专利名称：以二胺为桥基的叶酸修饰荧光染料探针的方法
技术领域：
本发明涉及化学及生物科学交叉领域，特别是一种以二胺为桥基的叶酸修饰荧光染料探针的方法。
背景技术：
荧光分析方法由于具有灵敏度高，选择性好，所需试样量小等优势，在分析化学，尤其是在生物分析中被广泛应用。由于大多数生物分子本身荧光较弱或基本无荧光，检测灵敏度较差，荧光探针技术应运而生。荧光探针技术指人们用强荧光的标记试剂或光生成试剂对待测物进行标记或衍生，生成具有高荧光强度的共价或非共价结合的物质。随着生物技术的不断发展，荧光探针技术已经在核酸、蛋白质、细胞检测免疫分析等领域得到了重要应用，表现出快速、灵敏、高通量和易自动化等特点。尤其近年来发展起 来的荧光化学传感器和分子信号系统的应用已深入到药物学、生理学、环境科学、信息科学、生命科学等多个领域。有机荧光染料如噻唑橙类(TO)染料、噁唑黄类(YO)染料和吲哚Cy类菁染料是目前常用的核酸标记类荧光染料，与现有的荧光标记试剂如罗丹明、荧光素等相比更具有优越性，主要表现在(I)具有大的摩尔吸光系数和高的荧光量子产率，它们大多数在较低的浓度就可产生较强的荧光，可作为荧光探针与生物分子共价或非共价链接，分别形成偶联物或复合物，使这些分子成为能用于细胞研究的理想荧光基团；(2)具有相对的光稳定性，不会在荧光显微镜下迅速猝灭；(3)类型多样，结构具有多样性和可变性，通过结构的改变可使其在生理条件下具有不同的水溶解性、稳定性、光谱性能等。叶酸受体(FR)在肿瘤细胞中都有过度表达，而在正常组织中保守表达，利用叶酸受体(FR)与叶酸(FA)及其类似物高亲合力结合的特性，将叶酸偶联的荧光探针输运到肿瘤组织，实现肿瘤组织的特异性靶向光学成像，这一荧光探针技术用于肿瘤细胞的早期识别是近年来备受关注的热点之一。荧光染料-叶酸这一结构的靶向荧光探针分子因价格昂贵，合成收率低，分离困难，成为制约其发展的瓶颈问题之一。
发明内容
为解决上述技术中存在的问题，本发明的目的提供一种以二胺为桥基的叶酸修饰荧光染料探针的方法，桥基二胺的存在，减小了叶酸修饰的荧光染料探针合成路线中，荧光染料和叶酸之间所存在的空间位阻效应，提高了荧光染料探针的合成产率。为实现上述目的，本发明采用的技术方案是提供一种以二胺为桥基的叶酸修饰荧光染料探针的方法，该方法是在叶酸修饰荧光染料探针的合成路线中实现的，其中该方法将二胺作为桥基引入，桥基二胺的两端分别与荧光染料和叶酸连接，构成荧光染料-二胺-叶酸结构的荧光探针；所述荧光染料为具有荧光探针特性且带有-COOH基团的荧光染料；所述桥基二胺一端连接荧光染料，另一端连接叶酸。它们的连接方式为通过二胺两端的-NH2分别与荧光染料及叶酸上的-COOH基团之间的酰胺反应实现荧光染料、二胺及叶酸三者的连接。本发明的效果为该方法在叶酸修饰荧光染料探针的合成路线中，添加二胺作为桥基，增加荧光染料和叶酸之间的C链长度，减小染料分子和叶酸之间的空间位阻效应。这一做法可提高叶酸修饰的荧光染料探针合成产率，较未添加二胺桥基的合成路线，可提高
5% 10% ο
图I为以二胺为桥基的叶酸修饰荧光染料探针方法的示意图；图中·I、荧光染料 2、二胺 3、叶酸 4、酰胺反应5、荧光染料-二胺-叶酸结构的荧光探针图2以二胺为桥基的叶酸修饰TO类荧光染料探针的合成路线；图3以二胺为桥基的叶酸修饰YO类荧光染料探针的合成路线；图4以二胺为桥基的叶酸修饰Cy3菁染料荧光染料探针的合成路线；图5以二胺为桥基的叶酸修饰咔唑桥基类荧光染料探针的合成路线。
具体实施例方式结合附图对本发明的二胺为桥基叶酸修饰荧光染料探针的方法的实现具体过程加以说明。本发明的二胺为桥基叶酸修饰荧光染料探针的方法设计思想是基于在叶酸修饰荧光染料探针的合成路线中，添加二胺作为桥基，通过二胺两端的-NH2基团与荧光染料及叶酸上的-COOH基团之间的酰胺反应，荧光染料和叶酸上的-COOH基团分别与二胺两端的-NH2反应生成酰胺键而相连，实现荧光染料、二胺及叶酸三者的连接，从而构成荧光染料-二胺叶酸结构的荧光染料探针。二胺的加入增长了染料和叶酸之间的C链长度，减小甚至避免了荧光染料和叶酸直接相连时所存在的位阻效益，提高了探针分子的合成产率。如图I所示，本发明的二胺为桥基的叶酸修饰荧光染料探针的方法，该方法是在叶酸修饰荧光染料探针的合成路线中实现的，该方法将二胺作为桥基引入，桥基二胺的两端分别与荧光染料和叶酸连接，构成荧光染料-二胺-叶酸结构的荧光探针；所述荧光染料为具有荧光探针特性且带有-COOH基团的荧光染料；所述桥基二胺一端连接荧光染料，另一端连接叶酸。它们的连接方式为通过二胺两端的-NH2分别与荧光染料及叶酸上的-COOH基团之间的酰胺反应实现荧光染料、二胺及叶酸三者的连接。所述荧光染料为嵌入式荧光染料噻唑橙(TO)或噁唑黄(YO)及其衍生物咔唑桥基类染料或Cy3菁染料。所述二胺为直链二胺，且二胺C链长度为2 6。本发明所涉及的一种二胺修饰荧光探针的方法是这样实施的如图I所示，本发明的一种二胺修饰荧光探针的方法，采用此方法合成的荧光探针由荧光染料I、二胺2和叶酸3构成。所选荧光染料为带有-COOH基团的菁染料、苯乙烯类染料及荧光素等；所选二胺的C链长度为2 6 ;荧光染料I上所带的-COOH基团与二胺
2一端的-NH2发生脱水反应4生成酰胺键而相连。叶酸3所带的-COOH基团与二胺2另一端的-NH2发生脱水反应4生成酰胺键而相连，从而构成了荧光染料-二胺-叶酸结构的荧光探针5。本发明中所涉及到的TO类染料、YO类染料及Cy系列菁染料和咔唑桥基类染料为荧光染料合成荧光染料-二胺-叶酸结构的荧光探针5的合成路线分别如图2，图3，图4和图5所示。TO- 二胺-叶酸合成路线如图2所示，TO- 二胺-叶酸荧光染料的合成路线有两条，路线I中，以二胺为桥基，TO类染料和叶酸上的-COOH基团分别与二胺两端的-NH2基团发生酰胺反应生成酰胺键而相连，从而构成TO- 二胺-叶酸结构的荧光染料探针。路线2中，以二胺为桥基，TO类染料的喹啉单元和叶酸上的-COOH基团分别与二胺两端的-NH2基团发生酰胺反应生成酰胺键而相连，构成喹啉-二胺-叶酸结构的化合物。而后这一结构的化合物与TO类染料的苯并噻唑单元反应，苯并噻唑与喹啉单元结合，构成TO- 二胺-叶酸结构的荧光染料探针。
YO- 二胺-叶酸合成路线如图3所示，YO-二胺-叶酸荧光染料的合成路线有两条，路线I中，以二胺为桥基，YO类染料和叶酸上的-COOH基团分别与二胺两端的-NH2基团发生酰胺反应生成酰胺键而相连，从而构成YO- 二胺-叶酸结构的荧光染料探针。路线2中，以二胺为桥基，YO类染料的喹啉单元和叶酸上的-COOH基团分别与二胺两端的-NH2基团发生酰胺反应生成酰胺键而相连，构成喹啉-二胺-叶酸结构的化合物。而后这一结构的化合物与YO类染料的吲哚单元反应，吲哚单元与喹啉单元结合，构成YO- 二胺-叶酸结构的荧光染料探针。Cy菁染料-二胺-叶酸合成路线如图4所示，Cy菁染料-二胺-叶酸荧光染料的合成路线为以二胺为桥基，Cy菁染料和叶酸上的-COOH基团分别与二胺两端的-NH2基团发生酰胺反应生成酰胺键而相连，从而构成Cy菁染料-二胺-叶酸结构的突光染料探针。咔唑桥基类染料-二胺-叶酸合成路线中如图5所示，咔唑桥基类染料-二胺-叶酸荧光染料的合成路线为以二胺为桥基，咔唑桥基类染料(如咔唑桥基苯并噻唑-喹啉，咔唑桥基苯并噻唑-吲哚和咔唑桥基苯并噁唑-吲哚)和叶酸上的-COOH基团分别与二胺两端的-NH2基团发生酰胺反应生成酰胺键而相连，从而构成咔唑桥基类染料-二胺-叶酸结构的荧光染料探针。实施例实施例ITO-己二胺-叶酸荧光染料探针的合成以二胺为桥基的叶酸修饰TO类荧光染料探针的合成分两步进行，即叶酸接枝二胺合成叶胺和叶胺接枝TO类荧光染料。I)叶酸接枝己二胺合成叶胺将叶酸，N，N-环己基碳二亚胺(DCC)和I-羟基苯并三唑(Η0ΒΤ)，按照叶酸N，N-二环己基碳二亚胺(DCC) : I-羟基苯并三唑(HOBT) =1:5:5的摩尔比混合并溶于20ml无水二甲基亚砜(DMSO)中，并在N2保护下室温反应Ih,而后向反应溶液中添加10倍量，以叶酸量计的己二胺，继续反应5h。再将反应液过滤得滤液，向滤液中加入乙醚和丙酮，析出固体，冷冻后抽滤得滤饼，滤饼用丙酮多次清洗至物油状物出现，即得到接枝己二胺的叶胺。2)叶胺接染料将I)中得到的叶胺、TO类染料、三乙胺及苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，按照叶胺T0:三乙胺HBTU=1:1. 2:4:2的摩尔比混合并溶于30mL无水DMSO中，在N2保护下室温反应3h，而后向反应液中加入乙醚和丙酮析出固体，抽滤得滤饼，滤饼用甲醇洗涤得固体粉末，即TO-己二胺-叶酸荧光染料探针，产率为35% 40%，较未添加己二胺的TO-叶酸荧光染料探针的产率提高5% 10%。实施2咔唑桥基苯并噻唑-吲哚-已二胺-叶酸荧光染料探针的合成
同实例I中一样，以二胺为桥基的叶酸修饰咔唑桥基苯并噻唑-吲哚类荧光染料探针的合成分两步进行，即叶酸接枝二胺合成叶胺和叶胺接枝咔唑桥基苯并噻唑-吲哚类荧光染料。将实例I中第2)中的染料更换为咔唑桥基苯并噻唑-吲哚类染料，在同样的反应物配比和反应物条件下分两步反应可得到咔唑桥基苯并噻唑-吲哚-己二胺-叶酸荧光染料探针，产率约为15%，较未添加己二胺的咔唑桥基苯并噻唑-吲哚-叶酸荧光染料探针的产率提高约8%。
权利要求
1.一种二胺为桥基的叶酸修饰荧光染料探针的方法，该方法是在叶酸修饰荧光染料探针的合成路线中实现的，其特征是该方法将二胺作为桥基引入，桥基二胺的两端分别与荧光染料和叶酸连接，构成荧光染料-二胺-叶酸结构的荧光探针；所述荧光染料为具有荧光探针特性且带有-COOH基团的荧光染料；所述桥基二胺一端连接荧光染料，另一端连接叶酸。它们的连接方式为通过二胺两端的-NH2分别与荧光染料及叶酸上的-COOH基团之间的酰胺反应实现荧光染料、二胺及叶酸三者的连接。
2.根据权利要求I所述二胺为桥基的叶酸修饰荧光染料探针的方法，其特征是所述荧光染料为嵌入式荧光染料噻唑橙(TO)或噁唑黄(YO)及其衍生物咔唑桥基类染料或Cy3菁染料。
3.根据权利要求I所述二胺为桥基的叶酸修饰荧光染料探针的方法，其特征是所述二胺为直链二胺，且二胺C链长度为2 6。
全文摘要
本发明提供一种以二胺为桥基的叶酸修饰荧光染料探针的方法，该方法以一定C链长度的直链二胺为桥基，在叶酸修饰荧光染料探针的合成路线中，通过二胺两端的-NH2分别与荧光染料及叶酸上的-COOH基团之间的酰胺反应而实现三者的相连，从而构成荧光染料-二胺-叶酸结构的荧光染料探针。本发明的效果为该方法在叶酸修饰荧光染料探针的合成路线中，添加二胺作为桥基，增加荧光染料和叶酸之间的C链长度，减小染料分子和叶酸之间的空间位阻效应，提高叶酸修饰的荧光染料探针合成产率。
文档编号C09B57/00GK102925137SQ20121041284
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月25日 优先权日2012年10月25日
发明者费学宁, 曹凌云, 郝亚超, 谷迎春 申请人:天津城市建设学院