用于蛋白质打印的基底的制作方法

本申请涉及在基底上接枝蛋白质的一般领域，尤其涉及通过光学方法在基底上以预定图案接枝蛋白质。

背景技术：

公开号为wo2016/050980的国际申请(以下称为“studer公开”)涉及一种在打印基底或光化学基底上微结构化地接枝或以图案的形式接枝蛋白质的方法，其中基底覆盖有纳米级(介于1nm和20nm之间)的防污层，即对于活细胞不粘的层。具体而言，这种类型的不粘层是聚合物刷或刷状聚合物，尤其是刷状peg(聚乙二醇)。对于蛋白质不粘的层旨在与蛋白质溶液接触，在该已知方法中溶液必须是水性的，因此该层在其使用所必需的范围内不溶于水。这样的层还旨在由二苯甲酮的吸收光谱(在300nm和400nm之间)中的辐射进行照射，该层因此在其打印所必需的范围内对于该辐射具有抵抗力。

studer公开中的方法，实质上包括使二苯甲酮水溶液液滴与用peg刷表面处理过的基底接触或沉积在该基底上，然后在存在液滴的情况下，根据预定图案，用波长在二苯甲酮的吸收光谱之内(300nm至400nm之间)的辐射来照射刷的纳米级层。在冲洗二苯甲酮溶液后，获得的基底选择性地在照射区域对蛋白质具有粘性。因此，使得可以仅在图案区域(即根据特定的粘附性)打印或沉积蛋白质，然后细胞可以在基底上沉积并且繁殖。

studer公开中使用的二苯甲酮，必须是可溶于水溶剂的二苯甲酮，从而能够以水溶液的形式放置。

然而，在studer公开的方法中，为了获得在基底打印蛋白质图案的再现性，在照射该层时水溶液液滴的存在使得必须补偿该液滴在照射期间不可避免的蒸发，以稳定二苯甲酮在水溶液中的浓度。因此，在这种已知方法中，二苯甲酮水溶液液滴的干燥是一个问题。一种解决方案可以包括通过微流体装置向液滴提供水，以补偿由于液滴的干燥或蒸发引起的液体损失，从而保持其体积恒定。但是，这种解决方案使实验设备复杂化。因此，在studer公开的方法中，在液滴中保持恒定的二苯甲酮浓度似乎是可取的，但是很困难。

技术实现要素：

在此背景下，本发明涉及一种用于打印蛋白质的产品，该产品包括：基底；纳米级聚合物第一层，其对蛋白质不粘且沉积在所述基底上；以及固态二苯甲酮第二层，其沉积在所述第一层上。所述固态第二层可溶于溶剂，并且所述第一层不溶于所述溶剂。

在本公开中，词语“可溶”将被理解为就固体材料而言能够溶解在给定溶剂中的性质。

在本公开中，词语“溶剂”将被理解为是指能够溶解固体或分散固体的分子或原子的液体。

在本公开中，词语“层”将被理解为除了液体材料的膜之外的固体(尤其是糊状或胶凝的)材料的膜。层的厚度对于具有平行平面的膜而言可以是恒定的，或者对于波纹状或弯曲状(尤其是圆顶形的)的膜而言是可变的。

在本公开中，词语“沉积”将被理解为“机械接触”。对于位于固态基底上的材料层，该词表示在材料的原子相对于基底不发生位移的情况下或不发生流动的情况下形成机械接触，并且表示“附着”。而对于位于固态基底上、溶于液体中形成的材料溶液，该词将表示在可能发生流动的情况下或在材料以及液体的原子相对于基底可能发生位移的情况下的机械接触。

在本公开中，词语“薄”或“纳米级”层将被理解为厚度在1nm与2000nm之间，但不排除薄于一纳米并且对于蛋白质不粘的层。

在所述产品的变型中，可以独立采用或组合采用以下条件：

-所述第二层可溶于极性溶剂；

-所述第一层是聚合物刷；

-所述基底是玻璃；所述第二层可溶于水、乙醇或异丙醇；

-所述聚合物是聚乙二醇(peg)。

本发明还涉及一种包括以下步骤的方法：

-设置基底，

-在所述基底上沉积对蛋白质不粘的纳米级聚合物第一层；

-在所述第一层上沉积二苯甲酮第二层，该第二层可溶于溶剂，而所述第一层不溶于所述溶剂。

该方法使得可以获得或制造如上所述的蛋白质打印产品。

在该方法的变型中，根据以下步骤在所述第一层上沉积所述第二层：

-在所述第一层上沉积溶于所述溶剂的二苯甲酮溶液；并且

-蒸发所述溶剂。

在该方法的另一个变型中，通过二苯甲酮的物理气相沉积(pvd)在所述第一层上沉积所述第二层。

关于在所述第一层上影印可粘附蛋白质的图案，所述方法包括以下附加步骤：

-根据所述图案，以二苯甲酮的吸收光谱照射所述第一层；

-将所述第二层溶解在所述溶剂中；

-冲洗所述溶剂。

关于根据所述图案在所述第一层上打印蛋白质，所述方法包括以下附加步骤：

-在所述第一层上沉积蛋白质的水溶液；

-冲洗所述蛋白质的水溶液。

通过阅读以下对本发明示例性实施例的详细描述，上述以及其他特征和优点将变得显而易见。该详细描述参照附图。然而，应当注意，本发明不限于这些示例。

附图说明

附图是示意性的，不一定按比例绘制，主要旨在说明本发明的原理。

图1表示用于打印蛋白质的产品的示例。

具体实施方式

图1中用于打印蛋白质的产品包括：

-玻璃基底1，

-纳米级聚合物第一层3，其对于蛋白质不粘，且附着或沉积在基底1的一个面上，以及

-二苯甲酮第二层或二苯甲酮固体沉积2，其沉积在非粘聚合物层3上且可溶于溶剂。

非粘第一层3与基底1以及二苯甲酮层2机械接触，并且非粘第一层3位于第二层2和玻璃基底1之间。如图所示，基底1可以是平坦的。

在第一实施例中，基底1以现有技术中已知的方式覆盖有对于活细胞不粘的聚合物第一层3或在上述studer公开含义内的不粘层或防污层。在该第一实施例中，该第一层是聚合物刷，并且该聚合物是peg(聚乙二醇)。该第一层3通过现有技术已知的方式沉积在基底1上。

在用于获得产品的第一种方法中，由可溶性二苯甲酮的结晶粉末(其以这种粉末的形式在可见光谱中不透明)以及去离子水产生水溶性二苯甲酮的液体溶液。可溶性二苯甲酮例如具有化学式：(4-苯甲酰基苯基)三甲基氯化铵。

接下来，在第一层3上沉积一滴或几滴该溶液，直到液体溶液在基底上铺展开(即在覆盖有第一层的基底上铺展开)，以在该基底的表面上获得具有平行面、波纹面或弯曲面的溶液膜。

然后，从溶液中蒸发水。对此，为了通过蒸发使溶液干燥，可以例如在70℃下烘烤所获得的系统，或者使该系统在室温下自然干燥。相同的方法可以用于除水以外的溶剂，只要使用的溶剂与第一层3相容。因此，干燥后，获得或多或少硬化的透明(即非结晶的)二苯甲酮第二层2。

应当注意，本领域技术人员会预期重新获得与第一层3以及基底分离的结晶态(因此是不透明的)二苯甲酮粉末。然而，对于这种类型的二苯甲酮，令人惊讶的是，二苯甲酮以固体形式保留在粘附于基底的均匀层中，并且该二苯甲酮是光学透明的、非结晶的，很可能是以无定形固体的形式存在。该第二层的坚实度以及厚度尤其使得可以持久地对其进行刮擦。

一般而言，任何一旦沉积成层后在可见光谱中具有透明性或具有非结晶性的二苯甲酮都符合本公开的教导，因此可以在本发明的框架内使用。可以通过对二苯甲酮在溶剂中形成的溶液进行蒸发或通过在第一层3上沉积该二苯甲酮层的任何其他方法来获得该层。

有利地，所获得的二苯甲酮层的非结晶性使得能够通过照射第一层3来对图案进行影印，而不会由于晶体而使层3劣化。该影印通过穿过第二层2或穿过基底1(选择对照射辐射足够透明的)的在二苯甲酮的吸收光谱中的辐射进行。

在照射之后，例如在可见光谱中以低角度入射来照亮该第二层2，可以方便地在第二层2的外表面处显露已经在第一层3上成像且位于第二层2的内表面上的图案，而无需进入第一层3。

因此，图案的影印是持久的，并且在第二层2的表面处用肉眼可识别出该图案的影印，这使得可以容易地区分影印层和非影印层。

以已知的方式，用于照射图案的辐射的波长或光谱将位于二苯甲酮的吸收波段中，该吸收波段位于300nm至400nm之间。

可以对该层进行刮擦以测量其厚度，并且可以容易地获得大于100微米的层。也可以控制二苯甲酮溶液的初始量以获得受控的层厚。本领域技术人员将能够通过简单的执行操作来确定在每种情况下可以实现的最薄层。

应当注意，减小层的厚度使得可以防止或最小化层的面之间的辐射干扰以及图案打印错误。也可以使用溶剂混合物来使层均匀铺展开，然后撤出这些溶剂。

一旦获得二苯甲酮层，可以不用预防措施而方便地存储并运输该产品。就防止二苯甲酮水溶液液滴的干燥或蒸发以在照射过程中在第一层的顶部获得恒定的二苯甲酮浓度，从而在照射区域中获得针对蛋白质的受控的后续粘附力而言，可以在没有微流体装置或流体装置的光学系统上将其曝光，但在studer公开的方法中微流体装置或流体装置是必需的。

该优点的获取归功于二苯甲酮第二层2，该第二层2是固态的(例如，糊状或凝胶状)，并且在照射时间范围内，其中的二苯甲酮浓度要比液态二苯甲酮溶液液滴中的更稳定。

应当注意，在现有技术以及上述studer公开中，本领域技术人员不会使用比水更易挥发的溶剂，以免加重二苯甲酮水溶液液滴在照射过程中的干燥问题。

也可以在影印后运输该产品，以在洁净室中通过将第二层溶解在合适的溶剂中对该产品进行冲洗。

该溶剂可以是去离子水，但是已经发现，作为极性溶剂的乙醇或异丙醇非常适合于本发明。因此，可溶于极性溶剂的二苯甲酮尤其适用于本发明。

冲洗后，由于照射的影响，根据图案可粘附蛋白质的非粘性第一层将能够与蛋白质溶液接触，从而根据所照射的图案获得打印在第一层上的蛋白质图案。

如果找到一种在层干燥时未观察到结晶的溶剂，那么也可以使用不溶于水的二苯甲酮。因此，当丙酮用作溶剂时，可以使用苯偶姻乙醚。

在第二实施例中，在不破坏不粘层的情况下，就厚度而言以一种更好的受控方式在pvd(物理气相沉积)架子中或通过使得可以在基底上沉积透明的(非结晶的)二苯甲酮层的任何技术(pvd，cvd等)来沉积第二层。

物理气相沉积使得可以产生二苯甲酮薄层，该薄层的厚度非常均匀，因此减少了影印过程中的干扰。因此，该沉积方法特别有利。

对于厚度小于1000nm或亚微米厚度的薄层，该方法是优选的。对于特定的二苯甲酮而言，通过干燥(至少在没有结晶的情况下)可能难以获得这样的厚度。

适合这类气相亚微米沉积的二苯甲酮将是，例如，磺异苯酮型或二苯甲酮-4型的可溶性二苯甲酮，或(4-苯甲酰基苯基)三甲基氯化铵型二苯甲酮。

对于将要沉积为具有给定厚度的薄层的未知二苯甲酮，在可以用光学方法观察干燥层的情况下，本领域技术人员可以观察其是否为非结晶的，尤其是否均匀且透明，以确定该未知的二苯甲酮是否适合本发明。在结晶的情况下，本领域技术人员可以在气相中进行沉积。

因此，本申请的教导扩展到在沉积给定厚度期间不会结晶成薄层的二苯甲酮。该标准可用于为未知的二苯甲酮选择合适的沉积方法或者为已知的二苯甲酮获得新的厚度。因此，本领域技术人员可以首先使用二苯甲酮溶液液滴的干燥，然后通过薄层技术在气相中进行沉积，以确定对于给定的二苯甲酮，根据本发明可获得二苯甲酮层的厚度范围是多少。

对于与在沉积于基底上且具有纳米级厚度的不粘层上影印蛋白质相协调的任意二苯甲酮，这种在液相中或在气相中的薄层沉积的组合使得可以潜在地产生相当大范围的二苯甲酮层厚度。

现有技术中已知的并且与在面对照射波长时形成最均匀的且具有受控厚度的可溶性二苯甲酮层沉积相协调的任何用于沉积薄层的方法，均可用于生产本发明的产品。

用于冲洗(即溶解)第二层的溶剂可以是任何溶剂，只要该溶剂与基底以及不粘层相容，具体而言，不粘层不溶于该溶剂，基底也不溶。就与活细胞的生物相容性而言，水将是冲洗操作的优选溶剂，对于蛋白质不粘的层以及通常用作基底的玻璃均具有抗水性。

应当注意的是，沉积固体层(特别是以凝胶的形式)的操作使二苯甲酮相对于液体的浓度提高，因此在所有其他条件相同的情况下缩短了影印时间。因此，用水溶液液滴与第一层接触的图案打印时间为40秒，而使用根据本申请通过液滴的蒸发获得的第二层，容易地获得0.5秒的打印时间。

此外，知道了氧气或双氧参与使照射区域对蛋白质具有粘性的机理，那么与使用水溶液液滴(其比第二层2更厚，因此对氧气的渗透性更小)相比，二苯甲酮层的沉积使得可以在第一层3处更好地补充双氧，并可以改善影印的均匀性和瞬时再现性。

还应当注意的是，根据本发明通过干燥或cvd或pvd进行沉积的二苯甲酮沉积层具有稳定的浓度，这提高了在基底的不粘层上打印蛋白质的长期再现性。

本发明扩展到在对蛋白质不粘的层上沉积的任何透明或非结晶的固态二苯甲酮沉积。具体而言，在第三种实施例中，可以以透明堆的形式沉积二苯甲酮层，而无需试图立即赋予其基本均匀的厚度，例如通过使用移液管来沉积二苯甲酮溶液液滴，以通过使液滴在不铺展开的情况下干燥而获得典型厚度为100微米并且具有可变的、大致呈圆形(特别是弯曲状或圆顶形)的形状的膜，从而保持透明性或非结晶性。

为了使用上述沉积物，在该固体沉积物或堆上沉积溶剂液滴以使其溶解，然后使重新形成的溶液重新在第一层3上铺开。溶剂蒸发后，会重新出现非结晶的透明层。

在根据第三实施例沉积的、最初铺展开的二苯甲酮层随时间老化的情况下，应注意的是，随后可以在堆或层上沉积溶剂液滴，以重新形成溶液并以均匀厚度(例如几微米的量级)的薄层形式使其干燥。因此，可以通过这种方法补偿或修复二苯甲酮凝胶作为薄层在对蛋白质不粘的第一层3上使自身表面变形的扩散缺陷。

总体而言，这种通过添加溶剂液滴进行补偿或修复的方法适用于本发明的所有实施例，即适用于任何沉积的二苯甲酮层。

最后，本申请的教导因此似乎扩展到沉积在对蛋白质不粘的层的表面上的任何透明或非透明的、非结晶的二苯甲酮层，该二苯甲酮层可溶于不能溶解不粘层的溶剂中。

本发明可在于基底上打印蛋白质的领域进行工业实施或使用。