一种石油污染土壤的修复方法与流程

本发明涉及污染土壤修复技术领域。

背景技术：

土壤线虫是土壤动物的主要功能类群之一，是土壤中最为丰富的后生动物，广泛分布于各种生境的土壤中，数量可达 7.6×10⁵-9.2×10⁶/m²。土壤线虫按营养类群主要分为4大类：食细菌线虫、食真菌线虫、植食线虫和捕杂食线虫，其中食细菌线虫在农田生态系统中的数量占60%以上，在根际土壤的比例更高，可达 90%左右，在土壤生态系统中具有重要的生态功能。

大量研究表明土壤线虫广泛存在于石油污染土壤中，其中食细菌线虫是优势类群。肖能文等发现各油井土壤（除油井Ⅳ外）中食细菌线虫数量最多，且各油井土壤的线虫NCR >0.8（NCR即通路比值，表示土壤有机质的分解途径），说明油井土壤有机质分解途径主要为细菌分解，细菌是污染土壤中分解石油的主要功能类群（胜利油田油井开采时间对土壤线虫群落的影响, 环境科学研究, 2011,24(9): 1008-1015；大庆油田石油开采对土壤线虫群落的影响, 生态学报, 2011, 31: 3736-3744.）。周际海等研究表明线虫在扑草净污染土壤中可以影响微生物的生长，且对土壤中的扑草净有一定的吸收和富集作用，能去除污染土壤中的扑草净（Effects of bacterial-feeding nematodes and prometryne-degrading bacteria on the dissipation of prometryne in contaminated soil, Journal of Soils and Sediments, 2012, 12(4): 576-585； Combined effects of bacterial-feeding nematodes and prometryne on the soil microbial activity, Journal of Hazardous Materials, 2011, 192(3): 1243-1249；Dynamic changes of bacterial community under the influence of bacterial-feeding nematodes grazing in prometryne contaminated soil, Applied Soil Ecology, 2013, 64: 70-76.）。但目前有关石油污染土壤中食细菌线虫的生态功能及食细菌线虫与细菌之间的相互作用对土壤石油降解的影响还不明确，因此，研究食细菌线虫在石油污染土壤中如何调控细菌活性和数量，以期为降解石油浓度的研究提供科学的理论依据。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种石油污染土壤的修复方法，该方法使用食细菌线虫对石油污染土壤进行修复，该方法简单方便，易于实施，可以有效降低污染土壤的石油浓度，从而起到净化土壤的作用，实现被污染土壤的重生再利用，在当今耕地面积日益减少、土地污染日益严峻的情况下具有非常突出的社会、经济效益。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种石油污染土壤的修复方法，使用食细菌线虫对石油污染土壤进行修复。

优选的，使用食细菌线虫作为石油污染土壤的动物修复材料，利用食细菌线虫与土壤微生物互作形成的动物-微生物联合体系对石油污染土壤进行修复，土壤微生物为石油污染土壤中的自有微生物。

优选的，石油污染土壤以干土计，1g干土投入1-20条食细菌线虫。

进一步优选的，石油污染土壤以干土计，1g干土投入5-20条食细菌线虫。

更进一步优选的，石油污染土壤以干土计，1g干土投入5条食细菌线虫。

优选的，石油污染土壤以干土计，1g干土含有0.005g石油（1 kg干土含有5.0 g石油），1g干土投入1-20条食细菌线虫。

进一步优选的，石油污染土壤以干土计，1g干土含有0.005g石油（1 kg干土含有5.0 g石油），1g干土投入5-20条食细菌线虫。

更进一步优选的，石油污染土壤以干土计，1g干土含有0.005g石油（1 kg干土含有5.0 g石油），1g干土投入5条食细菌线虫。

更进一步优选的，石油污染土壤以干土计，1g干土含有0.005g石油（1 kg干土含有5.0 g石油），1g干土投入10条食细菌线虫。

更进一步优选的，石油污染土壤以干土计，1g干土含有0.005g石油（1 kg干土含有5.0 g石油），1g干土投入20条食细菌线虫。

优选的，食细菌线虫为模式线虫Caenorhabditis elegans。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

（1）本发明使用食细菌线虫对石油污染土壤进行修复，该方法简单方便，易于实施，可以有效降低污染土壤的石油浓度，从而起到净化土壤的作用，实现被污染土壤的重生再利用，在当今耕地面积日益减少、土地污染日益严峻的情况下具有非常突出的社会、经济效益；

（2）本发明使用食细菌线虫作为石油污染土壤的动物修复材料，利用食细菌线虫与土壤微生物互作形成的动物-微生物联合体系对石油污染土壤进行修复，可以有效降低污染土壤的石油浓度；

（3）本发明结论：石油原油的添加可以为部分土壤微生物提供碳源，促进土壤微生物量碳的增加；一段时间内对土壤微生物的生长产生刺激作用；食细菌线虫的投入对于土壤土壤微生物代谢以及土壤酶活性有促进作用；食细菌线虫能够在石油污染环境中刺激土壤微生物的繁殖，石油污染土壤投入食细菌线虫可以有效降低污染土壤的石油浓度。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明；

图1是本发明实施例1中不同密度线虫对石油污染土壤修复效果的影响柱状图；

图2是本发明实施例1中不同密度线虫对土壤微生物生物量碳的影响柱状图；

图3是本发明实施例1中不同密度线虫对土壤基础呼吸的影响柱状图；

图4是本发明实施例1中不同密度线虫对FDA水解酶活性的影响柱状图；

图5是本发明实施例1中不同密度线虫对脱氢酶活性的影响柱状图；

图6是本发明实施例1中不同密度线虫对脲酶活性的影响柱状图；

图中，S-未污染供试土壤、SP-5.0 g石油/kg干土的石油污染土壤、FSP-5.0 g石油/kg干土的高温灭菌石油污染土壤、SPN5-5.0 g石油/kg干土的石油污染土壤+投入5条食细菌线虫/g干土、SPN10-5.0 g石油/kg干土的石油污染土壤+投入10条食细菌线虫/g干土、SPN20-5.0g石油/ kg干土的石油污染土壤+投入20条食细菌线虫/g干土。不同字母表示处理间存在显著差异（P<0.05）。

具体实施方式

实施例1

1 实验部分

1.1 实验材料

供试土壤：土壤采自于安徽省和县，挑出土壤中大颗粒物质，剔除石子，砂砾，植物残体，过2 mm筛，放入-26 ℃冰箱冷冻三天，再转入22 ℃生物培养箱中培养一个星期，采用反复冻融法，反复冻融5-7次，杀死土壤中原先存在的线虫。用浅盘法分离线虫，直到无线虫为止。

供试石油：石油原油来源于中国石化金南油田，其基本理化性质为：地面相对密度为871.4 kg·m³ (25 ℃)，地面黏度为18.7 mPa·s (60 ℃)，凝固点为26.8 ℃，蜡质含量24.7%，胶质、沥青质总含量8.4%。

石油污染土壤的制备：人工模拟污染土壤，将石油原油用丙酮完全溶解，缓缓加入供试土壤中，充分混匀，放置于通风橱里，不停搅拌，待完全挥发后，将污染土壤与其余杀线土壤混匀，使污染土壤浓度为5.0 g/kg。

本实验采用的食细菌线虫是模式线虫：Caenorhabditis elegans，要对线虫进行消毒，避免线虫自带的微生物污染土壤，减小实验误差。消毒液为0.002%放线菌酮和0.1%硫酸链霉素的抗菌素混合。

1.2 试验设计

6种处理方式如下：

S-未污染供试土壤；

SP-5.0g石油/kg干土的石油污染土壤；

FSP-5.0g石油/kg干土的高温灭菌石油污染土壤；

SPN5-5.0g石油/kg干土的石油污染土壤+投入5条食细菌线虫/g干土；

SPN10-5.0g石油/kg干土的石油污染土壤+投入10条食细菌线虫/g干土；

SPN20-5.0g石油/kg干土的石油污染土壤+投入20条食细菌线虫/g干土。

其中，因不同土壤的含水量不同，因此将土壤换算成干土后计算石油和食细菌线虫的量，例如：“SPN5-5.0g石油/kg干土的石油污染土壤+投入5条线虫/g干土”的意思是“石油的污染浓度是每千克干土的石油添加量是5.0 g石油，即5.0 g石油/kg干土，然后添加的食细菌线虫的数量是5条线虫每克干土，也就是每克干土里添加5条线虫，即5条线虫/g干土” 。

将土壤分装于250 mL三角瓶中，共计168个三角瓶，每瓶装土量相当于120 g 干土重，含水量调至饱和含水量的50%。全程无菌操作，在处理SP、FSP（经高压蒸汽灭菌）、SPN5、SPN10和SPN20的土壤已经过石油污染处理，在处理SPN5、SPN10和SPN20中添加相对数量的模式线虫，并在22 ℃下恒温培养。本实验是破坏性采样，每次实验采样的六个处理，随机选取4个锥形瓶作为4个重复。在第0、7、14、28、56、112和168天取样分析土壤石油残留浓度、土壤微生物生物量碳、土壤基础呼吸、FDA水解酶活性、脱氢酶活性、脲酶活性和过氧化氢酶活性。

1.3 测定方法

土壤石油残留浓度采用超声萃取-酶标仪微量法测定，土壤微生物生物量碳的测定采用CHCl₃熏蒸-K₂SO₄浸提法，用TOC仪分析测定；土壤有机碳采用K₂Cr₂O₇氧化法；土壤FDA水解酶活性测定采用优化的FDA（荧光素双乙酸脂）水解方法测定，以每小时每克土荧光素的生成量表（μg·g^-1·h^-1）；土壤脲酶活性采用靓酚蓝比色法，以24小时后每克土生成的NH₃-N来表示（mg·g^-1·d^-1）；过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法，用KMnO₄ mL/(g·h)表示，脱氢酶采用法TTC还原法，以24小时后每克干土中TTC的还原产物三苯甲臜(TPF)的生成量表示(μg·g^-1·d^-1)；土壤基础呼吸采用气相色谱分析测定。

1.4 数据分析

采用Excel和SPSS进行数据处理和统计分析，生物量数据采用“平均数±标准误”，SPSS统计分析软件进行方差分析，相关分析和线性回归。

2 结果与讨论

2.1 不同密度模式线虫对石油污染土壤修复效果的影响

研究表明，污染土壤的石油残留浓度在培养时间内逐渐降低的趋势，且不同处理其降低的程度不同（图1）。第0天和7天采样时，各种处理之间无显著性差异；第14天采样时，处理SP与对照处理FSP无显著性差异，处理SPN5、SPN10，SPN20与对照处理FSP有显著性差异(P<0.05)；第28天采样时，处理SP，处理SPN10与对照处理FSP无显著性差异(P<0.05)，而处理SPN5与对照处理FSP有显著性差异(P<0.05)，石油残留浓度可以从图1可以得出：处理FSP＞SP＞SPN10＞SPN20＞SPN5，表明加入线虫的处理对降解石油有一定的效果；第56天和112天采样时，石油残留浓度：处理FSP＞SP＞SPN10＞SPN20＞SPN5，各种处理均与对照处理FSP有显著性差异(P<0.05)，且处理SPN5较其他处理石油残留浓度最低；第168天采样时，石油残留浓度为处理FSP＞SP＞SPN10＞SPN20＞SPN5，处理FSP、SP、SPN5、SPN10和SPN20的土壤石油含量比第0天采样时降低约30.81%、60.77%、80.01%、67.63%和66.31%。也就是和对照处理FSP相比，处理SP、SPN5、SPN10和SPN20的石油降解率分别提高了29.96%、49.20%、36.82%和35.50%。由此可见，土壤微生物及其与模式食细菌线虫的互作可以促进污染土壤石油的降解，其中处理SPN5较其它处理石油降解效率高，说明加入线虫对于降低石油污染土壤的浓度有一定的效果，但不是投入线虫的数量越多越好。

2.2 不同密度模式线虫对土壤微生物生物量碳的影响

如图2所示，第0天采样时，土壤微生物生物量碳在处理SP、SPN5、SPN10和SPN20间均无显著性差异；第7天采样时，土壤微生物生物量碳含量表现为SP＞SPN10＞SPN20＞SPN5，与对照处理S相比，处理SP土壤微生物生物量碳增加约28.79%，处理SPN10、SPN20和SPN5土壤微生物生物量碳增加约17.60%、5.27%和3.18%，处理SP与处理SPN5，处理SPN20有显著性差异(P<0.05)；第14天采样时，处理SPN10与处理SPN20无显著性差异，而处理SP与处理SP和处理SPN5差异性显著(P<0.05)；第28天采样时，处理SP、SPN5和SPN10均无显著性差异，与对照处理S有显著性差异(P<0.05)，处理SPN20与对照处理S无显著性差异；第56天采样中，除处理SPN20与对照处理S有显著性差异(P<0.05)，其余处理与对照处理S无显著性差异；第112天和168天采样中，处理SPN10的土壤微生物生物量碳最高，其他处理之间无显著性差异。从整体趋势看，不同处理下的土壤微生物生物碳在整个培养时间内呈先上升后下降的趋势。初期土壤微生物生物量碳的升高可能是因为土壤中添加了石油原油，为土壤中微生物的生长提供了大量碳源，一定程度上刺激了土壤微生物的生长。而在培养时间中后期，石油中可分解的物质减少，甚至会抑制土壤微生物的生长，导致处理SP，SPN5，SPN10，SPN20土壤微生物生物量碳的降低。综合来看，加入线虫的处理和其他处理相比，土壤微生物生物量碳值偏高。

2.3 不同密度模式线虫对土壤基础呼吸的影响

从图3可以看出，在整个培养时间内，土壤CO₂的排放量先增高后降低。在第28天采样后，整体趋势趋于平稳。第0天采样时，处理SPN5、SPN10和SPN20中CO₂的排放量显著高于处理SP中的CO₂的排放量，与对照处理S相比，处理SP、SPN5、SPN10和SPN20土壤基础呼吸强度分别增强了约218.57%、688.99%、630.64%和586.79%；与对照处理S呈显著性差异(P<0.05)，且处理SPN5、SPN10和SPN20与处理SP呈显著性差异(P<0.05)，处理SPN5、SPN10和SPN20之间无显著性差异；第7天和第14天采样时，处理SP、SPN5、SPN10和SPN20土壤基础呼吸量极显著高于第0天采样时土壤基础呼吸量，可能是由于土壤中存在某些能分解石油的土壤微生物将石油作为碳源，促进了自身的生长与繁殖，添加的食细菌线虫，由于土壤微生物的大量繁殖，有了充足的细菌作为食物，繁殖数量增多，即CO₂的排放量随之升高；另一方面原因可能是土壤微生物在石油污染土壤环境中受到胁迫，增加了自身代谢且线虫在初期的呼吸作用增强，释放出了大量的CO₂。第28天和第56天采样时，处理SPN5、SPN10和SPN20土壤基础呼吸量远低于第0天采样时土壤基础呼吸量，可能是因为易被土壤微生物利用的石油原油成分减少，即土壤中养分减少，土壤微生物数量呈现了下降的趋势，导致CO₂的排放量减少并在28天后趋于稳定；第112天采样时，各种处理较于第56天采样时CO₂的排放量有缓慢的增加，可能是由于一段时间后，土壤中的微生物适应了土壤环境，开始缓慢的繁殖生长；第168天采样时，各种处理土壤呼吸强度降低。

2.4 不同密度模式线虫对土壤酶活性的影响

2.4.1 不同密度模式线虫对FDA水解酶活性的影响

如图4所示，FDA水解酶在培养时间内的整体的趋势为：先上升后降低再上升。第0天采样时，处理SP、SPN5、SPN10和SPN20之间无显著性差异，但是均与对照处理S有显著性差异(P<0.05)；第7天和第14天采样时，处理SP、SPN5、SPN10和SPN20的FDA水解酶活性均大于对照处理S，可能是由于添加其中的石油烃可以作为土壤微生物生长所需要的碳源，引起某些可利用分解石油的土壤微生物大量繁殖，使FDA水解酶酶活性显著增高；第28天采样时，各种处理与对照处理S无显著性差异；第56天采样时，FDA水解酶活性明显增高，此时由于土壤微生物适应其生存的环境以及土壤微生物数量的增多，导致FDA水解酶的活性增强；第112天采样时，各种处理与对照处理S无显著性差异；第168天采样时，FDA水解酶活性表现为S＞SPN10＞SPN5＞SP＞SPN20，除处理SPN20与对照处理S有显著性差异(P<0.05)，其他处理与对照S无显著性差异。

2.4.2 不同密度线虫对脱氢酶活性的影响

如图5所示，脱氢酶活性在培养时间内大体表现为先上升后下降的趋势。脱氢酶可使石油烃的氢原子活化并传递给特定的受氢体，实现石油烃的氧化和转化。在大多情况下，土壤微生物对石油污染物的降解或转化从脱氢开始，因此可以利用脱氢酶的活性反映石油降解土壤微生物的活性，进而评价降解性能。从整体上看，处理SP，SPN5，SPN10，SPN20脱氢酶活性均高于处理处理S。第0天采样时，除了处理SPN20与对照处理S有显著性差异，其余处理均无显著性差异；在第7天采样时，各种处理都与对照处理S有显著性差异(P<0.05)，而各种处理之间并无显著性差异，可能是由于石油烃的氢原子活化并传递给特定的受氢体，实现石油烃的氧化和转化，导致处理之间的脱氢酶活性增高；第14天采样中，各种处理的脱氢酶活性降低，与对照处理S相比，处理SP、SPN5、SPN10和SPN20的脱氢酶活性增加约为19.19%、24.35%、37.32%和48.75%；第28天和第56天采样时，各种处理之间无显著性差异；第112天采样中，脱氢酶酶活性处理SP>SPN5>SPN10>S >SPN20，可能是因为食细菌线虫的增加，在一定程度上减少了污染土壤的石油浓度；第168天采样时，处理SP、SPN5、SPN10和SPN20与对照处理S无显著性差异，可能是由于污染土壤中易于分解的氢离子基本氧化和转化产生的结果。

2.4.3 不同密度模式线虫对脲酶活性的影响

如图6所示，脲酶活性在培养时间内总体呈现先上升后降低的趋势。第0天采样时，处理SP、SPN5、SPN10和SPN20脲酶活性差异性不大，可能是因为添加土壤中的石油和食细菌线虫，在第0天对土壤脲酶活性影响不大；第7 天采样时，处理SPN5、SPN10和SPN20的脲酶活性与对照处理S有显著性差异(P<0.05)，而SP与对照处理S无显著性差异，可能是由于添加其中的石油烃可以作为土壤微生物生长所需要的碳源，引起土壤微生物的大量繁殖，进一步促进了食细菌线虫数量的增多，从而脲酶活性急剧增加。第28天，56天采样中，处理SP，SPN5，SPN20，SPN20均高于对照处理S，可能是由于添加的石油，仍然再进一步刺激着土壤微生物的生长，影响脲酶的活性大小；在第112天采样中，处理SPN5，处理SPN10脲酶活性小于对照处理S，而处理SPN5、SPN10和SPN20之间并无显著性差异，与对照处理S相比，处理SP脲酶活性增加约6.14%，处理SPN5、SPN10和SPN20脲酶活性减少约7.20%、7.83%和2.52%；第168天采样时，各种处理与对照处理S之间并无显著性差异。脲酶活性的增大可能是因为土壤微生物利用石油烃为碳源使得活性增强。生物修复后期脲酶活性上升速率下降的原因可能是营养物质大量消耗，易降解的组份减少，多环芳烃（PAHS）含量相对增加。总体来看，食细菌线虫的投入能够促进脲酶活性的增加。

3 讨论

石油浓度的检测可以反映在一定时间内污染土壤的石油浓度状况，得出不同处理的土壤对于石油污染有不同的修复效果。从图1可以得出，第56天采样时，不同处理之间的石油浓度有显著性差异(P<0.05)，且处理SPN5的污染土壤石油浓度最低；实验第112天和168天时，处理SPN5较其他处理相比石油浓度更低，可以得出加入线虫对于降低污染土壤的石油浓度有一定的效果，但试验数据也表明并不是投入线虫数量越多，降低污染土壤的石油浓度越好，应该根据实际情况添加模式线虫来修复土壤。

酶是线虫影响土壤微生物活性的重要指标。土壤酶是土壤中一切生物化学过程中主要参与者，是生态系统物质循环和能量流动等过程中最活跃的生物活性物质。且土壤酶作为土壤重要的组成部分，在物质转化、能量代谢、污染土壤修复等过程中发挥着重要作用，被称为土壤生态系统的中心。由于土壤酶活性测定简便、快捷、准确，其活性受土壤污染状况和理化性质的共同影响，作为监测指标优势明显，并逐渐成为土壤环境质量监测的重要研究方向。土壤呼吸是土壤中生物学过程的宏观反映，而土壤酶活性则是土壤中生物学过程的微观反映，因而，土壤酶活性与土壤呼吸可能存在内在的联系，土壤酶活性的大小会影响土壤呼吸。

FDA水解酶在土壤质量评价中逐渐被广泛应用，主要是因为其与土壤微生物活性间的相关性比其他酶活性更显著，与总碳、全氮、全磷等土壤养分指标间关系密切，能够很好地反映系统中有机质的转化及土壤中微生物的活性，被认为是土壤健康质量的生物学指标之一。FDA水解酶在培养时间内的整体趋势是先上升后降低再上升。第168天采样时，处理SPN5，SPN10，SP与对照处理S无显著性差异，而处理SPN20与对照处理S有显著性差异(P<0.05)，得出接种食细菌线虫对于FDA水解酶活性有增强的影响，而处理SP可能是由于石油的存在的有毒物质抑制了土壤微生物的活性，所以处理SP的FDA水解酶活性一直低于其他处理的FDA水解酶活性。在实验采样后期，FDA水解酶活性降低，可能是由于石油中可被土壤微生物可利用的有机物用完，土壤微生物数量减少，导致食细菌线虫捕食减少，进一步影响FDA水解酶活性。

土壤脱氢酶对土壤物质的降解转化起催化脱氢作用，是表征土壤生态功能的一重要指标。脱氢酶活性大体表现为在培养时间内先上升后下降的趋势。可能是由于培养初期，石油烃的氢原子活化并传递给特定的受氢体，实现石油烃的氧化和转化；到了培养后期，石油烃的氢原子转化数量减少，导致脱氢酶活性后期呈下降趋势。

脲酶是一种酰胺酶，可酶促有机物质中碳氮键（CO-NH）的水解，对土壤氮素循环具有独特作用，其活性的提高可能有利于土壤中稳定性较高的有机氮向有效氮转化，从而改善土壤氮素供应状况。因此，土壤脲酶活性可表征土壤的氮素转化状况。Margesin等指出，柴油污染会导致土壤脲酶活性增加，而多环芳烃污染会导致脲酶活性降低。脲酶活性总体呈现出先上升后降低的趋势。第168天采样时，各种处理与对照处理S无显著性差异，总体来看，食细菌线虫的投入能够促进脲酶活性的增加。

4 结论

1）石油原油的添加可以为部分土壤微生物提供碳源，促进土壤微生物生物量碳的增加；一段时间内对土壤微生物的生长产生刺激作用；

2）食细菌线虫的投入对于土壤微生物代谢以及土壤酶活性有促进作用；

3）食细菌线虫能够在石油污染环境中刺激土壤微生物的繁殖，石油污染土壤投入食细菌线虫可以降低污染土壤的石油浓度。且石油污染土壤以干土计，1g干土投入5条食细菌线虫，降低土壤石油污染浓度效果最佳。