基于碳量子点荧光猝灭法定量检测维生素B12的荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于荧光探针
技术领域：
，具体涉及一种基于碳量子点荧光猝灭法定量检测维生素b12的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术：
：维生素b12（vitaminb12，vb12）又称钴胺素或氰钴素，是一种由含钴的卟啉类化合物组成的b族维生素。vb12也是唯一含必需矿物质的维生素，因含钴而呈红色，又称红色维生素，是少数有色的维生素，也是维持人体正常机能以及新陈代谢必不可少的维生素。当成人缺乏vb12时会引起恶性贫血，舌、口腔、消化道的粘膜发炎，脊髓变性，神经和周围神经退化；小孩缺乏vb12的早期表现为精神情绪异常、表情呆滞、少哭少闹、反应迟钝、爱睡觉等症状，最后会引起贫血，另外，缺乏vb12可能引起精神忧郁。然而，当vb12过量时，人体会发生哮喘、荨麻疹、湿疹、面部浮肿、寒颤等过敏反应，也可能引发神经兴奋、心前区痛和心悸，还可导致叶酸缺乏。目前已报道的检测vb12的方法有：微生物法、原子吸收分光光度法、高效液相色谱法以及液相色谱质谱联用系统。这些方法有自身独特的优势，但都存在以下缺陷：步骤繁琐，耗时费力，仪器装置复杂昂贵，检测周期长，技术含量高，成本高，抗干扰能力弱以及准确度低等，导致这些检测方法无法得到广泛应用。因此，亟需发展一种快速、高效、定量检测vb12的方法。碳量子点又称为碳纳米点，是碳家族中新型成员，具有光致发光性能，良好的水溶性和稳定性，生物相容性以及低细胞毒性等优点。基于碳量子点已经构筑了多种荧光探针用于各种金属离子、氨基酸、药物和环境污染物等的检测。以其为基础，通过荧光猝灭法，发展一种快速、高效、定量检测vb12的方法具有重要的意义和广阔的应用前景。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种基于碳量子点荧光猝灭法定量检测vb12的荧光探针及其制备方法和应用。本发明由如下技术方案实现的：一种基于碳量子点荧光猝灭法定量检测vb12的荧光探针，以蔗糖作为碳源，乙二胺作为氮源，浓磷酸作为磷源，通过酸碱中和放热碳化法制备pncqds，离心除去不溶物，透析去除未反应的前体物质和小分子，冷冻干燥得到荧光探针pncqds固体粉末；所述荧光探针的具体制备方法如下：(1)前体物质的获得：称量0.4g蔗糖，向其中加6ml乙二胺和4ml浓磷酸，通过酸碱中和放热碳化法得到深褐色黏稠物；（2）待反应体系温度冷却至室温后，将深褐色黏稠物溶解于二次水中，溶液8000转/分钟离心15分钟，上清液在500-1000da的透析袋中透析处理三天，透析袋中的溶液冷冻干燥，即得pncqds固体粉末。所述浓磷酸为市售的85%的浓磷酸，浓度14.6mol/l。利用所述的基于碳量子点荧光猝灭法定量检测vb12的荧光探针检测vb12的方法，具体步骤为：（1）pncqds储备液的制备：0.5gpncqds固体粉末中加入50ml二次水，搅拌使其充分溶解得到浓度为10mg/ml的pncqds储备液；（2）vb12储备液的制备：称取0.1402gvb12粉末，加入到20ml生理盐水中，搅拌溶解，配制浓度为5.17mmol/l的vb12储备液；（3）vb12含量与pncqds荧光强度的线性方程的获得：将若干体积的vb12储备液加入到浓度为2mg/ml的pncqds溶液中，在365nm激发波长下，记录pncqds在451nm下的荧光强度值；通过origin软件线性拟合vb12浓度与pncqds荧光强度，得到线性方程：f0/f=0.11956[vb12]+1.35303，r2=0.994。式中f0、f分别为vb12加入前后pncqds的荧光强度；可检测的线性范围为1.99-31.01µmol/l，最低检出限为0.785µmol/l；（4）待测样品的检测：将待测样品溶于生理盐水中，通过测量加入样品前后pncqds荧光强度的变化，代入线性方程即可得到样品中vb12的含量；（5）实际样品中vb12的加标回收率的测定：向待测样品中加入pncqds储备液，使体系中pncqds浓度为0.2mg/ml；vb12储备液用生理盐水稀释至vb12的浓度为2mmol/l的vb12标准溶液，然后将vb12标准溶液加入体系中，测试实际样品中vb12的加标回收率。本方法的优点在于：碳源蔗糖廉价易得，乙二胺和浓磷酸均为普通试剂，容易采购。探针制备方法简单，无需昂贵仪器，可快速、高效、定量实现vb12的检测。所制备的荧光探针性能稳定，抗干扰能力强。总而言之，与其他检测vb12的方法相比，该方法具有快速有效，性能稳定，抗干扰能力强，无需昂贵的仪器设备，操作简便，检测成本低等优点，为vb12检测提供了一种全新的方法。附图说明图1为实施例1中所制备的pncqds的紫外光谱图以及荧光光谱图。图2为实施例1中所制备的pncqds的激发波长依赖性光谱图。图3为实施例2中各种金属离子（fe3+,pb2+,k+,fe2+,mg2+,cu2+,al3+,ni2+,ag+,ca2+,cr3+,na+,mn2+,zn2+）对vb12检测的干扰实验结果图。图4为实施例2中各种氨基酸（半胱氨酸、色氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、l-亮氨酸、丝氨酸）以及一些b族维生素（vb1、vb3、vb7）对vb12检测的干扰实验结果。图5为实施例3中利用vb12滴定pncqds溶液，pncqds荧光强度的变化曲线图。图6为实施例3中vb12浓度与pncqds荧光强度的线性图。具体实施方式实施例1：pncqds的制备及表征步骤一，称量0.4g蔗糖，向其中加入6ml乙二胺和4ml浓磷酸，得到深褐色黏稠物。步骤二，待烧杯冷却至室温后，向其中加入30ml二次水，搅拌，8000转/分钟离心15分钟，利用500-1000da的透析袋透析处理三天，得到澄清的pncqds溶液。步骤三，冷冻干燥制得pncqds固体粉末。步骤四，称量0.5gpncqds固体粉末于烧杯中，向其中加入50ml二次水，搅拌使其充分溶解，得到浓度为10mg/ml的pncqds储备液。性质表征见图1和图2。图1在pncqds的紫外吸收光谱图中，有两个明显的吸收峰位于276nm和323nm，分别由c=o的n→π*跃迁和n/p掺杂产生的表面缺陷引起；图1中pncqds的最佳激发和发射峰分别位于365nm和451nm。图2是pncqds在不同激发波长下的发射光谱图，当激发波长从300nm变化到500nm时，发射波长由439nm红移到561nm，说明pncqds具有激发波长依赖性。实施例2：维生素b12检测的抗干扰实验步骤一，称量不同质量金属离子（fe3+,pb2+,k+,fe2+,mg2+,cu2+,al3+,ni2+,ag+,ca2+,cr3+,na+,mn2+,zn2+）化合物，加入10ml二次水，配制成浓度为0.1mol/l的金属离子储备液。步骤二，分别称量一定质量半胱氨酸、色氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、l-亮氨酸、丝氨酸，加入5ml二次水，配制成浓度为0.01mol/l的氨基酸储备液。步骤三，分别称量0.015gvb1，0.0062gvb3，0.0122gvb7，加入5ml生理盐水，搅拌使其溶解，配制0.01mol/l的b族维生素储备液。步骤四，向浓度为2mg/ml碳点溶液（2ml）中加入金属离子储备液9µl，此时金属离子浓度为0.3mmol/l，测量此时的荧光强度，记为f0；再向其中加入20µlvb12储备液，此时vb12浓度为34µmol/l，测量此时的荧光强度，记为f。实验结果见图3。步骤五，向浓度为2mg/ml碳点溶液（2ml）中加入氨基酸储备液90µl，此时氨基酸浓度为0.3mmol/l，测量此时的荧光强度，记为f0；再向其中加入20µlvb12储备液，此时vb12浓度为34µmol/l，测量此时的荧光强度，记为f。实验结果见图4。步骤六，向浓度为2mg/ml碳点溶液（2ml）中加入b族维生素储备液90µl，此时b族维生素浓度为0.3mmol/l，测量此时的荧光强度，记为f0；再向其中加入20µlvb12储备液，此时vb12浓度为34µmol/l，测量此时的荧光强度，记为f。实验结果见图4。图3是不同金属离子对vb12检测的干扰性研究，说明vb12检测不受金属离子的干扰；图4是不同氨基酸和其他b族维生素对vb12检测的干扰性研究，说明vb12检测不受氨基酸和其他b族维生素的干扰。结果说明pncqds对vb12检测时具有很好的抗干扰性。实施例3：维生素b12滴定pncqds的线性方程步骤一，测量2mg/ml碳点溶液的荧光强度，记为f0。步骤二，向其中逐滴滴加vb12储备液，分别记录荧光强度，记为f。荧光强度变化见图5。步骤三，利用origin软件，拟合荧光强度变化（f0/f）和vb12浓度之间的线性方程，结果见图6。图5表明随着vb12储备液的加入，pncqds的荧光逐渐被猝灭，说明vb12对pncqds的荧光有特异的猝灭效果。图6是pncqds荧光强度的变化值与vb12浓度之间的线性关系图，线性方程为f0/f=0.11956[vb12]+1.35303，线性范围为1.99-31.01µmol/l，最低检出限为0.785µmol/l，相关性系数r2=0.994。实施例4：实际样品中vb12含量检测步骤一，取四片利丰vb12片剂（山西利丰华瑞制药有限公司，国药准字h14023061），将其全部捣碎，加入10ml生理盐水，搅拌使其充分溶解，溶液在6000转/分钟的台式离心机下离心15分钟，取上清液，取该溶液5ml，稀释至10ml，备用。步骤二，取四片国润vb12片剂（山西国润制药有限公司，国药准字h14022782），将其全部捣碎，加入20ml生理盐水，搅拌使其完全溶解，溶液在6000转/分钟的台式离心机下离心15分钟，取上清液，备用。步骤三，取0.4ml方明vb12注射剂（山东方明药业集团股份有限公司h37021054），用生理盐水稀释至10ml，备用。步骤四，向1600µl二次水中加400µlpncqds储备液，此时碳点浓度为0.2mg/ml，测量荧光强度，记为f0。步骤五，将步骤四中的二次水分别替换为样品溶液，测量此时的荧光强度，记为f。步骤六，将f0/f代入线性方程，计算得到所对应样品中vb12的含量。结果见表1，表明利用pncqds检测vb12的方法可用于实际样品中vb12含量的检测，且相对标准偏差均小于6.8%，具有良好的重现性。表1：三种实际样品中vb12的含量样品vb12含量(µm)相对标准偏差(%)利丰vb12片剂10.5871.8国润vb12片剂4.6123.1方明vb12注射剂7.7796.8实施例5：实际样品中维生素b12的加标回收实验步骤一，取3.868mlvb12储备液稀释至10ml，此时vb12浓度为2mmol/l。步骤二，向1600µl样品溶液中加400µlpncqds储备液，测量荧光强度，记为f0。步骤三，向利丰vb12溶液中滴加12.62µl浓度为2mmol/l的vb12溶液，测量荧光强度，记为f。步骤四，向国润vb12溶液中滴加2.62µl浓度为2mmol/l的vb12溶液，测量荧光强度，记为f。步骤五，向2ml方明vb12注射剂溶液中滴加2.62µl浓度为2mmol/l的vb12溶液，测量荧光强度，记为f。步骤六，将f0/f代入线性方程，计算得到三种实际样品中vb12的加标回收率。结果见表2。表2说明三种实际样品中的vb12的加标回收率介于94.5%与103.9%之间，相对标准偏差小于7.8%，表明pncqds可用于实际样品中vb12的检测，该方法具有很好的重现性。表2：实施例5中三种实际样品中vb12的加标回收实验结果实际样品vb12加入量(µm)vb12检出量(µm)相对标准偏差(%)回收率（%）利丰vb12片2.6213.6552.7103.9国润vb12片2.626.8324.394.5方明vb12注射剂2.6210.1577.897.7当前第1页12