本发明涉及纳米材料，具体属于一种检测整个细胞内ph的红色荧光碳量子点及其制备方法和应用。
背景技术：
细胞ph值作为一个重要的新陈代谢及细胞内的参数，在调控许多细胞的生理和病理过程中发挥着关键性的作用。ph异常会使体内细胞和组织器官功能紊乱、酶和蛋白质活性受到抑制，人体的免疫力下降，最终引发炎症、癌症以及阿尔茨海默症等疾病。此外，细胞ph改变与细胞凋亡密切相关。癌细胞在细胞凋亡初期，普遍会引起细胞内的酸化作用，细胞内酸化已成为细胞凋亡的一个重要的早期特征。因此，对细胞ph进行灵敏、准确的实时原位监测，有助于从分子水平上理解细胞的生理和病理过程。
荧光光谱法具有灵敏度高、选择性好、响应快速、信噪比高、操作简便等优点，结合荧光显微成像技术，ph荧光探针能够实时原位监测细胞内ph的动态分布和区域变化，显示出其独特的时间和空间分辨率高的性质。
碳量子点作为一种新型的碳纳米材料，具有良好的水溶性，生物相容性，低毒性，光稳定性，易于功能化和抗光漂白性等优异性能在生物成像、生物传感，药物输送等诸多领域具有良好的应用前景。近年来，合成的碳量子点通常发射蓝色和绿色的荧光，这就限制了其在生物领域的应用。另外，在细胞成像方面，目前的大多数荧光纳米探针在细胞成像方面都只局限于细胞基质中，并不能透过核膜进入细胞核。因此，实现高效红光发射且可以透过核膜进入细胞核的碳量子点具有非常重要的意义。针对以上问题，本发明提供一种以对苯二胺和乙二胺为原料通过微波法合成碳量子点的方法，最终将用于生物细胞中的ph的检测。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种可透过核膜进入细胞核的检测整个细胞ph的红色碳量子点及其制备方法和应用。
本发明为了解决上述技术问题，采用如下技术方案：
一种用于检测细胞内ph的红色荧光碳量子点的制备方法
(1)称取0.1-0.2mmol的对苯二胺溶于0.075-0.15mol乙二胺中，得到淡黄色液体；
(2)将上述溶液置于微波炉中，在20％～100％功率下反应5～25min，反应停止后冷却至室温，加入5mol/lhcl至有气体逸出；
(3)将上述所得溶液放入500-1000da的透析袋中，再将透析袋放入装有水的容器中，透析两天，即得到纯净的碳量子点水溶液，将其冷冻干燥后得到淡粉色絮状碳量子点。
将所得的碳量子点溶于pbs缓冲溶液中并加入到a549细胞的培养液中，孵化6h，然后通过激光共聚焦显微镜观察a549细胞的成像状态。该碳量子点在ph为5.8时，细胞呈现出明亮的红色荧光；该碳量子点在ph为7.4时，细胞呈现出非常微弱的荧光。说明该碳量子点可作为检测试剂用于整个细胞包括细胞核的ph的检测。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
本发明所制得的碳量子点具有长发射，高量子产率，良好的生物相容性等特点；
本发明所制得的碳量子点对ph有很灵敏的响应，且可以穿透核膜进入细胞核，从而进入整个细胞，达到检测整个细胞ph的效果。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的荧光碳量子点的透射电镜图；
图2为本发明实施例1制备的荧光碳量子点的紫外吸收光谱及荧光激发-发射光谱；
图3为本发明实施例1制备的荧光碳量子点于592nm处荧光强度随ph值变化曲线(1.4-7.4)；
图4为本发明实施例1制备的荧光碳量子点分别在ph＝5.8、ph＝7.4的条件下进入整个细胞时的激光共聚焦显示图。
具体实施方式
实施例1
本实施例中的一种用于检测细胞内ph的红色荧光碳量子点的制备，包括以下步骤：
(1)称取0.2mmol的对苯二胺溶于0.15mol乙二胺中，得到淡黄色液体；
(2)将上述溶液置于微波炉中，在20％功率下反应20min，反应停止后冷却至室温，加入5mol/lhcl至有气体逸出；
(3)将上述所得溶液放入500-1000da的透析袋中，再将透析袋放入1000ml烧杯之中，透析两天，即得到纯净的碳量子点水溶液，将其冷冻干燥后得到淡粉色絮状碳量子点。测得该碳量子点的量子产率为14％。
将所得的碳量子点分别溶于ph＝5.8和ph＝7.4的pbs缓冲溶液中，配成50μg/ml的溶液，分别加入到a549细胞的培养液中，孵化6h，然后通过激光共聚焦显微镜观察a549细胞的成像状态。
对上述合成的碳量子点进行结构表征，如图1。该碳量子点在形态上呈现均匀的球状，粒径约为4.6nm。
对上述合成的碳量子点进行光谱性能研究，如图2。该碳量子点的最佳激发波长和最佳发射波长分别为535nm和592nm。
上述合成的碳量子点在不同ph下呈现出的荧光变化，如图3。该碳量子点在ph＝2.0-9.0呈现s型曲线，pka为5.8，线性范围是4.5-7.0。
通过激光共聚焦实验观测上述合成的碳量子点进入细胞后的情况，如图4。该碳量子点在ph为5.8时，细胞呈现出明亮的红色荧光，并且可明显的从细胞的成像图中观测到整个细胞核都呈现出明亮的红色荧光，这说明上述合成的碳量子点成功的进入到细胞核。该碳量子点在ph为7.4时，细胞呈现出非常微弱的荧光。说明该碳量子点可成功用于整个细胞包括细胞核的ph的检测。
实施例2
(1)称取0.1mmol的对苯二胺溶于0.15mol乙二胺中，得到淡黄色液体；
(2)将上述溶液置于微波炉中，在40％功率下反应20min，反应停止后冷却至室温，加入5mol/lhcl至有气体逸出；
(3)将上述所得溶液放入500-1000da的透析袋中，再将透析袋放入1000ml烧杯之中，透析两天，即得到纯净的碳量子点水溶液，将其冷冻干燥后得到淡粉色絮状碳量子点。测得该碳量子点的量子产率为12％。
实施例3
(1)称取0.2mmol的对苯二胺溶于0.075mol乙二胺中，得到淡黄色液体；
(2)将上述溶液置于微波炉中，在60％功率下反应15min，反应停止后冷却至室温，加入5mol/lhcl至有气体逸出；
(3)将上述所得溶液放入500-1000da的透析袋中，再将透析袋放入1000ml烧杯之中，透析两天，即得到纯净的碳量子点水溶液，将其冷冻干燥后得到淡粉色絮状碳量子点。测得该碳量子点的量子产率为10％。
实施例4
(1)称取0.2mmol的对苯二胺溶于0.15mol乙二胺中，得到淡黄色液体；
(2)将上述溶液置于微波炉中，在80％功率下反应10min，反应停止后冷却至室温，加入5mol/lhcl至有气体逸出；
(3)将上述所得溶液放入500-1000da的透析袋中，再将透析袋放入1000ml烧杯之中，透析两天，即得到纯净的碳量子点水溶液，将其冷冻干燥后得到淡粉色絮状碳量子点。测得该碳量子点的量子产率为11％。
实施例5
(1)称取0.2mmol的对苯二胺溶于0.15moll乙二胺中，得到淡黄色液体；
(2)将上述溶液置于微波炉中，在100％功率下反应5min，反应停止后冷却至室温，加入5mol/lhcl至有气体逸出；
(3)将上述所得溶液放入500-1000da的透析袋中，再将透析袋放入1000ml烧杯之中，透析两天，即得到纯净的碳量子点水溶液，将其冷冻干燥后得到淡粉色絮状碳量子点。测得该碳量子点的量子产率为8％。
对比例
(1)称取0.2mmol的对苯二胺溶于0.15mol乙二胺中，得到淡黄色液体；
(2)将上述溶液置于微波炉中，在20％功率下反应5min，反应停止后冷却至室温；
(3)将上述所得溶液放入500-1000da的透析袋中，再将透析袋放入1000ml烧杯之中，透析两天，即得到纯净的碳量子点水溶液，将其冷冻干燥后得到淡粉色絮状碳量子点，量子产率为3％。
所得碳量子点与实施例1所得的碳量子点相比，量子产率和产量都明显降低，且性质不稳定。