专利名称：一种果胶酶亲和吸附剂的制备方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域。
果胶酶是一种工业用酶制剂，它的主要性质是降解果胶物质。果胶酶这一性质主要应用于果汁加工和果酒酿造。此外，果胶酶在茶和咖啡的发酵、桔子脱囊衣、麻料脱胶、废水处理、造纸、榨油等领域也有应用。作者最近申请的一项发明专利成功地将其应用于诱导植物抗病。
果胶酶的生产主要是用微生物发酵得到。由于微生物发酵过程中代谢产物比较复杂，培养基成为也很复杂，因此微生物发酵所得到的果胶酶粗提物中杂质含量非常高，纯化果胶酶相当困难。果胶酶的纯化方法主要有有机溶剂沉淀、盐析、离子交换柱层析、凝胶过滤柱层析、亲和层析、凝胶电泳等。其中，以亲和层析效率最高。目前文献报道的果胶酶亲和吸附剂的制备方法是以高分子量的果胶酸钠或海藻酸钠为配基，用表氯醇将其交联制得。但是，高分子量的果胶酸钠和海藻酸钠的价格比较昂贵，并且用其制备的亲和吸附剂容易在流动相条件改变时大幅度地膨胀或收缩，造成流速不稳定，影响分离效果。
本发明采用果胶含量较高的生物质作为配基和载体，用表氯醇将配基交联制得果胶酶亲和吸附剂。许多农业废弃物以及农副产品产品加工废弃物中果胶含量较高，都可以作为该亲和吸附剂的配基和载体，因此该类配基和载体廉价易得。这些生物质的组成成分主要是果胶、纤维素、半纤维素、木质素等，果胶可作为亲和吸附剂配基，纤维素、半纤维素、木质素等可作为配体的载体，因此由生物质制备的亲和吸附剂不仅具有对果胶酶良好的亲和能力，而且在流动相条件改变时不易膨胀或收缩，流速稳定，便于操作。
本发明所述的果胶酶亲和吸附剂制备方法内容如下1、生物质粉碎将果胶含量较高的生物质(如甜菜渣、葵花盘、橘皮、水果渣等)烘干、粉碎、过筛，将60目以下部分收集，备用。
2、配基制备将生物质粉末用水浸泡1小时，抽滤，如此反复清洗3次。再用95％乙醇洗一次，于4℃下加入10倍体积95％乙醇-水(3∶1)溶液，搅拌。搅拌过程中，每隔1h加入2.5倍体积的2M NaOH的乙醇-水(3∶1)溶液，共加四次。最后一次加入后搅拌3小时。用G3砂芯漏斗过滤，然后再溶于20倍体积的0.5M NaOH的乙醇-水(3∶1)溶液，于4℃下搅拌过夜。用乙醇-水(3∶1)洗至中性，再用95％乙醇洗，空气中干燥恒重。
3、交联将第2步骤所得产物溶于0.5倍体积表氯醇和5倍体积95％乙醇混和液，加1倍体积5M NaOH，悬浊液倒入锥形瓶中，加盖，摇床上150转/分钟，45℃，震摇6小时。从摇床取出，用1M乙酸中和至pH7，中止反应。G3砂芯漏斗抽滤。用乙醇-水(3∶1)洗涤，再用95％乙醇洗涤。空气中干燥恒重。产品悬浊于蒸馏水中，搅拌，静置。倾去上清液，G3砂芯漏斗过滤，95％乙醇洗涤。空气中干燥恒重，得到均一粉末，即果胶酶亲和吸附剂。
实施例1以甜菜渣为原料制备果胶酶亲和吸附剂将甜菜渣在65℃烘干、粉碎、过筛，将60目以下部分收集，备用。
取10g过筛的甜菜渣用水浸泡、清洗，乙醇洗后，于4℃下加入100ml95％乙醇-水(3∶1)溶液，搅拌过程中，每隔1h分四次加入共100ml 2M NaOH的乙醇-水(3∶1)溶液，每次25ml，最后一次加入后搅拌3小时。用G3砂芯漏斗过滤，然后再溶于200ml 0.5M NaOH的乙醇-水(3∶1)溶液，于4℃下搅拌过夜。用乙醇-水(3∶1)洗至中性，再用95％乙醇洗，空气中干燥恒重。
将上述步骤得到的产物溶于5ml表氯醇和50ml 95％乙醇混和液，加10ml 5M NaOH，悬浊液倒入250ml有盖锥形瓶中，摇床上摇6h，45℃。从摇床取出，用1M乙酸中和至pH7，中止反应。G3砂芯漏斗抽滤。60ml乙醇-水(3∶1)洗涤，再40ml 95％乙醇洗。空气中干燥恒重。产品悬浊于150ml蒸馏水中，搅拌，静置1min。倾去上清液，G3砂芯漏斗过滤，60ml 95％乙醇洗涤。空气中干燥恒重，及得果胶酶亲和吸附剂。
实施例2用果胶酶亲和吸附剂对果胶酶进行亲和层析纯化将制备好的果胶酶亲和吸附剂装层析柱(直径16mm，长300mm)，先用0.02M pH4.3乙酸-乙酸钠缓冲液平衡，将微生物发酵得到的粗酶液10毫升上柱，流速30ml/h，继续用平衡缓冲液洗脱。洗脱液经紫外检测仪在280nm波长下检测。出一个峰后，改用0.1M pH5.6乙酸-乙酸钠含1M NaCl的缓冲液洗脱。收集各组分，测定其果胶酶活性。
对亲和柱层析所得到的各吸收峰样品进行聚半乳糖醛酸酶(果胶酶的主要成分)活性测定后，可知第一个较大的吸收峰没有该酶活性；这表明第一个峰是杂质，果胶酶吸附在亲和吸附剂上。缓冲液加入较高浓度NaCl后，洗脱出来的峰果胶酶活性较高，可以回收到上柱前的全部酶活；这表明果胶酶在亲和吸附剂上的解离也比较容易。
经亲和层析纯化的果胶酶比酶活都有很大的提高(见下表)。果胶酶生产菌种 粗酶液的比酶活(u/ml) 亲和层析后比酶活(u/ml)纯化倍数草酸青霉 3818 9490 2.5黑曲霉 118 2174 18.权利要求
1.一种果胶酶亲和吸附剂的制备方法，其特征在于，以果胶质含量较高的生物质作为配基和载体，去甲酯后用表氯醇交联制得。
2.权利要求书1所述的果胶酶亲和吸附剂的制备方法，其特征在于，所用原料为果胶质含量较高的各种生物质，如甜菜渣、葵花盘、水果渣等。
3.权利要求书1所述的果胶酶亲和吸附剂的制备方法，其特征在于，其制备步骤是生物质→粉碎→去甲酯→表氯醇交联→干燥
4.如权利要求书1所述果胶酶亲和吸附剂的制备方法，其特征在于，经以上步骤所得果胶酶亲和吸附剂可用于纯化各种来源的果胶酶。
全文摘要
本发明为一种以果胶质含量较高的生物质为原料用表氯醇交联制备果胶酶亲和吸附剂的方法，属于生物化工领域。发明以甜菜废渣、葵花盘、水果渣等果胶质含量较高的生物质作为配基和载体，去甲酯后用表氯醇交联，制得果胶酶亲和吸附剂。用该方法制备的果胶酶亲和吸附剂对不同微生物发酵所得果胶酶粗酶液进行亲和层析，都有较高的纯化效率。
文档编号B01J20/22GK1475566SQ03149599
公开日2004年2月18日 申请日期2003年7月18日 优先权日2003年7月18日
发明者张洪勋, 白志辉, 贾月 申请人:中国科学院生态环境研究中心