，具有统计学意义。这一检测结果与以下情况基本相符:具有主要癌基因突变或抑癌基因失活的细胞往往伴随了代谢通路的上调，从而导致代谢活性的升高。
[0134]此外，与H1975细胞相比，H1650细胞的2-NBDG葡萄糖类似物的摄取能力更高(但未达到统计上显著的程度)。这一检测结果提示，H1650细胞具有更高的2-NBDG葡萄糖类似物与H1650细胞中抑癌基因PTEN失活存在一定相关性。
[0135]实施例2
[0136]外周血中CTC的葡萄糖类似物摄取检测
[0137]本实施例中，同样用图1所示的装置进行检测，其中鱼骨型芯片的结构如图2所不ο
[0138]方法包括以下步骤:
[0139](1)对于2毫升肺癌患者(自愿者)的外周血样本，首先低速离心(200g)5分钟除去上层的富血小板血浆，剩余细胞用Hank平衡盐溶液(HBSS)重悬至2毫升，并加入一组生物素标记的抗体(针对的抗原分别为EpCAM，EGFR, HER2, MUC1。各抗体的最终浓度为1 μ g/mL)共孵育1小时，多余抗体通过离心(300g，5分钟)去除，然后加入链霉亲和素标记的磁球(0.8微米)共孵育30分钟，多余磁球通过离心(300g，5分钟)去除，将细胞重悬在5毫升的HBSS中，形成经预处理的样本。
[0140](2)对于所述鱼骨型芯片的微通道，用10%山羊血清与3%牛血清白蛋白混合溶液封闭一小时以避免细胞的非特异性吸附，再将5毫升上述处理后的细胞悬液通过恒流注射栗以5mL/h的流速通入芯片通道，并在芯片上方设置向上的磁场，从而实现在流动过程中动态捕获CTC。结束后用HBSS以10mL/h的流速清洗芯片5分钟以除去非特异性吸附的细胞，然后撤去磁场将CTC收集在约200微升的液体中，其中除了 CTC还包括极少数目非特异性捕获的白细胞。
[0141](3)将上述约200微升细胞悬液置于微孔阵列PDMS芯片中，芯片上的纳米孔事先用0.1%的I型胶原蛋白在37°C孵育2小时使其表面吸附有胶原蛋白，然后通过操纵磁场确保每个细胞均进入并固定在微孔中。
[0142](4)在微控芯片上加入人工配置的复苏培养基(细胞培养液RPMI_1640、20 ng/ml表皮生长因子EGF、20ng/ml纤维细胞生长因子basic FGF、1:50稀释的补充剂B_27)，置于37度、3%氧气浓度的细胞培养箱中培养24小时，然后用加了牛血清白蛋白的复苏培养基(细胞培养液RPM1-1640、20ng/ml表皮生长因子EGF、20ng/ml纤维细胞生长因子basicFGF、1:50稀释的补充剂B-27、l%牛血液白蛋白BSA)孵育30分钟起到封闭的作用。
[0143](5)芯片上的CTC培养结束后，使用不含葡萄糖的细胞培养液RPM1-1640孵育细胞10分钟，使其饥饿，然后加入含2-NBDG(浓度为0.3mM)的细胞培养液RPM1-1640继续孵育细胞20分钟。
[0144](6)孵育结束后，在冰上用4°C的PBS充分、反复清洗细胞，同时施加磁场确保细胞被固定在纳米孔中。
[0145](7)在显微镜下对芯片上的细胞进行明场与荧光成像。
[0146]结果表明，有5个CTC检测到了较强的荧光信号，呈现了对2-NBDG的快速摄取，而白细胞则没有可检测到荧光信号，即对2-NBDG的摄取。这些CTC在后续的单细胞测序均检测到了 KRAS突变。
[0147]实施例3
[0148]重复实施例2，不同点在于:在本实施例中，所述的装置还包括:(f)第二容器，以及位于所述第二容器内的封闭剂。
[0149]在复苏处理中，还包括加入封闭剂牛血清白蛋白对细胞、微孔芯片进行封闭，消除对2-NBDG的非特异性吸附(实施例4);
[0150]实施例4
[0151]重复实施例2，不同点在于:在本实施例中，所述的装置还包括:
[0152](g)第三容器，以及位于所述第三容器内的用于区分循环肿瘤细胞和白细胞的抗体。
[0153]在检测时，在复苏处理中，还包括加入针对白细胞表面抗原的荧光修饰抗体(如ant1-⑶45-FITC)以识别白细胞，从而将CTC与白细胞区分开。
[0154]实施例5
[0155]重复实施例2，不同点在于:在本实施例中，所述的装置还包括:
[0156](h)第四容器，以及位于所述第四容器内的用于识别死细胞的死细胞染料。
[0157]在检测时，在复苏处理中，加入死细胞染料(如EthD-1，ethdium homodimer-1),从而识别出死细胞。
[0158]在实施例3-5中，结果同样获得了与实施例2中相似的结果，实施例3-5中分别有5、6和5个CTC检测到了明显的荧光信号。
[0159]此外，由于在这些实施例3-5中添加了封闭剂牛血清白蛋白、针对白细胞表面抗原的荧光修饰抗体、和死细胞染料，因此挑选CTC细胞更为方便，也更不容易将CTC细胞与无关细胞混淆。
[0160] 在本实用新型提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本实用新型的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1.一种用于检测循环肿瘤细胞代谢活动的装置，其特征在于，所述装置包括: (a)鱼骨形芯片； (b)微孔阵列芯片；和 (c)第一容器以及置于所述第一容器中的带有可检测标记物的葡萄糖类似物。2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述装置还包括: (d)用于捕获循环肿瘤细胞的磁珠，所述磁珠上负载有与肿瘤表面抗原特异性结合的抗体。3.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述装置还包括: (e)磁场装置，所述磁场装置包括永久磁铁或电磁铁。4.如权利要求1-3中任一所述的装置，其特征在于，所述装置还包括: (f)第二容器，以及位于所述第二容器内的封闭剂。5.如权利要求1-3中任一所述的装置，其特征在于，所述装置还包括: (g)第三容器，以及位于所述第三容器内的用于区分循环肿瘤细胞和白细胞的抗体。6.如权利要求1-3中任一所述的装置，其特征在于，所述装置还包括: (h)第四容器，以及位于所述第四容器内的用于识别死细胞的死细胞染料。7.如权利要求1-3中任一所述的装置，其特征在于，所述的鱼骨型芯片具有以下结构:芯片设有一个入口和一个出口，通道呈连续的s型，宽度1±0.2mm，通道间间隔1±0.2mm，直边长30-70mm，一共5_15条直边。8.如权利要求1-3中任一所述的装置，其特征在于，所述的鱼骨型芯片具有以下结构特征:芯片的横截面呈现周期性的凹凸结构，由两层光刻胶构成，上层的鱼骨图形呈周期性排列，鱼骨宽度为125±20 μπι，水平夹角为45±5°，周期性间隔为75±10 μπι。9.如权利要求2所述的装置，其特征在于，所述的磁珠的粒径为1-1000纳米。10.如权利要求2所述的装置，其特征在于，所述的磁珠的粒径为1-1000微米。
【专利摘要】本实用新型提供了循环肿瘤细胞代谢活动检测装置。具体地，本实用新型的用于检测循环肿瘤细胞代谢活动的装置包括：(a)鱼骨形芯片；(b)微孔阵列芯片；和(c)第一容器以及置于所述第一容器中的带有可检测标记物的葡萄糖类似物。本实用新型可检测所述循环肿瘤细胞对葡萄糖类似物的摄取情况，从而定性或定量地确定所述循环肿瘤细胞代谢活动和/或恶性程度。本实用新型不仅能够区分活的CTC与已处于凋亡状态的CTC，还能够识别具有高代谢活性的CTC并计数，可用于预测CTC的恶性程度，为后续有针对性的进行CTC测序提供线索。
【IPC分类】C12M1/34, G01N33/569
【公开号】CN204958925
【申请号】CN201520572835
【发明人】施奇惠, 邓宇亮, 汤寅
【申请人】上海交通大学
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年7月31日