一种双细胞器靶向的纳米探针及其制备及应用的制作方法

本发明属于纳米探针的技术领域，涉及一种双细胞器靶向的纳米探针及其制备方法与应用，具体涉及一种癌细胞线粒体和溶酶体双细胞器靶向，且集荧光成像和具有治疗功能的纳米探针及其制备与应用。

背景技术

癌症是严重威胁人类健康的疾病之一，而细胞器与癌症的诊断和治疗密切相关。例如，线粒体功能紊乱，会导致atp合成减少，引发细胞凋亡；而溶酶体内含有大量的水解酶，通过破坏溶酶体，释放水解酶可以有效杀死癌细胞。因此，靶向线粒体的化疗药物可通过抑制atp的合成，进而诱导癌细胞凋亡；而溶酶体靶向的光动力疗法，可通过光照产生活性氧(ros)，破坏溶酶体的结构和功能，释放溶酶体内水解酶，从而有效杀死癌细胞。另外，靶向细胞器的药物，能够有效的避免细胞膜对药物的外排效应，防止产生耐药性。因此，为了进一步提高癌症的治疗效率，迫切需要开展成像指导下的线粒体和溶酶体双细胞器靶向的协同治疗。

在细胞器成像方面，传统具有聚集猝灭发光(acq)效应的荧光探针有以下缺点：1)具有acq效应的荧光探针进入细胞器中后，导致局部的高浓度聚集，容易导致荧光的自我猝灭；2)具有acq效应的荧光探针，通常只能在很低的浓度下使用，通常具有光稳定性差的缺点，在持续光照下容易发生荧光猝灭；3)具有acq效应的荧光探针，在细胞培养液中有很高的背景噪音，需要经过繁琐的洗涤步骤除去背景干扰；4)具有acq效应的荧光探针通常具有小的stokes位移(小于40nm)，需要滤光片消除激发光的干扰，但同时也极大降低了发射光的强度。因此，具有acq效应的荧光探针限制了其在细胞器成像方面的应用。与之相反，聚集诱导发光(aie)探针在细胞器中聚集后，可以发出高亮度荧光，背景噪音低，光稳定性好，斯托克位移大，在细胞器成像中能够实现免洗成像，简化了实验操作步骤，特别适于细胞器的长期观测成像。同时，aie分子还可以作为化疗或光动力治疗药物，有效破坏细胞器的结构和功能，进而有效杀死癌细胞，实现成像与治疗的结合。因此，基于aie分子，发展线粒体和溶酶体双细胞器靶向的荧光成像和多模式治疗于一体的纳米探针具有重要价值。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足和缺陷，本发明的目的在于提供一种具有线粒体和溶酶体双细胞器靶向成像和治疗功能的纳米探针(即双细胞器靶向的纳米探针)及其制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述双细胞器靶向的纳米探针的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种双细胞器靶向的纳米探针，主要由式i化合物和光敏剂ii制备而成，式i化合物为

其中，r为c1～c16亚烷基、c2～c16链烯基、c1～c16醚、c1～c16硫醚、c1～c16胺、c1～c16酯、c1～c16酰胺或c1～c16磺酰胺；所述光敏剂ii是指带有负电荷的酞菁类或卟啉类光敏剂。

所述c1～c16亚烷基表示-(ch2)n-，其中，n＝1～16；所述c2～c16链烯基表示含有1～8个-(ch＝ch)-的链烯基；所述c1～c16醚表示含有1～16个-(ch2-o)-的醚；所述c1～c16硫醚表示含有1～16个-(ch2-s)-的硫醚；所述c1～c16胺表示含有1～16个-(ch2-nh)-的胺；

所述r优选为c1～c16亚烷基、c1～c16醚或c1～c16硫醚。

所述一价阴离子是与带有一个正电荷的膦离子配对的一价阴离子。

优选地，式i化合物中，r为c1～c12亚烷基；x为卤素离子或ots^–中的一种。

更优选地，r为c1～c10亚烷基；x为卤素离子，包括f^-，cl^–，br^–或i^–。

更优选地，r为c1～c6亚烷基；x为卤素离子，包括f^-，cl^–，br^–或i^–。

更优选地，r为-(ch2)6-；x为br^–。

所述光敏剂ii选自如下化合物中的一种，其中，y为li，na或k：

所述光敏剂ii中，y优选na。

更优选地，所述光敏剂ii选自如下化合物中的一种：

更优选地，所述光敏剂ii选自如下化合物：

本发明的纳米探针，主要由式i化合物和光敏剂ii制备而成，式i化合物中r为-(ch2)6-，x为br^–；所述光敏剂ii选自如下化合物中的一种：

更优选地，r代表-(ch2)6-，x代表br^–；所述光敏剂ii选自如下化合物：

所述纳米探针的制备方法，包括以下步骤：

在有机溶剂中，将式i化合物和光敏剂ii混合，获得混合溶液；在搅拌的条件下，将混合溶液加入水中，获得纳米探针；其中式i化合物和光敏剂ii的正负电荷总数相同。

所述有机溶剂优选为dmso。

本发明的纳米探针，可通过线粒体靶向的聚集诱导发光分子与溶酶体靶向的光敏剂，通过静电、疏水和π-π协同作用，在水溶液中搅拌自组装制备。

本发明的纳米探针可在线粒体中成像或破坏线粒体功能。由于所述纳米探针在细胞内解离释放的结构式i分子(式i化合物)具有聚集诱导发光性质，可通过聚集于线粒体中，点亮荧光，而且可降低线粒体膜电势、抑制线粒体的atp合成能力，破坏线粒体功能。同时本发明的纳米探针在溶酶体中也可成像或破坏溶酶体结构。经实验证明，所述纳米探针在细胞内解离释放的光敏剂ii，可停留于溶酶体中并恢复自身荧光，而且可通过光照生成活性氧，破坏溶酶体的结构和功能。

本发明的纳米探针，由于聚集诱导发光分子i(式i化合物)与光敏剂ii之间存在荧光共振能量转移过程，且光敏剂ii在聚集态存在聚集猝灭发光性质，因此纳米探针自身不发出荧光。当纳米探针进入细胞后逐渐解离释放聚集诱导发光分子i与光敏剂ii。聚集诱导发光分子i选择性聚集于线粒体中，而光敏剂ii停留于溶酶体中。通过破坏聚集诱导发光分子i和光敏剂ii之间的荧光共振能量转移过程和光敏剂ii的聚集态，线粒体靶向的聚集诱导发光分子i与溶酶体靶向的光敏剂ii的荧光逐渐恢复，指示纳米探针的解离过程。

本发明的纳米探针在制备抗肿瘤药物和/或荧光成像中的应用。本发明的纳米探针可在体内肿瘤内实时监测其释放过程，并通过化疗和光动力治疗协同的方式，有效抑制肿瘤的生长。

所述肿瘤包括皮肤癌细胞、肺癌细胞、子宫颈癌细胞、肝癌细胞等形成的肿瘤。

所述肿瘤药物为光动力治疗和/化疗的药物；光动力治疗，可通过近红外光直接照射体表肿瘤或通过光纤导入照射体内深层肿瘤，有效抑制肿瘤生长。

本发明的优点是：

1、本发明通过将线粒体靶向的aie化疗分子(式i化合物)和溶酶体靶向的光敏剂自组装成纳米诊疗探针，可以快速地进入细胞，在破坏线粒体的结构及功能的同时，显著增加光敏剂在癌细胞中的累积量，提高光敏剂在近红外光照射下对癌细胞的杀伤效果。

2、本发明的纳米探针在中性条件下具有很好的稳定性，可以长期储存，而且由于aie分子与光敏剂之间的荧光共振能量转移效应和光敏剂的聚集猝灭发光效应，该纳米探针在细胞外不发光，而在进入癌细胞后，可在溶酶体的酸性环境下发生解离，解除荧光共振能量转移和聚集猝灭发光效应，恢复线粒体靶向的aie分子和溶酶体内停留的光敏剂的荧光，通过双荧光通道，精准监测这一细胞内释放过程。

3、本发明的纳米探针，可通过线粒体靶向的化疗和溶酶体靶向的光动力治疗的协同效应，有效提高癌细胞的杀灭效率，抑制体内肿瘤的生长，且生物安全性好。

附图说明

图1为i-1/ii-1纳米探针(nps)和式i-1化合物的表征图：(a)为透射电镜图；(b)为动态光散射的尺寸分布直方图；(c)为表面电势图；

图2为光物理性质表征图：(a)为i-1，ii-1和i-1/ii-1纳米探针(nps)的紫外-可见吸收光谱图；(b)为i-1的发射光谱和ii-1的吸收光谱图；(c)i-1，ii-1和i-1/ii-1纳米探针(nps)的荧光光谱图；(d)为i-1，ii-1和i-1/ii-1纳米探针(nps)在紫外灯下的荧光照片；

图3为i-1/ii-1纳米探针(nps)在含有0.2％sds和不含0.2％sds溶液中的荧光光谱图；

图4为i-1/ii-1纳米探针(nps)在不同ph条件下随着时间变化的荧光强度(678纳米处)的变化图；激发波长为364纳米；

图5为纳米探针在细胞内释放过程的实时监测：(a)为i-1/ii-1纳米探针在细胞内随着时间变化的共聚焦显微镜荧光成像图，(b)为i-1/ii-1纳米探针在细胞内随着时间变化的流式细胞分析结果；

图6为i-1/ii-1纳米探针与商品化的lysotrackerred的共染成像图；

图7为i-1/ii-1纳米探针与商品化的mitotrackerred的共染成像图；

图8为i-1/ii-1纳米探针的体外光动力活性检测，其中a为i-1/ii-1纳米探针在不同ph条件下用660nm光照射不同时间下sosg在525nm下的相对荧光强度图；(b)为i-1/ii-1纳米探针(nps)在近红外光照下检测细胞内ros产生的共聚焦荧光成像图；

图9为i-1/ii-1纳米探针处理细胞4.5h后，在近红外光照下，不同时间的共聚焦荧光成像图；

图10为线粒体膜电位和atp水平的实验评价，其中(a)为a375细胞被pbs，i-1和i-1/ii-1纳米探针(nps)处理细胞4.5h后，用tmre染色30分钟后的共聚焦图；(b)为a375细胞被pbs和i-1/ii-1纳米探针(nps)处理细胞4.5h后测得的相对atp水平；

图11为i-1，ii-1和i-1/ii-1纳米探针的体外细胞存活率检测(a)和细胞凋亡检测(b)图；

图12为i-1/ii-1纳米探针经瘤内注射后，随时间变化的整个裸鼠的活体成像图(a)和瘤内注射8h后心肝脾肺肾肿瘤的活体成像图(b)；

图13(a)为裸鼠体内肿瘤体积指数随时间的变化图，(b)为注入纳米探针，并治疗21天后的肿瘤照片，(c)为肿瘤切片的苏木素-伊红染色图；

图14(a)为心肝脾肺肾的苏木素-伊红染色图，(b-e)为裸鼠血液中的尿素氮，谷丙转氨酶，谷草转氨酶和总蛋白的血生化指标图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但本发明的实施方式不限于此。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1线粒体和溶酶体—双细胞器靶向的纳米探针的制备(1)线粒体靶向的aie分子i-1的制备

(1-1)将2,4-二羟基苯甲醛v-1(690mg，5.0mmol)和1,6-二溴己烷(1.22g，5.0mmol)加入20ml的乙腈中，然后加入碳酸钾(690mg,5.0mmol)在n2下回流，搅拌反应6h，旋干溶剂，过硅胶柱(pe：ea＝80:1)分离得到化合物ii-1；

(1-2)将化合物iv-1(300mg,1.0mmol)和三苯基膦(262mg，1.0mmol)溶于5ml的三氯甲烷(或乙腈)中，在n2下回流，搅拌反应5h，减压下旋蒸，除去溶剂，重结晶得到化合物iii-1；

(1-3)将化合物iii-1(250mg，0.44mmol)溶于乙醇，然后加入水合肼(11mg,0.22mmol),在n2下回流，搅拌反应4h，过滤，无水乙醇洗三次，真空干燥得到线粒体靶向化疗分子i-1(化合物i-1)。

(2)带有负电荷的光敏剂的制备

将化合物vi-1(89.5mg，0.1mmol)溶解在5ml的甲醇中，然后加入甲醇钠(21.6mg，0.4mmol)，在室温搅拌下反应4h后，将反应混合物用旋蒸的方法除去甲醇，制得光敏剂ii-1(即四磺酸基酞菁氯化铝的钠盐ii-1)，-20℃冰箱避光保存。

(3)溶酶体和线粒体靶向的诊疗一体化纳米探针的制备

将溶于dmso的化合物ii-1(75μl,4mm)与化合物i-1(600μl,1.0mm)混合，然后取67.5μl的上述dmso混合液在磁力搅拌下加入2.9325ml的水中，室温下搅拌2h，制备得到i-1/ii-1纳米探针(nps)。

本实施例的i-1/ii-1诊疗纳米探针(nps)和化合物i-1的表征结果如图1所示，其中图1a为i-1/ii-1(nps)和i-1的透射电镜图，i-1/ii-1纳米探针在水溶液中自组装形成球形的纳米粒子，而i-1自身在水溶液中为无定型聚集态；图1b为动态光散射的检测结果(动态光散射的尺寸分布直方图)，i-1/ii-1的平均水合半径约为77nm，且粒径均一，分散系数为0.161。i-1自身具有大的水合半径(～455nm)，且分散系数高达0.572；图1c为表面电势的检测结果：i-1/ii-1纳米探针的表面电势为-1.04mv，而i-1的表面电势为+12.6mv。这些结果确定了分散性好，粒度小的i-1/ii-1纳米探针通过i-1和ii-1之间的静电相互作用被成功合成。

实施例2：纳米探针的光物理性质表征

将i-1(2.5μm)，ii-1(1.25μm)和i-1/ii-1纳米探针(2.5μm的i-1和1.25μm的ii-1)的水溶液进行紫外-可见吸收光谱、荧光光谱检测和紫外灯照射下的荧光照片采集。

图2a为紫外-可见吸收光谱图，i-1/ii-1纳米探针(nps)在400-460nm和700-800nm有两个拖尾峰，这是由于i-1和ii-1的π–π相互作用引起的；图2b为i-1的发射光谱和ii-1的吸收光谱，由于i-1的发射光谱与ii-1的吸收光谱有重叠，可以发生荧光共振能量转移(fret)过程，同时由于π-平面的ii-1存在聚集猝灭发光的效应，纳米粒子自身不发出荧光；图2c为i-1，ii-1和i-1/ii-1纳米探针(nps)的荧光光谱图，从中可以看出i-1/ii-1纳米探针自身几乎无荧光；图2d为紫外灯下的荧光照片，进一步证实了i-1/ii-1纳米探针自身几乎不发出荧光。

实施例3：i-1与ii-1的疏水作用力测试

实施例1中得到的纳米探针在0.2％的sds溶液中时，i-1和ii-1的荧光信号恢复(图3)，说明sds能够扰乱纳米探针的疏水作用，从而促使纳米探针释放游离的i-1和ii-1，这个结果证实了组成纳米探针的分子间存在疏水作用。图3为i-1/ii-1纳米探针(nps)在含有0.2％sds和不含0.2％sds溶液中的荧光光谱图。

实施例4：纳米探针在不同ph缓冲液中的解离过程监测

将实施例1中得到的纳米探针在14000转/分钟下离心15分钟，然后分别分散在ph7.4和ph5.0的缓冲溶液中，检测在678纳米处荧光的强度变化。图4为i-1/ii-1纳米探针(nps)在不同ph条件下随着时间变化的荧光强度(678纳米处)的变化图；激发波长为364纳米。从图4可以看出，纳米探针在ph5.0下讯速解离，释放游离的光敏剂，随着时间增加，逐渐恢复在678纳米处的荧光强度，而在中性溶液中(ph7.4)的纳米探针则保持稳定，荧光强度几乎不变。

实施例5：线粒体和溶酶体靶向的纳米探针在细胞内释放过程的实时监测

(1)激光共聚焦显微镜观察细胞内的荧光信号变化

以a375细胞作为体外肿瘤细胞模型，将a375细胞以10×10⁴个细胞/皿的密度种在共聚焦培养皿中，贴壁生长24h。用pbs洗三次以后，加入i-1/ii-1纳米探针(2.5μm的i-1和1.25μm的ii-1，孵育0.5h，随后用pbs洗涤三次后，加入新鲜培养液，在37℃培养箱中继续分别孵育0，2.5，4.5和6.5h，进一步在激光共聚焦显微镜下采集细胞的荧光信号；对于i-1通道，激发波长为405nm，收集波段为450–600nm；对于ii-1通道，激发波长为633nm，收集波段为640–750nm。

从图5a(i-1/ii-1纳米探针在细胞内随着时间变化的共聚焦显微镜荧光成像图)可以看出，对于i-1/ii-1纳米探针，在初始阶段，i-1和ii-1两个通道的荧光都非常弱，但随着孵育时间的增加，两个通道的荧光信号逐渐增强，表明纳米探针进入细胞以后，逐渐发生了解离，释放i-1和ii-1，恢复了各自的荧光信号，这是由于线粒体靶向的aie分子和溶酶体靶向的光敏剂之间存在荧光共振能量转移(fret)过程，纳米探针自身几乎不发出荧光，当探针进入细胞以后，在溶酶体的酸性环境中解离，解除荧光共振能量转移效应和光敏剂的聚集猝灭发光效应，同时恢复线粒体靶向的aie分子和溶酶体靶向的光敏剂的荧光信号(解离后的aie分子i-1能够选择性聚集到线粒体中，发出绿色荧光，而光敏剂ii-1停留在溶酶体中，发出红色荧光)，因此，可通过双荧光通道有效监测纳米探针的细胞内解离和释放过程。

(2)通过流式细胞仪定量表征细胞内的荧光强度变化

将a375细胞以20×10⁴个细胞/皿的密度种植在6孔板中，贴壁生长24h。用pbs洗三次以后，加入i-1/ii-1纳米探针(2.5μm的i-1和1.25μm的ii-1)，孵育0.5h后用pbs洗涤三次，随后加入新鲜的细胞培养液，在37℃培养箱继续培养0，2，4和6h，然后用胰蛋白酶消化，收集细胞并用流式细胞仪检测。

从图5b(i-1/ii-1纳米探针在细胞内随着时间变化的流式细胞分析结果)可以看出，随着时间的增加，i-1和ii-1的荧光信号逐渐增强，这与图5a中的实验结果一致。所以，这种双荧光点亮的方式，赋予了纳米探针自我监测能力，可实时监测纳米探针在细胞内的解离和释放过程。

图5为纳米探针在细胞内释放过程的实时监测：(a)为i-1/ii-1纳米探针在细胞内随着时间变化的共聚焦显微镜荧光成像图，(b)为i-1/ii-1纳米探针在细胞内随着时间变化的流式细胞分析结果。

实施例6：线粒体和溶酶体靶向的纳米探针在细胞内的共定位实验

将a375细胞以10×10⁴个细胞/皿的密度种植在共聚焦培养皿中，贴壁生长24h。用pbs洗三次以后，加入含有lysotrackerred(100nm)的细胞培养液，继续在37℃培养箱孵育45分钟，用pbs洗涤三次后加入i-1/ii-1纳米探针(2.5μmi-1和1.25μmii-1)，孵育30分钟，用pbs洗涤三次后，加入新鲜的细胞培养液，在37℃培养箱继续培养4h。对于i-1通道，激发波长为405nm，收集波段为450–600nm；对于ii-1通道，激发波长为633nm，收集波段为640–750nm；对于lysotrackerred通道，激发波长为561nm，收集波段为575–625nm。通过荧光共定位实验(图6)，测得解离后的ii-1与lysotrackerred的皮尔逊相关系数为0.79，说明大部分的ii-1仍然停留在溶酶体中。图6为i-1/ii-1纳米探针与商品化的lysotrackerred的共染成像图。

将a375细胞以10×10⁴个细胞/皿的密度种植在共聚焦培养皿中，贴壁生长24h。用pbs洗三次以后，加入i-1/ii-1纳米探针(2.5μmi-1和1.25μmii-1)，孵育30分钟，用pbs洗涤三次后，加入新鲜的细胞培养液，在37℃培养箱继续培养4h。用pbs洗三次以后，加入含有mitotrackerred(75nm)的细胞培养液，继续在37℃培养箱孵育15分钟，用pbs洗涤三次后对于i-1通道，激发波长为405nm，收集波段为500-550nm；对于ii-1通道，激发波长为633nm，收集波段为640–750nm；对于mitotrackerred通道，激发波长为561nm，收集波段为575–620nm。通过荧光共定位实验(图7)，测得解离后的i-1与mitotrackerred的皮尔逊相关系数为0.87，说明纳米探针释放出的i-1能够靶向线粒体。图7为i-1/ii-1纳米探针与商品化的mitotrackerred的共染成像图。

实施例7：线粒体和溶酶体靶向的纳米探针在体外的光动力活性评价

单线态氧检测探针(sosg)被用于检测单线态氧(¹o2)。将sosg(2.5μm)分别加入ph7.4和ph5.0的纳米探针(含有2.5μm的i-1和1.25μm的ii-1)中，用660nm的红光灯分别照射0,5,15和25分钟，在505nm的激发波长下，检测上述溶液在525nm处的荧光强度。如图8a所示，由于纳米探针在ph7.4时比较稳定，光敏剂在聚集态时没有光动力活性，所以在光照25min的过程中，对于单线态氧指示剂的荧光强度并没有增加；相反，纳米探针在ph5.0时能够快速解离，释放游离的光敏剂，在近红外光的照射下，单线态氧指示剂的荧光强度逐渐增加。这个实验结果证实了纳米探针体系能够产生单线态氧。

将a375细胞以10×10⁴个细胞/皿的密度接种在共聚焦培养皿中，贴壁生长24h。用pbs洗涤三次后，分别加入i-1(2.5μm)，ii-1(1.25μm)和i-1/ii-1纳米探针(2.5μm的i-1和1.25μm的ii-1)孵育30分钟；用pbs洗涤三次后，加入新鲜的细胞培养液，在37℃培养箱继续孵育4h。随后，a375细胞用含有ros的指示剂—2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(10μm)的培养液继续孵育20分钟，pbs洗涤三次，用近红外光(660nm，0.1w/cm²)照射2分钟。对于ros指示剂的荧光通道，激发波长为488nm，收集波段为510-540nm。如图8b所示，仅有纳米探针处理的a375细胞里呈现出了明显的绿色荧光，说明纳米探针可以促进光敏剂有效进入细胞，而且在近红外光的照射下，纳米探针解离释放的光敏剂可显著增加了ros的生成。

图8为i-1/ii-1纳米探针的体外光动力活性检测，其中a为i-1/ii-1纳米探针在不同ph条件下用660nm光照射不同时间下sosg在525nm下的相对荧光强度图；(b)为i-1/ii-1纳米探针在近红外光照下检测细胞内ros产生的共聚焦荧光成像图。

实施例8：纳米探针在近红外光照下的溶酶体逃逸过程监测

将a375细胞以10×10⁴个细胞/皿的密度接种在共聚焦培养皿中，贴壁生长24h。用pbs洗涤三次以后，加入含有lysotrackerred(100nm)的培养液，继续在37℃孵育45分钟，用pbs洗涤三次后，加入i-1/ii-1纳米探针(2.5μm的i-1和1.25μm的ii-1)并孵育30分钟；随后用pbs洗涤三次，并加入新鲜的细胞培养液，在37℃下继续孵育4h，用近红外光(660nm，0.1w/cm²)照射1–4分钟。对于i-1通道，激发波长为405nm，收集波段为450–600nm；对于ii-1通道，激发波长为633nm，收集波段为640-750nm；对于lysotrackerred通道，激发波长为563nm，收集波段为575-625nm。如图9所示，近红外光照后，光敏剂ii-1的红色荧光分布在整个细胞中，说明在近红外光照射下，通过光敏剂产生的ros能有效破坏溶酶体。

图9为i-1/ii-1纳米探针处理细胞4.5h后，在近红外光照下，不同时间的共聚焦荧光成像图。

实施例9：线粒体和溶酶体靶向的纳米探针对线粒体膜电位和atp水平的评价

(1)线粒体膜电位的测定

用四甲基若丹明乙酯酸铵(tmre)来测定细胞内线粒体膜电位。a375细胞分别用pbs，i-1(2.5μm)和纳米探针i-1/ii-1nps(含有2.5μm的i-1和1.25μm的ii-1)处理0.5h。用pbs洗三次，新的培养基加入继续孵育4h。然后用pbs洗3次，加入50nmtmre继续孵育30min，pbs洗3次，新鲜的培养基加入。如图10a所示，与对照组(pbs)相比，当a375细胞用纳米探针处理细胞4.5h以后，tmre的荧光强度非常弱，这说明从纳米探针上释放的i-1能够显著地降低线粒体的膜电位。

(2)atp含量的测定

用atp水平检测试剂盒检测细胞内atp的水平。a375细胞以20×10⁴个细胞/孔种在6孔板中，孵育24h。pbs洗涤三次，然后用pbs，纳米探针(含有2.5μm的i-1和1.25μm的ii-1)处理细胞4.5h。用pbs洗涤3次，加入200μl的细胞裂解液裂解细胞，11800转/分的转速下离心5分钟，取出20μl加到100μl的atp检测工作液中，用酶标仪测化学发光。从图10b中可以看出，与pbs组(control)相比，纳米探针处理过的细胞，atp的水平下降到35％，说明纳米探针能够显著地抑制细胞内atp的合成。

图10为线粒体膜电位和atp水平的实验评价，其中(a)为a375细胞被pbs，i-1和i-1/ii-1纳米探针处理细胞4.5h后，用tmre染色30分钟后的共聚焦图；(b)为a375细胞被pbs和i-1/ii-1纳米探针处理细胞4.5h后测得的相对atp水平。

实施例10：线粒体和溶酶体靶向的纳米探针体外细胞毒性实验评价

(1)细胞存活率测定

细胞存活率实验用cck-8法评价。将a375细胞以2×10⁴个细胞/孔种在96孔板中，孵育24h，随后用pbs洗涤三次，加入不同浓度的i-1，ii-1和i-1/ii-1，继续孵育4.5h；光照组，用660nm的光(0.1wcm^-2，0.5h)照射；对照组，保持在黑暗条件下。在37℃下孵育24h，pbs洗涤三次后，加入100μl的cck-8工作液，继续孵育1.5h，随后用酶标仪测定450nm下的吸光值。从图11a可以看出，对于光照组，在细胞培养液中加入i-1/ii-1纳米探针(含1.0μm的i-1和0.5μm的ii-1)，其细胞存活率降到了17.7％，而仅仅用i-1(1.0μm)或者ii-1(0.5μm)处理的细胞，其细胞的存活率分别下降至60.2％和85.6％。对于非光照组，用i-1/ii-1纳米探针(1.0μm的i-1和0.5μm的ii-1)处理的细胞，其细胞存活率降到65.9％，而仅仅用i-1(1.0μm)或者ii-1(0.5μm)处理的细胞，其细胞的存活率分别下降至64.9％和96.4％。该实验结果说明，线粒体靶向的化疗和溶酶体靶向的光动力协同治疗能够有效地提高癌细胞的杀灭效率。

(2)细胞凋亡监测

将a375细胞以20×10⁴个细胞/皿的密度接种在6孔板中，贴壁生长24h，pbs洗涤三次后，加入i-1(1.0μm)，ii-1(0.5μm)或者i-1/ii-1纳米探针(1.0μm的i-1和0.5μm的ii-1)处理细胞4.5h，然后分别用660nm的光(0.1wcm^-2，0.5h)照射，继续孵育24h，收集a375细胞，用annexinv-fitc/pi工作液处理15分钟，用流式细胞仪测细胞的凋亡。从图11b可以看出，对于i-1/ii-1纳米探针(光照组)，a375细胞的凋亡率为77.2％，而对于单独的i-1(光照组)或者ii-1(光照组)，a375细胞的凋亡率分别为27.9％和4.1％。这些结果都说明线粒体靶向的化疗与溶酶体靶向的光动力疗法能够极大地提高癌细胞的杀灭效果。

图11为i-1，ii-1和i-1/ii-1纳米探针的体外细胞存活率检测(a)和细胞凋亡检测(b)图。

实施例11：线粒体和溶酶体靶向的纳米探针体内活体成像性能

将皮下移植a375肿瘤的裸鼠用于纳米探针体内活体成像。首先，取对数生长期a375黑色素瘤细胞，采用0.25％胰酶消化，收集细胞并计数，将细胞浓度调整至1.5×l0⁷个/ml细胞悬液，取0.2ml(即3×10⁶个)细胞悬液注射于每只小鼠左前肢腋下。当肿瘤的体积达到～500mm³时，瘤内注射i-1/ii-1纳米探针(2.5mgkg^-1i-1和1.0mgkg^-1ii-1)(浓度表示的意思是每kg小鼠注射的药物剂量(mg))，在不同的时间点拍摄体内活体荧光成像。结果如图12a所示，随着时间的增加，肿瘤部位的荧光强度逐渐增强，在8h时荧光值达到最大。从图12b可以看出，纳米探针主要分布在肿瘤和肝脏中，通过肝代谢排出体外。

图12为i-1/ii-1纳米探针经瘤内注射后，随时间变化的整个裸鼠的活体成像图(a)和瘤内注射8h后心肝脾肺肾肿瘤的活体成像图(b)。

实施例12：线粒体和溶酶体靶向的纳米探针抑制体内肿瘤生长的效果评价

将皮下移植a375肿瘤的裸鼠最为体内肿瘤模型。首先，取对数生长期a375黑色素瘤细胞，采用0.25％胰酶消化，收集细胞并计数，将细胞浓度调整至1.5×l0⁷个/ml细胞悬液，取0.2ml(即3×10⁶个)细胞悬液注射于每只小鼠左前肢腋下。当肿瘤的体积达到～200mm³时，随机分为七组，即未经药物处理的对照组，i-1(光照与未光照组)，ii-1(光照与未光照组)，i-1/ii-1纳米探针(光照与未光照组)。将药物通过瘤内注射的方法每三天给药一次，同时每两天用游标卡尺测一下肿瘤的最大长径l和最大横径w计算瘤体体积v＝0.5*l*w²，计算各组平均瘤体体积，并绘制肿瘤生长曲线。从图13a可以看出，与其他组相比，i-1/ii-1纳米探针(光照)处理的对照组能够明显地抑制a375肿瘤的生长。另外，经过21天的治疗，将所有裸鼠处死，剥取瘤体，拍照；然后将其浸入4％的多聚甲醛中，固定，石蜡包埋，切片，进行逐步脱蜡至水，随后用苏木素染色10分钟，水洗2分钟，并用1％盐酸乙醇进行分化3-5秒，流水冲洗10分钟后0.6％氨水返蓝，流水冲洗；用伊红染色2分钟。然后用酒精对切片进行梯度脱水处理，再用二甲苯进行脱水透明，中性树胶封片，显微镜观察并拍照，观察组织形态学变化。裸鼠剥离后的肿瘤的大小图(图13b)和肿瘤的苏木素-伊红染色结果(图13c)进一步证实了i-1/alpcsn4纳米探针(光照组)对肿瘤生长的抑制效果最好。

图13(a)为裸鼠体内肿瘤体积指数随时间的变化图，(b)为注入纳米探针，并治疗21天后的肿瘤照片，(c)为肿瘤切片的苏木素-伊红染色图。

实施例13：纳米探针的生物安全性评价

以裸鼠皮下移植的a375肿瘤为体内肿瘤模型。经过21天的治疗，将所有裸鼠处死，取心肝脾肺肾，然后将其浸入4％的多聚甲醛中，进行逐步脱蜡至水，随后用苏木素染色10分钟，水洗2分钟，并用1％盐酸乙醇进行分化3-5秒，流水冲洗10分钟后0.6％氨水返蓝，流水冲洗；用伊红染色2分钟。然后用酒精对切片进行梯度脱水处理，再用二甲苯进行脱水透明，中性树胶封片，显微镜观察并拍照，观察组织形态学变化。如图14a所示，i-1/ii-1纳米探针的苏木素-伊红染色图，没有显示明显的炎症和损伤。另外，经过21天的治疗后，眼球取血，收集血液样本，做尿素氮，谷丙转氨酶，谷草转氨酶和总蛋白的血生化分析，其血生化分析结果(图14b-e)与健康小鼠类似，该诊疗纳米探针拥有很好的生物安全性。

图14(a)为心肝脾肺肾的苏木素-伊红染色图，(b-e)为裸鼠血液中的尿素氮，谷丙转氨酶，谷草转氨酶和总蛋白的血生化指标图。

实施例14：纳米探针进入细胞后解离并破坏线粒体及溶酶体

本发明的纳米探针能够通过细胞内吞途径快速进入癌细胞，在溶酶体内弱酸性环境下逐渐解离，释放的线粒体靶向aie分子可以聚集到线粒体中，在点亮荧光的同时，通过降低线粒体膜电势、抑制atp合成能力，破坏线粒体的功能；而同时释放的光敏剂，停留在溶酶体中，在恢复荧光的同时，通过近红外光照(660nm)生成活性氧(ros)，有效破坏溶酶体的结构和功能。通过线粒体靶向化疗和溶酶体靶向光动力治疗的协同，有效杀灭癌细胞。

本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。