本发明属于有机污染物处理技术领域，尤其涉及一种利用刺桐叶粗酶液降解联苯胺的方法。
背景技术：
联苯胺为白色或微带淡黄色的稳定针状结晶或粉末，可燃，露置于空气中光线照射时颜色加深，市售商品常呈淡黄色。难溶于冷水，微溶于热水、乙醚，易溶于乙酸、稀盐酸。联苯胺是二元弱碱，一般常用的是联苯胺的盐类，工业上多用其硫酸盐，而实验室中多用盐酸盐和乙酸盐。联苯胺的化学性质与苯胺类似，能和氧化性的物质发生反应，生成醌型结构的衍生物；也可以与亚硝酸发生重氮化反应生成重氮盐，此盐与芳香胺或酚偶联，可得到多种染料。联苯胺是染料合成的重要中间体，从它可以合成超过300种染料，由于它的毒性很强，现已改用其他毒性较小的原料。但是目前代用的染料在使用性能和价格方面都无法与联苯胺合成的染料相比，所以市场用联苯胺来合成染料的产量越来越多，直接导致印染工业废水的增加，而且联苯胺以水溶液的形式存在时稳定性极高，可以长期残留，造成严重的环境污染。联苯胺可经呼吸道、肠道以及皮肤进入人体。对皮肤有刺激作用，能引起皮炎，长期接触会引起膀胱炎，甚至膀胱癌。刺桐是落叶大乔木，树皮灰褐色，枝有明显叶痕及短圆锥形的黑色直刺，髓部疏松，颓废部分成空腔。发明人在研究中发现刺桐叶片具有较高过氧化物酶活性，而过氧化物酶在胺类物质生物降解途径中能够发挥重要作用。为了探讨刺桐叶片过氧化物酶在清除水体中胺类物质的应用前景，开发其叶片经济价值，对刺桐叶片过氧化物酶进行了快速提取；在此基础上进一步考察了其对水体中胺类物质的去除效果及反应条件。对于联苯胺废水的处理，目前主要采用吸附法，利用H103大孔吸附树脂具有的很强吸附能力，吸附水体中的联苯胺，这是最简单的物理吸附法清除联苯胺。但由于吸附是一种物理过程，容易发生解吸附，此法并不能完全去除水体中联苯胺。另外常用的是采用二氧化氯氧化处理联苯胺类污染物废水。最终的COD去除率均达到了60％，联苯胺类化合物去除率均超过85％；虽然ClO2可以清除水体中的联苯胺，但是使用ClO2的生产费用较高，而且清除的过程也比较繁琐。ClO2是一种易爆炸气体。ClO2遇光时易分解生成氧和氯而引起爆炸，一般都是在现场现配现制。从而对ClO2的运输和储存带来一定的困难，这都制约着ClO2的普及使用。尽管ClO2在水处理中具有较广泛的应用和明显的优势，但在某些水质中同样会产生一些有毒副产物，例如醛类、亚氯酸盐、微量的卤化物和氯酸盐等。而这些毒副产物的生成条件和具体种类与具体的环境pH值、水质情况以及ClO2的投加量等有关系。除此之外，ClO2还可以与原水中某些含有双键的物质发生反应而生成可以产生微量的THMS(三卤甲烷trihalomethanes)和HAAS等有机卤代物的次氯酸。在特定条件下，ClO2还能与醇、氨基反应生成醛。研究发现经过ClO2氧化后，水中天然有机物产生甲醛、乙醛、甲基乙二醛和乙二醛等有毒副产物。河水、深层地下水、浅层地下水等三类水经ClO2处理后，总醛浓度会升高，主要是已被联合国卫生部认定为可疑致癌物的甲醛和乙醛。
综上所述，现有技术存在的问题是：使用ClO2的生产费用较高，清除的过程也比较繁琐，容易引起爆炸；同时，利用ClO2清除联苯胺过程中由于引入氯，可以产生次氯酸，由此带来一些有害的有机卤代物产生，这些都是采用化学清除法难以有效解决的难题。
技术实现要素：
针对现有化学处理技术存在的问题，本发明提供了一种利用刺桐叶粗酶液降解联苯胺的生物酶学方法。
本发明是这样实现的，一种利用刺桐叶粗酶液降解联苯胺的方法，所述利用刺桐叶粗酶液降解联苯胺的方法包括：
步骤一，称取5g新鲜成熟的刺桐叶片，去除主脉，剪碎，用25ml的pH6.8磷酸缓冲液研磨提取过氧化物酶，离心取上清液，上清液即为粗酶液，将上清液放置在冰箱中冷藏；
步骤二，酶活的测定方法：采用愈创木酚法，加入0.1ml酶液启动反应，于波长470nm，30℃下记录OD值变化；
步骤三，刺桐叶过氧化物酶降解联苯胺。
进一步，所述步骤三具体包括；反应体系为20mL，联苯胺浓度0.2mmol/L，加入一定量的刺桐粗酶液，一定量的H2O2和不同pH的磷酸缓冲液，在不同的温度降解联苯胺。取反应时间为0min、1min、3min、5min、15min、45min、90min、120min和180min的反应液1mL，加入1mL甲醇终止反应，测定混合液中联苯胺含量，考察刺桐粗酶液对联苯胺的降解率。
进一步，所述反应体系的酶量为5U/mL；1个酶单位定义为测定条件下每分钟OD470变化0.1所需的酶量。
进一步，所述反应体系的pH为7。
进一步，所述反应体系的温度为30℃。
进一步，所述反应体系的H2O2与联苯胺浓度比值为3。
本发明制备刺桐粗酶液，加入pH 6.8的磷酸缓冲液，联苯胺溶液，双氧水溶液，控制反应体系pH值为5～7，反应180min，即实现刺桐粗酶液对联苯胺的降解。本发明克服了ClO2氧化法操作复杂、反应条件剧烈和净化能力差等缺点，提供了一种绿色环保、高效率的方法，具有广阔的工业前景。刺桐作为景观植物广泛栽植，资源丰富，在人们日常生活中比较容易获得。酶促反应具有催化效率高、反应条件温和、可调节性等特点，应用刺桐叶片粗酶液降解联苯胺有成本低、绿色、安全、无污染的显著优势。
附图说明
图1是本发明实施例提供的利用刺桐叶粗酶液降解联苯胺的方法流程图。
图2是本发明实施例提供的不同浓度刺桐粗酶对联苯胺清除的影响示意图。
图3是本发明实施例提供的不同pH缓冲液对刺桐粗酶清除联苯胺的影响示意图。
图4是本发明实施例提供的不同温度对刺桐粗酶清除联苯胺的影响示意图。
图5是本发明实施例提供的不同浓度H2O2对刺桐粗酶清除联苯胺的影响示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的利用刺桐叶粗酶液降解联苯胺的方法包括以下步骤：
S101：采摘刺桐新鲜叶片5g，用25ml磷酸缓冲液研磨，在4℃12000r/min的离心机下离心10min，离心之后取得的上清液，即得刺桐粗酶；
S102：得到刺桐粗酶后，利用愈创木酚法在过氧化物酶催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。加0.1ml刺桐粗酶在酶活反应液启动反应，于波长470nm，30℃下记录吸光度值变化(1个酶单位定义为测定条件下每分钟OD470变化0.1所需的酶量)。重复3次，取其平均值。
本发明实施中的反应体系为20mL，加入4mL 1mmol/L联苯胺，加入一定量的刺桐粗酶，一定量的H2O2和pH不同缓冲液。研究在不同酶量，不同pH缓冲液，不同温度和不同H2O2浓度下进行降解联苯胺。取反应时间为0min、1min、3min、5min、15min、45min、90min、120min和180min的反应液样品，加入1mL甲醇终止反应。之后加入8μl KAl(SO4)2，取完后放入冰箱中12小时。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
实施例1不同浓度刺桐粗酶对联苯胺清除的影响
取刺桐粗酶测定刺桐POD(过氧化物酶)的酶活
取联苯胺4ml,分别取10U，5U，2U的酶活力单位所对应的刺桐酶液为42μL、26μL、10.4μL，pH 6.0磷酸缓冲液15.942mL、15.958mL、15.974mL，1mg/L H2O216μL；
在每个试管中装入1ml甲醇后分别取一个对照(0min)、1min、3min、5min、15min、45min、90min、120min、180min时的样各1mL，分别加入8μL KAl(SO4)2，取完后放入冰箱中12小时。之后在4℃12000r/min的离心机下离心10min。
用液相色谱测定联苯胺的含量。
从图2可以看出，酶活力单位为10U时，在第一分钟时清除率就达到了90％以上；酶活力单位为5U时1分钟的清除率要低于酶活力单位为10U时清除率，在5U的条件下，联苯胺在120min时就检测不出来了，10U的条件下在90min之后峰值也检测不到了，说明了酶活力单位为10U时的清除能力非常强，速度非常快。从图2中可以看出，酶活力单位为10U时，从1分钟到180分钟折线的走势非常平缓，也说明了在1分钟内联苯胺就基本清除完全。综合10U，5U，2U的实验数据分析结果，5U的酶活力单位所对应的酶浓度时最合适的。这样可以在同等清除效果下，节省一半酶量。
实施例2不同pH缓冲液对刺桐粗酶清除联苯胺的影响
测得新鲜刺桐粗酶的酶活
取联苯胺4ml，取5U的酶活力单位所对应的刺桐酶液，采用pH 3.0，pH4.0，pH 5.0，pH 7.0，pH 8.0，pH 9.0的缓冲液和1mg/L H2O216μL。pH 3.0采用柠檬酸缓冲液，pH 4.0、5.0采用乙酸缓冲液，pH 6.0-8.0采用磷酸盐缓冲体系，pH 9.0采用硼酸盐缓冲液。
在每个试管中装入1ml甲醇后分别取一个对照(0min)、1min、3min、5min、15min、45min、90min、120min、180min时的样品各1mL，分别加入8μLKAl(SO4)2，取完后放入冰箱中12小时。之后在4℃12000r/min的离心机下离心10min。
用液相色谱测定联苯胺的含量。
从图3中可以看到，在pH 7.0的条件下清除率最好，在1分钟内pH 7条件下的清除率最大，1分钟内的清除率达到80％以上，5分钟清除率达到90％。虽然3h后除pH 4.0以外，其他pH条件下最后的清除率都达到了90％以上，但pH 7和pH 8条件下在15min后曲线基本走平，说明联苯胺在15min后基本清除完，pH 6条件下在90min后曲线基本走平；pH 5和pH 9条件下在120min后走平，故pH 7，pH 8条件下的过氧化物酶清除联苯胺的速度最快。而在pH7条件下从图3中可以看出总体的清除效果较pH 8条件下要强，所以综合来看在pH 7条件下过氧化物酶清除联苯胺的效果最好。
实施例3不同温度对刺桐粗酶清除联苯胺的影响
测得新鲜刺桐粗酶的酶活
取联苯胺4ml，取5U的酶活力单位所对应的刺桐酶液，取pH为7.0的磷酸缓冲液和1mg/L H2O2条件下，改变反应体系的温度，分别将反应体系放置在温度为25℃，30℃，40℃，45℃，50℃的水浴锅中。
在每个试管中装入1ml甲醇后分别取一个对照(0min)、1min、3min、5min、15min、45min、90min、120min、180min时的反应混合液1mL，分别加入8μL KAl(SO4)2，取完后放入冰箱中12小时。之后在4℃12000r/min的离心机下离心10min。
用液相色谱测定联苯胺的含量。
从图4中可以看到，在30℃的条件下清除效果最好，在1分钟内30℃条件下的清除率最大，1分钟内的清除率达到80％以上，5分钟清除率达到90％。虽然3h后除50℃以外，其他温度条件下最后的清除率都达到了100％以上，但30℃条件下在45min后曲线基本走平，说明联苯胺在45min后基本清除完毕，35℃条件下在90min后曲线基本走平；40℃、45℃和50℃条件下在15min后走平，故25℃和30℃条件下的过氧化物酶清除联苯胺的速度最快。所以在25℃～30℃件下过氧化物酶清除联苯胺的效果好。
实施例4不同浓度H2O2对刺桐粗酶清除联苯胺的影响
测得新鲜刺桐粗酶的酶活
取联苯胺4ml，取5U的酶活力单位所对应的刺桐酶液，取pH为7.0的磷酸缓冲液温度为30℃的条件下，改变反应体系的H2O2，分别将反应体系中加入H2O2为0.2倍，0.5倍，0.8倍，1.2倍，2倍，3倍，5倍联苯胺浓度的30℃水浴锅中。
在每个试管中装入1ml甲醇后分别取一个对照(0min)、1min、3min、5min、15min、45min、90min、120min、180min时混合反应液1mL，分别加入8μL KAl(SO4)2，放入冰箱中12小时。之后在4℃12000r/min的离心机下离心10min。
用液相色谱测定联苯胺的含量。
从图5中可以看到，在1分钟内3倍条件下的清除率最大，而且清除的效果也很好，5分钟内的清除率达到80％以上，15分钟清除率达到90％。虽然3h后除0.2倍、05倍、0.8倍、1.2倍以外，其他H2O2浓度条件下最后的清除率都达到了100％以上，3倍和5倍条件下在15min后走平，故3倍和5倍条件下的过氧化物酶清除联苯胺的速度最快。而在5倍条件下所需的H2O2太多，造成不必要浪费，所以综合来看H2O2在3倍条件下过氧化物酶清除联苯胺的效果最好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。