用作荧光生物探针的具有聚集诱导发光性质的生物相容纳米粒子及其在体外／体内成像 ...的制作方法
【专利摘要】本发明开发了一种荧光生物探针、它的制备方法及其在体内外生物成像中的实际应用，所述荧光生物探针包含具有聚集诱导发光(AIE)特性的有机荧光化合物。
【专利说明】用作荧光生物探针的具有聚集诱导发光性质的生物相容纳米粒子及其在体外/体内成像中的应用方法
[0001]相关申请
[0002]本专利申请要求了分别于2011年9月I日和2012年3月14日提交的临时专利申请N0.61 / 573，097和61 / 685，227的优先权，它们均是由本申请的发明人提交的，并且它们均通过引用的方式并入本文。
【技术领域】
[0003]本发明的主题涉及具有聚集诱导发光(aggregation induced emission)性质的荧光有机化合物的应用。以生物相容性聚合物为基质，可以将这些荧光化合物配制成为高亮度、低细胞毒性、被癌细胞选择性摄取的大小均匀的纳米粒子。因此，负载了荧光化合物的纳米粒子可用作体外和体内成像的荧光生物探针。
【背景技术】
[0004]非侵入性活体动物荧光成像技术的出现为癌症的诊断和治疗开拓了新的发展道路。在远红外/近红外荧光( FR / NIR)区域(>650nm)具有强烈发光的荧光成像探针，因其能够克服光学吸收、光散射和生物介质的自身荧光的干扰，而受到越来越多的关注。
[0005]迄今为止，一系列的材料，包括有机染料、荧光蛋白和无机量子点(QDs),都已经广泛的应用于FR / NIR荧光成像的研究中。然而，有机染料和荧光蛋白摩尔吸光系数有限，光致漂白阈值较低；而无机量子点在氧化环境中具有高的细胞毒性(A.MDerfus et al.，Nan0.Lett.2004,4,11)。这些缺点极大的限制了有机染料、无机量子点和荧光蛋白在体外和体内成像方面的应用。
[0006]荧光纳米粒子，如负载了有机荧光化合物的纳米粒子，已经发展成为新一代的生物成像纳米探针。它们表现出诸多优势，如合成多样性、低细胞毒性、高光稳定性和具有易得的对特定靶向作用的表面功能化。在实际的应用中，高亮度的纳米粒子非常有利于高对比度成像。在理想情况下，负载了荧光团的纳米粒子的亮度应该与包封的染料分子数量成正比。然而，在高负载率时，η共轭的荧光团易于聚集。聚集的形成通常会导致荧光淬灭，这是一个常见的物理现象，称为聚集引起荧光淬灭(ACQ)。ACQ效应导致纳米粒子很难具有高亮度。人们在放大具有ACQ性质的染料的荧光性方面做了很多的努力(美国专利N0.7，883，900)。然而，即使在放大后，荧光信号也仅略微增强。
[0007]大多数有机荧光团只在其溶液状态下发光，包括溴化乙啶(美国专利N0.4，729，947、N0.5，346，603、N0.6，143，151 和 N0.6，143，153)、尼罗红(美国专利N0.6，897，297和N0.6，465，208)、荧光胺(美国专利N0.4，203，967)、邻苯二甲醛(美国专利 N0.6，969，615 和 N0.6，607，918)和箐染料(美国专利 N0.5，627，027 和 N0.5，410，030)。它们的发光在聚集状态下(例如，荧光染料高浓度态，成膜状态，固体粉末状态等)严重淬灭或者完全淬灭。因此，负载的染料浓度在纳米粒子里只能达到中等水平，导致可得到的荧光强度非常有限。因此在实际应用中，负载了有机荧光团的纳米粒子在体外和体内的生物成像(bioimaging)方面受到了很大的限制。
[0008]因此，非常需要发展用于体外和体内成像，特别是活体动物成像的具有高生物相容性、强的光致漂白抗性和高效的发光亮度的荧光生物探针。
【发明内容】
[0009]本发明涉及了一系列新类型的、具有聚集诱导发光(AIE)特性的有机荧光化合物，其包含一种或多种荧光团以及一种或多种发色团。这些有机荧光基团在稀溶液中不发光，但可以通过聚集时分子内旋转受限这一机制诱导发光。相反，传统的发色团在固体状态下发生聚集引起荧光淬灭。本发明开发了一种结构设计的策略，通过共价键将传统的ACQ发色团与具有聚集诱导发光性质(AIE)的荧光团共价整合转变为高效的固态发光体。所得加合物继承了聚集诱导发光性质。由于电子共轭得以延长，与所得加合物的ACQ母体(其表现出聚集引起淬灭)相比，其发光红移。
[0010]因此，本发明涉及开发和使用具有AIE特性的荧光化合物，这些荧光化合物是通过共价键将AIE荧光团与传统的发色团连接而具有AIE特性。
[0011]本发明进一步涉及了开发具有AIE性质的有机荧光化合物，所述有机荧光化合物可作为荧光生物探针用于体外和体内成像。本发明特别涉及到荧光生物探针的开发和应用，所述荧光生物探针包括负载了荧光化合物的纳米粒子，所述负载了荧光化合物的纳米粒子包含具有AIE性质的荧光化合物，其中所述荧光化合物包含与一种或多种AIE荧光团连接的一种或多种发色团。负载了荧光化合物的纳米粒子具有荧光发射性质。此外，所述荧光化合物包含选自由以下成员构成的组中的骨架结构:
[0012]
【权利要求】
1.一种荧光生物探针，包括负载了荧光化合物的纳米粒子，所述纳米粒子包含具有聚集诱导发光特性的荧光化合物，其中所述荧光化合物包含与一种或多种聚集诱导发光荧光团连接的一种或多种发色团，其中所述负载了荧光化合物的纳米粒子具有荧光发射性质，并且其中，所述荧光化合物包含选自由以下成员构成的组中的一种或多种骨架:
2.根据权利要求1所述的荧光生物探针，其中所述荧光化合物包含选自由以下成员构成的组中的骨架结构
3.根据权利要求2所述的荧光生物探针，其中R1HR4HRrlVIVIVHR13> R14> Ri5> Ri6> Ri7> Ris> Ri9> R20和R21各自可以被取代或未取代，并且独立地选自选自由以下基团构成的组:H、CnH2n+1、0CnH2n+1、C6H5, C10H7' C12H9' OC6H5' OC10H7 和 OC12H9 ;其中 n=0 到 20。
4.根据权利要求1所述的荧光生物探针，其中所述荧光化合物包含以下骨架结构:
5.根据权利要求1所述的荧光生物探针，其中所述荧光化合物包含以下骨架结构:
6.根据权利要求1所述的荧光生物探针，其中所述荧光化合物包含以下骨架结构:
7.根据权利要求1所述的荧光生物探针，其中所述荧光化合物包含以下骨架结构:
8.根据权利要求1所述的荧光生物探针，其中所述荧光化合物包含以下骨架结构:
9.根据权利要求1所述的荧光生物探针，其中所述荧光化合物包含以下骨架结构:
10.根据权利要求1所述的荧光生物探针，其中所述荧光化合物包含以下骨架结构:
11.根据权利要求1所述的荧光生物探针，其中所述荧光化合物包含以下骨架结构:
12.根据权利要求1所述的荧光生物探针，其中所述荧光化合物包含以下骨架结构:
13.根据权利要求1所述的荧光生物探针，其中所述荧光化合物包含以下骨架结构:
14.根据权利要求1所述的荧光生物探针，其中所述荧光化合物包含以下骨架结构:
15.根据权利要求1所述的荧光生物探针，其中所述荧光化合物包含以下骨架结构:
16.根据权利要求1所述的荧光生物探针，其中所述荧光化合物包含以下骨架结构:
17.根据权利要求1所述的荧光生物探针，其中所述荧光化合物包含以下骨架结构:
18.根据权利要求1所述的荧光生物探针，其中所述荧光化合物包含以下骨架结构:
19.根据权利要求1所述的荧光生物探针，其中所述荧光化合物包含以下骨架结构:
20.根据权利要求1所述的荧光生物探针，其中所述荧光化合物包含以下骨架结构:
21.根据权利要求1-20中任一项所述的荧光生物探针，其中RpRyRyRpRpRpRpIVR9> R10> Rn>Ri2> Ri3> Rh、Ris> Rie> R17、Ri8> Ri9> R20 和 R21 中的任一者还包括末端官能团，该末端官能团独立地选自由以下成员构成的组:N3、NH2, COOH, NCS、SH、炔基、N-羟基丁二酰亚胺酯、马来酰亚胺、酰肼、硝酮、-CH0、-0H、卤素以及带电荷的离子基团，其中独立地选自由生物识别肽和细胞穿透肽构成的组中的肽连接到所述末端官能团。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的荧光生物探针，其中所述负载了荧光化合物的纳米粒子还包含生物相容性聚合物基质。
23.根据权利要求22所述的荧光生物探针，其中所述生物相容性聚合物基质选自由动物血清白蛋白、1，2- 二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇、聚芴撑、以及它们的混合物构成的组中。
24.根据权利要求23所述的荧光生物探针，其中所述生物相容性聚合物基质选自由BSA、DSPE-PEG 和 DSPE-PEG-叶酸构成的组。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的荧光生物探针，其中通过使用(a)作为荧光共振能量转移供体的共轭聚合物，或(b)作为生物识别性试剂的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽来修饰所述纳米粒子的表面进一步增强所述负载了荧光化合物的纳米粒子的荧光发射性。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的荧光生物探针，其中所述负载了荧光化合物的纳米粒子的大小为Inm至100，OOOnm。
27.根据权利要求22-26中任一项所述的荧光生物探针，其中所述负载了荧光化合物的纳米粒子选自由以下成员构成的组:BSA包封的纳米粒子、F37NP50、FTNPs以及RGD-修饰的共负载了 PFV/TPE-TPA-DCM的BSA纳米粒子。
28.一种荧光生物探针，其包含一种或多种具有聚集诱导发光特性的荧光化合物，其中所述荧光化合物包含与一种或多种肽连接的一种或多种聚集诱导发光荧光团，其中所述荧光化合物具有荧光发射性质，并且其中所述荧光化合物包含选自由以下成员构成的组中的骨架结构:
29.根据权利要求28所述的荧光生物探针，其中所述荧光化合物包含选自由以下成员构成的组中的化学结构:
30.根据权利要求28或30中任一项所述的荧光生物探针，其中所述肽独立地选自由生物识别肽和细胞穿透肽构成的组。
31.根据权利要求30所述的荧光生物探针，其中所述肽是选自由环状-RGD肽和DEVD肽底物构成的组中的生物识别肽。
32.根据权利要求30所述的荧光生物探针，其中所述细胞穿透肽是转录肽的反式激活子。
33.一种制备权利要求22-27中任一项所述的荧光生物探针的方法，包括通过以下步骤用生物相容性聚合物基质负载所述荧光化合物: a.制备包含有机溶剂和所述荧光化合物的溶液； b.制备生物相容性聚合物的水溶液； c.将所述包含所述有机溶剂和所述荧光化合物的溶液与所述水溶液混合在一起并进行超声；以及 d.除去所述有机溶剂以形成负载了荧光化合物的纳米粒子。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述负载了荧光化合物的纳米粒子是利用能够特异性靶向癌细胞或能够放大荧光成像的任何分子制备的。
35.一种制备权利要求28-32中任一项所述的荧光生物探针的方法，包括: (a)通过固相合成法制备包含末端炔基的肽； (b)制备叠氮化荧光化合物的DMSO溶液； (c)将所述叠氮化荧光化合物与所述肽连同CuSO4和抗坏血酸钠混合一起；(d)通过点击化学将所述荧光化合物与所述肽交联；以及 (e)通过高效液相色谱进行纯化从而形成所述荧光生物探针。
36.一种细胞成像的方法，包括使靶细胞与权利要求1-32中任一项所述的荧光生物探针接触；以及检测细胞成像。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述细胞成像是利用共聚焦激光扫描显微镜或双光子荧光光谱法进行的体外细胞成像；或者是利用Maestro体内荧光成像系统进行的体内细胞成像。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述双光子荧光光谱法用于实时细胞示踪和组织成像。
39.根据权利要求36-38中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是癌细胞或能够倾向地聚集在肿瘤上的细胞。
40.根据权利要求39的方法，其中所述生物探针特异性地靶向癌细胞中的整合素α V β 3°
41.根据权利要求36-40中任一项所述的方法，还包括确定是否存在肿瘤或癌细胞。
42.根据权利要求39-41`中任一项所述的方法，其中体外细胞成像是利用选自由以下成员构成的组中的生物成像样品进行的，所述成员是:MCF-7细胞、HT-29癌细胞或HeLa癌细胞；或者其中体内成像是利用荷瘤ICR小鼠作为生物成像样品进行的。
43.一种检测半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7活性的方法，包括使包含细胞的溶液与权利要求28-32中的任一项所述的荧光生物探针接触，以及检测荧光。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述荧光生物探针被半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7特异性切割。
45.根据权利要求43所述的方法，还包括:实时地荧光开启监测所述荧光生物探针与所述细胞之间的相互作用；以及细胞凋亡。
46.根据权利要求45所述的方法，还包括:体外筛选能够诱导细胞凋亡的药物。
【文档编号】C09K11/06GK103842472SQ201280042771
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年9月3日 优先权日:2011年9月1日
【发明者】唐本忠, 秦玮, 刘建钊, 陈斯杰, 郭子健, 刘斌, 李凯, 丁丹, 史海斌, 耿军龙, 孙景志, 秦安军, 赵秋丽 申请人:香港科技大学, 新加坡国立大学