专利名称：一株邻苯二甲酸二丁酯降解菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于环境污染物生物强化技术领域，具体涉及一株邻苯二甲酸二丁酯降解菌及其应用。
背景技术：
邻苯二甲酸二丁酯(DBP)是一种重要的增塑剂，广泛应用于电线电缆、家具、汽车、服装、化妆品等行业。DBP为环境激素类物质，能干扰动物及人类的生殖系统和发育，具有发育和胚胎毒性。因此美国环保局、欧盟和中国国家环境监测中心均将DBP列为优先控制污染物。 邻苯二甲酸二丁酯类增塑剂易通过不同途径扩散到自然环境中，且DBP在自然环境中非常稳定，水解和光解的速率均非常缓慢，其水解半衰期长达20年之久，因此生物降解成为环境中DBP矿化的主要手段。生物法降解DBP具有成本低，条件温和，不产生二次污染等优点，符合构建环境友好型及资源节约型社会的要求与发展趋势。目前，国内外已有部分学者针对DBP筛选出具有良好降解性能的菌株，如乙酸隹丐不动杆菌{Calcium acetate Acinetobacter)> 乳杆菌(XactobaciIlus、、深红红球菌iRhodococcus ruber)、突光假单胞菌iPseudomorms fluorescens)、铜绿假单胞菌(.Pseudomonas aeruginosa)等。Elizabethkingia sp.是最近新建的一个属，由以前属于黄杆菌属中的6个种所组成，目前尚未见其降解邻苯二甲酸二丁酯的报道。炼油废水、农药废水、啤酒厂废水和焦化废水中含有一定浓度的DBP，而DBP属于难生化降解有机物，因此仅靠生物处理装置中的普通微生物很难实现对DBP的有效降解。
发明内容
本发明旨在解决普通微生物对邻苯二甲酸二丁酯(DBP)降解效率低的问题，目的是提供一株DBP降解菌，实现其对炼油废水、农药废水、啤酒废水和焦化废水的生物强化处理。本发明所提供的DBP降解菌D8源于中国石油化工股份有限公司武汉分公司污水处理装置中的活性污泥。该菌是以DBP作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，在DBP无机盐培养基中对活性污泥中的菌群进行驯化培养，并通过平板划线分离纯化得到。其中，DBP无机盐培养基成分是K2HP0412H20 为 I. 0g, KH2PO4 为 I. 0g, NH4Cl 为O. 8g，NaCl 为 I. 0g，MgSO4 ·7Η20 为 O. 5g, CaCl2 为 O. 006g, FeSO4 ·7Η20 为 O. 02g，2mL 微量元素储备液，补足蒸懼水至IOOOmL ;所述微量元素储备液(g/L)的组分是MnS04 -H2O为O. Ig,ZnSO4 · 7H20 为 O. 12g ；H3BO3 为 O. 07g !Na2MoO4H2O 为 O. 04g ；CuSO4 · 5H20 为 O. 02g ；CoCl2 为
O.04g。按固体培养基I. 5wt% 2wt%添加琼脂。该菌为革兰氏阴性菌，经16S 鉴定为Elizabethkingia sp，编号D8，16S rDNA的GenBank登录号为JQ673498，于2012年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，保藏编号为CCTCC N0:M2012088，该菌的产硫化氢试验、吲哚试验、淀粉水解试验、V-P试验和硝酸盐还原试验均为阳性，甲基红试验和尿酶测定试验为阴性，能利用邻苯二甲酸二丁酯作为唯一碳源和能源进行生长繁殖。该菌菌落为黄色，呈圆形，光滑湿润，边缘整齐。较优培养条件为温度35°C，初始pH= 7，接种量7vol%，摇床转速150 r/min。本发明还涉及所述sp. D8在DBP降解中的应用，应用于生物降解工业废水中的DBP ;工业废水为炼油废水、农药废水、啤酒废水和焦化废水中的一种。本发明与现有技术相比sp. D8能以DBP作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，60 h内能将无机盐培养基中400 mg/L的DBP完全降解，并且能与原活性污泥中的土著微生物协同发挥高效降解作用，对炼油废水、农药废水、啤酒废水和焦化废水中的DBP具有良好的生物强化效果，具有良好的应用前景。
图I为本发明的菌株D8生长与DBP降解效果关系 图2为培养温度对本发明的菌株D8降解DBP的影响 图3为初始pH值对本发明的菌株D8降解DBP的影响 图4为接种量对本发明的菌株D8降解DBP的影响图； 图5为摇床转速对本发明的菌株D8降解DBP的影响 图6为本发明的菌株D8对添加较高浓度DBP炼油废水的处理效果 图7为本发明的菌株D8对添加较高浓度DBP农药废水的处理效果 图8为本发明的菌株D8对添加较高浓度DBP啤酒厂废水的处理效果 图9为本发明的菌株D8对添加较高浓度DBP焦化废水的处理效果图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明做进一步描述，并非对其保护范围的限制。实施例I : Elizabethkingia sp. D8的分离与纯化、鉴定及其对DBP的降解特性 I、菌株的分离与纯化
(I)菌种来源
菌源来自中国石油化工股份有限公司武汉分公司污水处理装置中的活性污泥。(2)菌株的分离与纯化
将采集的样本置于4°C冰箱静置，取上清液I mL接种于100 mL已灭菌的LB培养基(蛋白胨lwt%，氯化钠lwt%，酵母抽提物O. 5wt%)中，30°C、150r/min活化培养过夜。然后将ImL菌液转接至含DBP为200mg/L的无机盐培养基中，同样条件下驯化培养2 d，逐步增大DBP浓度(400 mg/L,600 mg/L,800 mg/L、1000 mg/L,2000 mg/L)。驯化结束，将菌液分别按10_5、10_6、10_7、10_8体积比稀释，涂布于含DBP的无机盐平板上，30°C培养箱培养一周。挑取单个菌落，反复划线纯化，得到单菌落。进行降解试验，确定各菌株的降解能力，以LB斜面保藏降解性能好的菌株。2、菌株的鉴定
(I)DBP降解菌株D8的菌落形态特征及生理生化特性菌株D8的菌落为黄色，边缘整齐，呈圆形，光滑湿润，中心凸起。该菌的产硫化氢试验、吲哚试验、淀粉水解试验、V-P试验和硝酸盐还原试验均为阳性，甲基红试验和尿酶测定试验为阴性，能利用邻苯二甲酸二丁酯作为唯一碳源和能源进行生长繁殖。(2)菌株 D8 的 16S rDNA 鉴定
对菌株D8的16S rDNA基因进行克隆、测序，然后在GenB ank中进行Blast比对。结果显示，与其序列相似性达到99%的均为Elizabethkingia sp,其16S rDNA序列见序列表。结合菌株的生理生化特性，将其归属为sp.,编号为D8。3、菌株D8的生长及其对DBP降解效果
(I)菌悬液的制备
用接种环从试管斜面挑取一环菌接种于LB培养基，300C、150 r/min培养24h，取2 mL转接于新鲜LB培养基，30°C培养12 h (细菌处于对数生长期)，取菌液于4000 r/min条件下离心5 min收集菌体，再用已灭绝的DBP无机盐培养基(pH 7. O)洗涤2次，然后采用DBP无机盐培养基重悬菌体，调节细胞密度至0D_ 1，4°C保存备用。(2)菌株D8的生长与降解曲线
将菌株D8接种于含400 mg/L DBP的无机盐培养基中，于35°C、150 r/min和初始pH=7. O的条件下培养，测定细胞的生物量(0D_)和DBP的残留浓度，结果如图I所示菌株D8对DBP的降解与其生长趋势相一致，表明该菌能利用DBP作为唯一碳源和能源来供给自身生长，并对DBP有良好的降解效果。(Γ8 h，菌液0D_缓慢增加，DBP浓度相应下降，此时菌株处于适应期；8飞6 h，细菌对DBP的降解作用显著加强，降解速率加快，同时菌液的吸光值也有明显的提高，此阶段细菌处于对数生长期，经过此阶段，大部分DBP被去除；56飞O h，细菌的生长和死亡数量达到平衡，对DBP的降解速速率也缓慢下降，此阶段为稳定期；60 h后，DBP已经完全被降解，降解率达到100%，细菌处于衰亡期。实施例2 :环境条件对sp. D8降解能力的影响
I、培养温度的影响
在pH为7. O、摇床转速为150 r/min和接种量为2 vol %时，温度对DBP降解的影响如图2所示在2(T40°C范围内，菌株D8对DBP具有较好的降解效果，表明该菌对温度有较宽的适应范围。在2(T35°C之间时，随着温度的升高，底物的降解率随之增大；但当温度达到40°C时，菌株D8对底物的降解率反而低于35°C时降解率。表明Elizabethkingia sp. D8的最适温度为35°C。2、初始pH的影响
在温度为30°C、摇床转速为150 r/min和接种量为2 vol%时，pH对DBP降解的影响如图3所示在初始pH为6飞.5条件下，DBP的降解效果比初始pH为7、条件下的差，说明菌株D8适合在中性或偏碱性条件下生长；在？!1=7. O时，菌株D8对底物的降解能力最好，60h时降解率达到64. 66%，表明该菌的最适pH为7. O。3、摇床转速的影响
在pH为7. O、培养温度为30°C和接种量为2 V01%时，摇床转速对DBP降解的影响如图4所示菌株D8对DBP的降解速率大小依次为150r/min>200 r/min>100 r/min，其中150r/min时的降解率最高，60 h的降解率达到54. 7%。4、接种量的影响
在pH=7. O、培养温度30°C和摇床转速150 r/min时，接种量对DBP降解的影响如图5所示随着接种量的增大，培养基中活细菌的数量增多，对底物DBP的降解率也随之升高。当接种量为10 vol%时，24 h以后的降解率却低于接种量为7 vol %的降解率，表明适宜的接种量为7 vo 1%ο实施例3 Elizabethkingia sp. D8对添加较高浓度DBP的炼油废水的强化处理 于锥形瓶中，将菌株D8投加到武汉石化的活性污泥中，设置3组实验考察其对DBP的 去除效果
(a)30mL的炼油废水+33mL的DBP无机盐培养基+400mg/L的DBP+30mL的活性污泥+7 vo 1%的D8菌悬液；
(b)30mL的炼油废水+33mL的DBP无机盐培养基+400mg/L的DBP+30mL高压灭菌后的活性污泥+7 vol %的D8菌悬液；
(c)30mL的炼油废水+40mL的DBP无机盐培养基+400mg/L的DBP+30mL的活性污泥。于35°C和150 rpm摇床培养。间隔一定时间，测定培养液中DBP的残留浓度如图6所示，结果表明Elizabethkingia sp. D8的活性污泥对废水中的DBP降解缓慢,投加Elizabethkingia sp. D8则显著提高了活性污泥对DBP的降解能力，并在48 h内将含约400 mg/L的DBP的炼油废水中的DBP完全去除。实施例4: Elizabethkingia sp. D8对添加较高浓度DBP的农药废水的强化处理 于锥形瓶中，将菌株D8投加到农药废水的活性污泥中，设置3组实验考察其对DBP的
去除效果
(a)30mL的农药废水+33mL的DBP无机盐培养基+400mg/L的DBP+30mL的活性污泥+7 vo 1%的D8菌悬液；
(b)3OmL的农药废水+33mL的DBP无机盐培养基+400mg/L的DBP+30mL高压灭菌后的活性污泥+7 vol %的D8菌悬液；
(c)30mL的农药废水+40mL的DBP无机盐培养基+400mg/L的DBP+30mL的活性污泥。于35°C和150 rpm摇床培养。间隔一定时间，测定培养液中DBP的残留浓度，结果如图7所示，结果表明菌株D8能较好的与处理农药废水的活性污泥中的其它菌株共存，并起到了明显的生物强化效果，在56 h内将添加含400 mg/L的DBP农药废水中的DBP完全去除。实施例5: Elizabethkingia sp. D8对添加较高浓度DBP的啤酒废水的强化处理 于锥形瓶中，将D8投加到某啤酒废水的活性污泥中，设置3组实验考察其对DBP的去
除效果
(a)30mL的啤酒厂废水+33mL的DBP无机盐培养基+400mg/L的DBP+30mL的活性污泥+7 vol %的D8菌悬液；
(b)30mL的啤酒厂废水+33mL的DBP无机盐培养基+400mg/L的DBP+30mL高压灭菌后的活性污泥+7vol %的D8菌悬液；
(c)30mL的啤酒厂废水+40mL的DBP无机盐培养基+400mg/L的DBP+30mL的活性污泥。于35°C和150 rpm摇床培养。间隔一定时间测定培养液中DBP的残留浓度，结果如图8所示菌株D8能较好的与处理啤酒厂废水的活性污泥中的其它菌株共存，并起到了明显的生物强化效果，在56 h内将含约400 mg/L DBP的啤酒废水中的DBP完全去除。絮施妙\ b .,Elizabethkingia sp. D8对添加较高浓度DBP的焦化废水的强化处理 于锥形瓶中，将D8投加到某焦化废水的活性污泥中，设置3组实验考察其对DBP的去
除效果
(a)30 mL的焦化废水+33mL的DBP无机盐培养基+400mg/L的DBP+30mL的活性污泥+7 vo I %的D8菌悬液；
(b)30mL的焦化废水+33mL的DBP无机盐培养基+400mg/L的DBP+30mL高压灭菌后的活性污泥+7 vol %的D8菌悬液；
(c)30mL的焦化废水+40mL的DBP无机盐培养基+400mg/L的DBP+30mL的活性污泥。 于35°C和150 rpm摇床培养。连续测定培养液中DBP的残留浓度，结果如图9所示菌株D8能较好的与处理焦化废水的活性污泥中的其它菌株共存，并起到了明显的生物强化效果，在56 h内将含约400 mg/L的DBP的焦化废水中的DBP完全去除。本具体实施方式
为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的。本具体实施方式
与现有技术相比sp. D8能以DBP作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，60 h内能将无机盐培养基中400 mg/L的DBP完全降解，并且能与原活性污泥中的土著微生物协同发挥高效降解作用，对炼油废水、农药废水、啤酒废水和焦化废水中的DBP具有良好的生物强化效果，具有良好的应用前景。
权利要求
1.一株邻苯二甲酸二丁酯降解菌,经鉴定为sp,编号为D8,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2012年3月23日，保藏编号为CCTCC N0:M2012088，菌株16S rDNA的GenBank登录号为JQ673498，其特征在于菌株D8为革兰氏阴性菌，菌落为黄色，呈圆形，光滑湿润，边缘整齐；该菌的产硫化氢试验、吲哚试验、淀粉水解试验、V-P试验和硝酸盐还原试验均为阳性，甲基红试验和尿酶测定试验为阴性，能利用邻苯二甲酸二丁酯为唯一碳源和能源进行生长繁殖。
2.如权利要求I所述邻苯二甲酸二丁酯降解菌的应用，其特征在于所述菌株D8用于降解工业废水中的邻苯二甲酸二丁酯。
3.如权利要求2所述邻苯二甲酸二丁酯降解菌的应用，其特征在于所述工业废水为炼油废水、农药废水、啤酒废水和焦化废水中的一种。
全文摘要
本发明公开了一株邻苯二甲酸二丁酯降解菌及其应用。本发明所提供的一株邻苯二甲酸二丁酯降解菌D8属于Elizabethkingiasp，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年3月23日，保藏编号为CCTCCNO:M2012088，菌株16SrDNA的GenBank登录号为JQ673498。该菌为革兰氏阴性菌，菌落为黄色，边缘整齐，呈圆形，光滑湿润，中心凸起。该菌利用邻苯二甲酸二丁酯作为唯一碳源和能源进行生长繁殖。该菌纯培养时，在60h能将400mg/L的DBP降解完全。菌株D8能耐受浓度高达2000mg/L的DBP，对较高浓度DBP工业废水具有优良的降解效果，该菌应用于炼油废水、农药废水、啤酒废水和焦化废水的生物强化处理，具有很好的应用前景。
文档编号C02F101/34GK102703347SQ201210165900
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月25日 优先权日2012年5月25日
发明者游海, 王巧凤, 许龙龙, 颜家保, 魏鑫 申请人:武汉科技大学