末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料的制作方法
【专利摘要】一类末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，具有通式I的结构，如附图1。该类双光子荧光染料在活细胞可对多细胞器进行成像，尤其是线粒体和溶酶体，在目标成像的细胞器以外区域具有较低的荧光背景，仅在活细胞中目标多细胞器区域内具有较强的荧光信号，且对目标多细胞器具有很强的专一性标记。这类化合物具有一定水平的水溶性，同时具有良好的细胞膜通透性。并且还具有较大的有效的双光子吸收截面。本发明的这类化合物同时还具有较低的生物毒性、光毒性、光漂白性。其光谱范围与生物样品的光谱范围有足够大的差异。
【专利说明】末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一类末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料、其制备方法，以及 利用该类荧光染料对活细胞中多种细胞器同时的识别及成像。
【背景技术】
[0002] 细胞是一切生物结构和功能的基本组成单位，生物有机体的新陈代谢、生长发育、 繁殖、遗传、变异、应激性和对环境的适应性等各种生命现象，都是依靠细胞来表现和完成 的。换言之，疾病就是人体局部组织结构当中的细胞发生病变的结果，如发炎、癌变、肥大等 病症就根源于细胞的病变发育。例如：内质网在病理条件下、受到损伤或受到某些因素的 作用时，会发生肿胀、肥大和某些物质累积，从而导致诸如：代谢性疾病一糖尿病、肥胖症 等的发生；溶酶体异常，会引发很多疾病，如痛风、矽肺等。而这些病变过程，往往都伴随有 某一种或者多种细胞器在数量、大小、形状、结果的变化。因此，只要找到能实时监测这些 病变细胞及其活动的方法，就能够在一定程度上对疾病诊断与治疗起到很大帮助（Virchow R.L.K.DieCellularpathologie.NabuPress:USA，2010:112-119)。
[0003] 现有识别及检测细胞器的方法种类很多，其中荧光显微成像成为研究细胞器的 一种无可替代的视觉工具。随着显微成像技术的发展，荧光染料在显微成像研究中已经 成为最重要的依附工具。目前，Hoechst、DAPI、SYT0类荧光染料都已经应用到细胞器相 关研究中。但应用荧光小分子的荧光显微成像方法在实际多细胞同时成像应用中存在以 下缺陷：染料细胞膜的通透性差、多细胞同时成像时对细胞器的非内源性损伤等等（Invi trogen:USA, 2010:499, 516, 525；JournalofmaterialschemistryB,2013, 1:438-442 ； JournaloftheAmericanChemicalSociety, 2010, 132:12237-12239)。此夕卜，他们 在近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率与纵向分辨 率、降低生物组织吸光系数及降低组织自发荧光干扰等方面（Nature，1999,2:989-996.; Science, 1997,275:530.；AngewandteChemieInternationalEdition, 2001, 40:2098.) 具有一定的缺陷。因此设计开发一类双光子探针分子，利用其实现对多个细胞器同时实时 成像的工作势必对疾病早期诊断及病因学的研究具有重大潜在意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的，首先在于提供一类末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料， 所述染料具有通式I的结构（附图1):
[0005]
【权利要求】
1. 末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，具有通式I的结构： 通式I中：
R1 选自：-H、卤素、Ch烷基、-(CH2) n0 (CH2)mCH3、_ (CH2)nS(CH2)mCH3 和-(CH2)nNH(CH2)mCH3 ; 其中，n和m各自独立地选自1-8的整数； R2选自卤素、H和CV8烷基； L1 和L2 各自独立地选自：-(CH2)p-、-S(CH2)p' -(CH2)PS-、-S(CH2)PS-、-O(CH2)p-、-(CH2)p0-、-O(CH2)p0-、-NH(CH2)p-、-(CH2)PNH-、-NH(CH2)PNH-、-N(CH3) (CH2)p-、-(CH2) PN(CH3)-和-N(CH3) (CH2)pN(CH3)-;其中p是 1-8 的整数。
2. 权利要求1所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，其特征在于：所述 的R1 选自：-H、卤素、Cp8 烷基、-(CH2) n0 (CH2)mCH3 或-(CH2)nNH(CH2)mCH3。
3. 权利要求1所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，其特征在于：所述 的尺2 为-Cl、_Br、_1、-H、或C1^ 烧基。
4. 权利要求1所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，其特征在于：所 述的L1 选自-(CH2)p-、-NH(CH2)p-、- (CH2)PNH-、-NH(CH2)PNH-、-N(CH3) (CH2)p-、- (CH2) PN(CH3)-或-N(CH3) (CH2)PN(CH3) _。
5. 权利要求I所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，其特征在于：所述 的L2 选自-(CH2) p-、- (CH2)PS-或-(CH2)p0-。
6. 权利要求1所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料，选自化合物A1-A4 :
7. 权利要求1所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料的制备方法，包括如 下步骤： 1)化合物B1与R1-I按摩尔比1:1-1:2反应，制备化合物C1 :
反应温度为20-80°C，反应时间为1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮 或其混合物； 2) 在DMAP催化下，化合物C1、化合物B2与EDCl按照摩尔比1:5:1-1:20:5反应，制备 化合物C2 :
反应温度30-180°C，反应时间1-20小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙 三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物； 3) 在DMAP催化下，化合物CyH-L1-H与EDCl按照摩尔比1:1:1-1:5:5反应，制备化合 物C3 :
反应温度25-120°C，反应时间1-18小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙 三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物； 4) 在DMAP催化下，化合物C3、R2-L2-COOH与EDCl按照摩尔比1:5:1-1:20:5反应，制备 化合物C4 :
反应温度25-KKTC，反应时间1-10小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙 三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物， 5) 化合物C4水解反应制备化合物I，反应体系加入1-10倍于化合物C4摩尔当量的三 氟乙酸，醋酸或者氢氧化钠； 反应温度为25-50°C，反应时间为1-6小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、 水或其混合物。
8. 权利要求1-6中任一权利要求所述的末端官能化的以萘为母体的双光子荧光染料 在生物同时检测与标记中的应用。
9. 权利要求8所述的应用，其特征在于所述的生物同时检测与标记目标物为活细胞中 的线粒体和溶酶体。
【文档编号】C09K11/06GK104448897SQ201410665513
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】仉华, 聂亚敏, 蒋涛, 王魁, 陈粤华, 蒋凯 申请人:河南师范大学