专利名称：一类以荧光素类似物为母体的荧光染料的合成和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类以荧光素为母体的新型荧光染料，其制备方法及应用，以及利用该类荧光探针化合物在体外和体内检测生物巯基化合物，并将染料应用到细胞成像和活体实验中。
背景技术：
荧光染料作为功能性色素在科学技术的各个领域得到广泛应用，尤其在生命科学、临床医疗诊断、免疫分析检测等方面的研究在全世界备受瞩目。在众多的荧光染料中荧光素是一类被广泛应用的染料，这类染料具有大的摩尔消光系数、好的光稳定性、高的荧光 量子产率等优点。荧光成像监测生物大分子在生命系统中最强大的技术之一，与在可见光区的吸收和发射的荧光传感器相比，近红外(NIR)范围内的染料在生命系统中的应用中是有利的生物成像试剂，由于近红外染料具有最小的光损伤，深部组织的渗透，和最小的背景的自发荧光。因此，发射红光和近红外区域的生色团近几年得到密切的关注。近日，被广泛使用的NIR荧光团探针的菁染料，主要是Cy5和Cy7。然而，据我们所知，菁染料有致命的缺点一特别差的耐光性能。因此，很多组竭尽他们所能，以开发新的近红外的荧光基团，他们主要基于Rhodamine B, BODIPY染料，目前已经有很多这两类荧光团的光谱可以延伸到近红外区域了，更重要的，这两类荧光团有特别好的光稳定性。例如，林伟英的研究课题组构建了长沙市近红外功能染料。Nagano的研究小组开发了系列2_MeTeR是可逆的近红外ROS荧光探针。他们设计并合成了一种新型的近红外的Si杂罗丹明荧光探针MMSiR检测次氯酸。同时，他们还开发出了一系列新的近红外波长激发的荧光染料，SiR-NIRs，这类探针是基于修饰后的Si杂罗丹明母体。与此同时，其他各组也发现了更多的新的近红外的BODIPY染料,但是,到现在为止,很少有近红外突光素衍生物已构建的文献报道。 荧光素染料具有良好的光化学特性，如高摩尔消光系数，较大的荧光量子产率，较好的光稳定性能。最近，荧光素衍生物与氯取代的2’，7’的位置已被广泛开发。值得注意的是，荧光素的羟基位置始终处于一种激活状态，可以很容易地进行修饰。羟基保护的荧光探针已广泛的作为有效平台建设的荧光转式传感器。许多多样化的目标检测物，包括过氧化氢，超氧阴离子自由基，半胱氨酸的基础上独特的羟基保护的过程中荧光素探针的报道。但是，这些已经报道过的探针的吸收和发射波长仍然分别约在480nm和520nm左右。据了解，短波长激发容易带来了巨大的生物样品损害，因此，在近红外范围内的吸收光谱和发射的荧光素类似物研发是一项非常可取的发展。在此，我们引入了新的战略设计一个近红外功能性荧光染料，这种染料是基于2’，7’ - 二氯荧光素(DCF)母体的，同时，基于D-J1-A的机制。我们预期的设计可以延长各种各样的近红外功能性染料为进一步有用的应用在生物学研究的发展战略。
发明内容
本发明基于上述背景技术，开发一种新的荧光染料，该荧光染料具有以下优点:光稳定性好，发射波长在近“红色”区域的基于荧光素类似物为母体的一类新型荧光染料，同时本发明所述染料在生物应用方面具有一定的细胞膜通透性，长波长的特点使得光谱范围与生物样品的光谱范围有较大差异。在本发明的第一方面，本发明针对现有存在的荧光素染料的不足，在其基础上改进，提供了一类结构简单、长波长、且具有良好的细胞膜通透性的新化合物，其具有下列结构通式1:
Cl
Y'COOM RI通式I中:m 为 0、1、2 或 3;M 选自 H，K+，Na+，-R5, -OR10 和-(CH2)n-O-R10 ；R10 为 C1^18 烷基，η 为 1-18 的整数；R。选自 H、F、CUr 和 I ;R’选自H、乙酰基、丙 烯酰基；R 选自 H、札、R2 > R3> R4> R5> R6> R7> R8 和 R9 ;
仏 H Y # 0
R-fR2R3R4R5Re
,r,,,
NC,'CN NC COOCH2CH3 NC^^COOHX 为 C(CH3)2'O、S 或 Se ;Y_为负离子。具有上述结构通式I的荧光染料可用于生物染色，实施例中列举了，将其中一个染料应用于半胱氨酸的体外和体内检测，同时还应用到活体检测等领域的实验，显示出此类化合物具有一定水平的水溶性，同时具有一定良好的细胞膜通透性。本发明的这类化合物同时还具有比较新颖的光谱特性，可应用于荧光成像等方面。本发明的另一方面目的在于提高所述的荧光染料的缀合物。
再一方面的目的在于提高用于生物样品染色的组合物，包含上述荧光染料或其缀合物。另一方面:提供一种制备本发明所述的化合物的方法，所述方法包括以下步骤:( I)将荧光素母体化合物II’溶解在50%的氢氧化钠的水溶液中，在反应温度为10 165°C条件下反应10 24h，得到粘稠状物，然后将反应混合物加入到冰水中，用浓盐酸中和至中性，静置然后抽滤得到固体II ；
权利要求
1.一类以荧光素类似物为母体的新型荧光染料，具有通式I的结构:
2.权利要求1所述的荧光染料，其特征在于，所述的m为I。
3.权利要求1所述的荧光染料，其特征在于，所述的Rtl选自H、F、Cl。
4.权利要求1所述的荧光染料，其特征在于，所述的R’选自H、乙酰基、丙烯酰基。
5.权利要求1所述的荧光染料，其特征在于，所述的R选自
6.权利要求1 5中任一权利要求所述的突光染料,其特征在于,所述的M选自H,K+,Na+。
7.权利要求1所述的荧光染料的缀合物。
8.权利要求1所述的荧光染料的制备方法，包括如下步骤: (I)将荧光素母体化合物II’溶解在50wt%的氢氧化钠的水溶液中，在10 165°C条件下反应10 24h，将得到的粘稠状物加至冰水中，用浓盐酸中和至中性，静置后抽滤得到固体II ；
9.一种用于生物样品染色的组合物，包含权利要求1所述的荧光染料或权利要求7所述的荧光染料缀合物。
10.一种生物样品的染色方法，包括将权利要求1所述的荧光染料、权利要求9所述的荧光染料缀合物或权 利要求9所述的组合物与生物样品接触的步骤。
全文摘要
本发明提供一类以荧光素为母体的荧光染料、其制备方法及应用，所述的以荧光素为母体的荧光染料，具有通式I的结构。该荧光染料可用于生物染色，同时将其中一个染料应用于半胱氨酸的体外和体内检测，同时还应用到活体检测等领域，这类化合物具有一定水平的水溶性，同时具有一定良好的细胞膜通透性。本发明的这类化合物同时还具有比较新颖的光谱特性，并将这类良好性质的荧光素衍生物的染料应用于荧光成像方面。
文档编号C09K11/06GK103214875SQ201310067820
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月4日 优先权日2013年3月4日
发明者彭孝军, 熊小庆, 宋锋玲, 樊江莉, 王静云, 孙世国, 张玉康 申请人:大连理工大学