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMS0)，影响共培养体系的微环境。
[0005]Transwell小室的底部滤膜材质为聚苯二甲酸乙二醇酯(polythyleneterephthalate, PET)，膜表面经过钛酸酯偶联剂(titanate coupling agent，TC)处理，改善了细胞的贴壁性；另外，插入式细胞培养皿包含有透明的B1pore膜，可直接透过膜观察细胞。利用插入式培养皿可将星形胶质细胞或神经元接种于可通透性的PET膜上，直径为12 mm和30 mm的插入式细胞培养皿可悬挂于24孔或6孔板上，其原理是将星形胶质细胞和神经元在同一培养基中的两个层面上进行培养，星形胶质细胞和神经元分泌的各种细胞因子和营养物质可以通过插入式培养皿的微孔膜在细胞间进行交换。纯化的星形胶质细胞向培养基中释放大量的神经营养因子以供神经元生长所需，又不会阻碍神经元的生长。插入式培养皿为悬挂式设计，方便移液管操作，而且插入皿会自动归位。但利用Transwell小室进行神经元星形胶质细胞共培养，存在以下问题=(I)Transwell小室中，生长于不同层面的神经元和星形胶质细胞通过滤膜进行对话，不符合实际生理情况。(2)尤其在共培养的短期作用观察中，Transwell小室的滤膜在一定程度上，不利于细胞因子和营养物质的迅速扩散和相互交流，导致介质分布不均，影响细胞间对话。(3) Transwell小室费的用较贵且膜面积有限，难以应用于大规模、大批次的细胞共培养。
【实用新型内容】
[0006]发明目的:本实用新型的目的是提供一种低成本、建立培养体系简捷有效的神经元星形胶质细胞共培养板。
[0007]技术方案:为实现上述目的，神经元星形胶质细胞共培养板包括孔板、设于孔板内底面的若干个支撑座、以及搭在若干支撑座上的爬片。
[0008]本实用新型的支撑座设置于孔板底面，方便爬片上的神经元进行进一步实验。为了保证爬片支撑的稳定性，防止使用过程中发生晃动，所述爬片下表面设有与支撑座上端形成限位关系的浅槽。
[0009]所述支撑座为球形支撑座或柱形支撑座，优选为圆柱形支撑座。
[0010]进一步地，所述支撑座为局部熔融状态下焊接在孔板内底面的玻璃珠或玻璃柱。[0011 ] 所述浅槽为圆形槽，位置与支撑座的分布是对应的。支撑座上端位于浅槽内，仅会在微小范围内浮动，防止爬片在移动孔板过程中滑落。所述浅槽也可设为一体式的环形槽，熔融焊接支撑座时，根据需要焊接到孔板内底面，支撑座上端对应地环形槽内，可在一定程度上保证爬片安装的稳定性。
[0012]优选地，对于12孔板而言，所述玻璃珠直径为3~5 mm，相邻玻璃珠之间距离为15-25 mm，恪融部分的高度为0.5-1.0 mm ;所述玻璃柱底面直径为3~5 mm，高度为3~5 mm,相邻玻璃柱之间距离为15~25 mm，熔融部分的高度为0.5~1.0 mm。6孔板、24孔板的玻璃珠、玻璃柱大小根据使用需要进行适应性调整。
[0013]本实用新型所述孔板为6孔、12孔、24孔细胞培养板或细胞培养皿中的任意一种，优选为12孔细胞培养板。
[0014]所述支撑座设有为3~6个，优选数量为4个。所述爬片形状包括但不限于圆形或四边形，优选为四边形，方便爬片的取出。
[0015]利用本实用新型的培养板建立神经元和星形胶质细胞培养体系的处理步骤包括:
[0016](I)酸处理后进行高压灭菌，然后焊接到孔板内底面；
[0017](2)冷却后将焊接有玻璃珠或玻璃柱的孔板紫外消毒，多聚赖氨酸包被，37°C过夜；
[0018](3)将神经元种植于孔板内底面，48 h后大半量换液，以后每2?3 d换液一次；
[0019](4)神经元种植第5 d，玻璃爬片酸处理后高压灭菌，多聚赖氨酸包被，37°C过夜；
[0020](5)离体培养10?14 d星形胶质细胞种植于爬片，24 h后全量换液，以后每2?3 d换液一次；
[0021](6)神经元种植第7 d，条件培养基预孵星形胶质细胞24 h，收集条件培养基；次日，条件培养基半量更换神经元培养基，37°C孵育24 h ;
[0022](7)神经元种植第9?10 d，更换新鲜神经元培养基，将星形胶质细胞爬片小心反扣于玻璃珠表面，建立体系。
[0023]有益效果:(I)本实用新型设计合理、操作简便、易行，克服了传统的Banker培养方法星形胶质细胞生长不易控制的问题，神经元和星形