专利名称：以四唑为功能基的多用途分离介质及其制备方法
技术领域：
本发明属于色谱分离技术领域，具体涉及以四唑为功能基的多用途分离 介质及其制备方法。
背景技术：
色谱分离技术是生物工程领域内生物大分子分离的常用方法之一。在该方法中，分离介质是整个分离技术中的关键材料，其消耗占生产成本的50% 左右。.目前，用于生物大分子色谱分离的模式主要有反相色谱、疏水相互作 用色谱、离子交换色谱、亲和色谱(包括金属螯合色谱)和排阻色谱。离子 交换色谱(IEC)是其中最为常用的方法。众所周知，根据固定相上离子交换 基团的带电性质，IEC固定相可分为阳离子交换和阴离子交换色谱固定相；根 据交换基团的解离程度，又分为强阳/强阴离子和弱阳/弱阴离子交换色谱固定 相。目前，弱阳离子交换固定相上的交换基团包括羧基和磷酸基。蛋白质在 该类固定相上的保留不仅取决于其表面带电荷的性质和数量，而且与固定相 上羧基或磷酸基的解离程度有关。所以，在建立蛋白质的分离条件时，可以 选择合适的pH值使蛋白质获得选择性分离。但是，随着蛋白质组学、代谢组 学和基因工程的发展，现有固定相因选择性差，不能满足复杂生物样品分离 的需要。因此，发展特殊性他的功能分离介质依然是色谱研究中面临的挑战。金属螯合色谱是依靠周定相上的配体与过渡金属离子螯合，然后蛋白质 再与金属离子螯合，根据螯合作用力的强弱对生物大分子进行选择性分离的 方法，在血清蛋白分离中有广泛应用。在该方法中，影响分离选择性地因素 主要有配体结构,金属离子种类和色谱流动相组成。目前，固定相上的配 体种类主要有(i)二齿配体，如水扬醛(salicylaldehyde),氨羟基酰胺酸(aminohydroxamic acid)或8-羟基喹啉(8勿droxy-quinoline); (ii)三齿酉己体, 如o-嫌酸丝氨酸(wAo-phosphoserine)，吡P定二胺(dipicolylamine), 或frara-羧基-甲基脯氨酸(c/s画 or fra"s-carboxy-methylproline)， 氨基二乙酸 (Iminodiacetic acid)和N- (2國吡甲基)氨基乙酸(N- (2-pyridylmethyl) aminiacetate); (iii)四齿酉己体,如氨三乙酸(N- (2-pyridylmethyl) aminiacetate );和(iv) 五齿配体，如 Agvgv-三-(羧甲基)乙烯二胺(iV，A^/V-tris-(carboxy-methyl)ethylenediamine )。 这些配体与金属结合的强度 和对蛋白质的选择性各异。同时，这些配体依然存在着金属离子流失的风险， 而且用途单一。发明内容本发明的目,.的之一是提供一种使用寿命长、易于再生的新型多用途色谱 分离介质，该分离介质既可以作为离子交换分离介质使用，也可以作为金属 螯合色谱分离介质使用。本发明的另一目的是提供上述多用途色谱分离介质的制备方法。本发明的实现过程如下.以四唑为功能基的多用途分离介质，具有如下结构通式^^OCH2-CH-CH2-R"！ \^WN'R2代表硅胶、琼脂糖或葡聚糖；R,为O或NH; 112为H、 Cr C4 的烷基、苯基或苄基。上述多用途分离介质的制备方法硅胶与？缩水甘油醚氧丙基三乙氧基 硅烷反应，合成表面键合环氧基的硅胶，然后与a-氨基四唑或ot-羟基四唑在 碱或三氟化硼乙醚催化剂作用下反应即得四唑多用途分离介质；所述的a-氨基四唑结构如下<formula>formula see original document page 6</formula>R2R2为H、 d-C4的烷基、苯基或节基; 所述的a-羟基四唑结构如下<formula>formula see original document page 6</formula>R2R2为H、 d-C4的烷基、苯基或节基。 葡聚糖或琼脂糖凝胶与环氧氯丙烷反应，合成表面键合环氧基的葡聚糖 或琼脂糖凝胶，然后与a-氨基四唑或a-羟基四唑在碱或三氟化硼乙醚催化作 用下反应即得四唑多用途分离介质； 所述的a-氨基四唑结构如下硅胶与Y-缩水甘油醚氧丙基三乙氧基硅烷反应，合成表面键合环氧基的 硅胶，然后在三氟化硼乙醚催化下与a-羟基腈反应，在键合a-羟基腈的硅胶 中，加入DMF、 NaN3和NH4Cl反应即得四唑多用途分离介质。葡聚糖或琼脂糖凝胶与环氧氯丙烷反应，合成表面键合环氧基的葡聚糖 或琼脂糖凝胶，然后在三氟化硼乙醚催化下与oc-羟基腈反应，在键合a-羟基 腈的葡聚糖或琼脂糖凝胶中，加入DMF、 NaN3和NH4Cl反应即得四唑多用 途分离介质。本发明用化学方法将四唑键合在硅胶、葡聚糖和琼脂糖凝胶分离基质表 面，制备了一种结构新颖的分离介质，当该介质未螯合金属离子时可以作为 离子交换分离介质使用，若螯合上金属离子后又可以作为金属螯合色谱分离 介质使用。本发明的优点与积极效果(1) 本发明多用途分离介质具有在离子交换色谱和金属螯合色谱上应用的双重功能；(2) 本发明多用途分离介质用于蛋白质的离子交换分离，蛋白质的选分离 择性高、蛋白质量和活性回收率高；用于蛋白质的金属螯合色谱，蛋白质的 选分离择性高，金属离子流失小，分离速度快，白质量和活性回收率髙。在 室温下，溶菌酶的活性回收率>95%。肌红蛋白、核糖核酸、cx-糜蛋白酶原-A、 细胞色素-<:和溶菌酶的质量回收率>95%。螯合上Ci^+,连续使用2天，Cu2+ 离子的螯合量损失小于5%。该多用途分离介质可广泛应用于蛋白、酶和生物 工程产品的分离纯化。(3) 本发明多用途分离介质使用寿命长。硅胶介质在pJ^2.0-8.0情况下、 葡聚糖介质在pH=1.0-12.0情况下使用1000小时，经清洗后，分离性能未见 改变。U)本发明多用途分离介质很容易再生，只要用IO倍体积lmol/L氯化钠 洗涤剂可再生使用，不象一些商品柱要在每次进样后用氢氧化钠再生。(5 )生物工程产品的尿素提取也可以直接上样， 一步分离达到了较高纯度。
图1为蛋白质在oc-氨基苯丙四唑填料(硅胶基质)上的离子交换色谱分 离图。图2为蛋白质在a-羟基苯乙四唑填料(硅胶基质)上的离子交换色谱分 离图。图3为蛋白在Z^+螯合的ot-氨基苯丙四唑填料(硅胶基质)上的金属螯 合色谱4为蛋白在Zi^+螯合的a-羟基苯乙四唑填料(硅胶基质)上的金属螯 合色谱图'图5为基因工程产品重组人干扰素i的8mol/L脲提取液分离图具体实施方式
合成多用途四唑固定相所用的主要原料大孔硅胶(7pm,孔径30nm)、 交联琼脂糖凝胶(西安交大保赛生物技术股份有限公司)、交联葡聚糖凝胶(上 海君创生物科技精细化工产品)，Y-缩水甘油醚氧丙基三乙氧基硅烷，2-羟基 丙腈，羟基乙腈，a-羟基苯乙腈，叠氮化钠和环氧氯丙垸为巿售商品。使用的a-氨基四唑和a-羟基四唑按下述方法制备(1 ) a-氨基四唑的制备(R2可选择CH2CH(CH3)2，CH(CH3)2,CH3，C6H5， CH(CH3)CH2CH3或CH2C6H5)FmocHN 、 RN''N、,NH N-，、NH '^=N' 30%三乙胺的甲醇溶液 H2N\^^~~M'R2a-氨基四唑ot-氨基四唑的合成路线以Fmoc保护的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸为起始原 料，按照文献方法(Huo Ya歸in， Lei Genhu， Zheng Xiaohui， Wei Yinmao. Synthesis and characterization of the tetrazole analogues of a-amino acids. CTz/w^je C72ew/ca/丄e股ra, 2006, 17(12), 1537-1539 )，分别制备Fmoc保护的a-氨基四唑。 将Fmoc保护的a-氨基四唑(2.5mmo1)， lOOmL 20%-50%三乙胺的甲醇溶液加 入到250mL的圆底烧瓶，室温搅拌30min。反应完毕后蒸发溶剂，加入适量 的0.5mol.L"的盐酸直到无固体溶解为止，用石油醚萃取除去不溶物，收集四 唑的盐酸溶液，用NaOH溶液中和至中性，即有白色四唑固体析出。将固液 混和物放入冰箱过夜，过滤，收集固体，6(TC真空干燥，即得最终产物a-氨 基四哇。(2) a-羟基四唑的制备(R2可选择H、苯基或甲基)<formula>formula see original document page 9</formula>a-第圣基四唑 a-羟基四唾的合成路线在500mL的圆底烧瓶中，加入a-羟基腈(5mmo1),再加入200mL异丙 醇，8(TC加热溶解。再加入lOOmL水，NaN3(3.25g,50mmol)和ZnBr2(3.25g， 12.5 mmol),反应混合物在8(TC回流搅拌48小时。反应完毕，向反应混合物中加 入35mL3mo1.1/1 HC1，用lOOmL乙酸乙酯萃取(加适量的NaCl盐析分层)， 分出有机层，水相层再用2xl00mL的乙酸乙酯萃取，合并有机层，蒸发得到 四唑固体。用硅胶柱纯化产品，洗脱剂为1:1:1甲醇/乙酸乙酯/石油醚。用旋 转蒸发仪蒸发溶剂，3(TC真空干燥得淡黄色产品。<formula>formula see original document page 9</formula>
实施例1: a-氨基四唑为配体的硅胶分离介质的制备<formula>formula see original document page 9</formula>硅胶<formula>formula see original document page 9</formula>a-氨基四唑为配体的硅胶分离介质的制备路线称取2克大孔硅胶，加入30mLl:l盐酸，超声5min，然后在IO(TC下油 浴回流3小时，反应完毕，过滤，用蒸馏水洗涤至中性，在13(TC干燥4h。 将该硅胶加入到lOOmL三颈瓶中，加入35mL干燥甲苯，超声5min,温度升 到120。C后，搅拌下用滴液漏斗滴加1.8mLY-縮水甘油醚氧丙基三乙氧基硅烷， 回流反应12小时。反应完毕，过滤，用干燥甲苯洗3次，丙酮洗4次。50°C 真空干燥备用。在干燥的环氧基硅胶中，加入30mLDMF, 0.5ga-氨基苯丙四唑和O.lmL吡啶，室温搅拌24h。反应完毕，依次用丙酮、水洗涤，真空干燥，即得四唑多用途分离介质。实施例2: a-氨基四唑为配体的琼脂糖(或葡聚糖)分离介质的制备a-氨基四唑为配体的琼脂糖(或葡聚糖)分离介质的制备路线取10mL琼脂糖(或葡聚糖)于100mL三颈瓶中，加入50mL 5%NaOH 和5.0mL环氧氯丙烷，反应12h。反应完毕，用磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤， 获得表面键合环氧基的琼脂糖(或葡聚糖)。在环氧基琼脂糖(或葡聚糖) 中，加入50mLDMF, 1.5g a-氨基苯丙四唑和l.OmL吡嚏，室温搅拌24h。 反应完毕，依次用磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤，即得四唑琼脂糖(或葡聚糖) 色谱分离介质。实施例3、以a-羟基四唑为配体的硅胶分离介质的制备称取2克7nm大孔硅胶，加入30mLl:l盐酸，超声5min,然后在IO(TC 下油浴回流3小时，反应完毕，过滤，用蒸馏水洗涤至中性，在13(TC干燥 4h。将该硅胶加入到100mL三颈瓶中，加入35mL干燥甲苯，超声5min，温:9—(ch2>3och2-c—ch.6c2h5 ha-羟基四唑为配体的硅胶分离介质的制备路线度升到120'C后，搅拌下用滴液漏斗滴加1.8mL 缩甘油醚氧丙基-三乙氧基硅 烷，反应12小时。反应完毕，过滤，用干燥甲苯洗3次，丙酮洗4次。50°C 真空干燥备用。在干燥的环氧基硅胶中，加30mL1.4-二氧六环，0.5ga-羟基苯乙四哇， 0.5mL三氟化硼乙醚溶液，室温下搅拌反应14h。反应完毕，依次用丙酮、水 洗涤，真空干燥，得a-羟基四唑硅胶色谱分离介质固定相。实施例4、以a-羟基四唑为配体的琼脂糖(或葡聚糖)分离介质的制备<formula>formula see original document page 11</formula>琼脂糖(或葡聚糖) uot-氨基四唑为配体的琼脂糖(或葡聚糖)分离介质的制备路线取lOmL琼脂糖(或葡聚糖)于100mL三颈瓶中，加入50mL 5%NaOH 和5.0mL环氧氯丙烷，反应12h。反应完毕，用磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤， 即得表面键合环氧基的琼脂糖(或葡聚糖)。干燥后，加入50mL 1.4-二氧六 环，1.5ga-羟基苯乙四唑，1.5mL三氟化硼乙醚溶液，室温下搅拌反应14h。 反应完毕，依次用丙酮、水洗涤，得a-羟基四唑琼脂糖(或葡聚糖)色谱分 离介质。实施例5、固相合成法制备以a-羟基四唑为配体的硅胶分离介质<formula>formula see original document page 12</formula>固相合成法制备四唑基硅胶分离介质的制备路线称取2克7^im大孔硅胶，加入30mLl:l盐酸，超声5min,然后在100°c 下油洛回流3小时，反应完毕，过滤，用蒸馏水洗涤至中性，在13(tc干燥 4h。将该硅胶加入到lOOmL三颈瓶中，加入35mL干燥甲苯，超声5min，温 度升到120'c后，搅拌下用滴液漏斗滴加1.8mL 缩甘油醚基丙基-三乙氧基硅 烷，反应12小时。反应完毕，过滤，用干燥甲苯洗3次，丙酮洗4次。5(tc 真空干燥备用。在干燥的环氧基硅胶中，加30mL 1.4-二氧六环，1.5mL3-羟基丙腈，0.5mL 三氟化硼乙醚溶液，室温下搅拌反应14h。反应完毕，依次用丙酮、水洗涤， 真空干燥。在键合2-羟基丙腈的硅胶中，加入30mL水、2.5gNaN3和l.Og NH4Cl， 8(tc拌反应30h。反应完毕，用水洗涤至中性，真空干燥，即得a-羟 基四唑硅胶分离介质。实施例6、固相合成法制备以oc-氨基四唑为配体的琼脂糖(或葡聚糖)分 离介质<formula>formula see original document page 13</formula>固相合成法制备四唑基琼脂糖(或葡聚糖)分离介质的制备路线取10mL葡聚糖于lOOmL三颈瓶中，加入50mL 5%NaOH和5.0mL环氧 氯丙烷，反应12h。反应完毕，用磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤，即得表面键合 环氧基的葡聚糖。千燥后，加50mL1.4-二氧六环，3.0mL3-羟基丙腈，1.5mL 三氟化硼乙醚溶液，室温下搅拌反应14h。反应完毕，用水洗涤，然后在键合 2-羟基丙腈的硅胶中，加入50mL水、5.0g NaNs和2.0g NH4CI, 30。C拌反应 30h。反应完毕，用水洗涤至中性，真空干燥，即得a-羟基酸四唑葡聚糖分离 介质。实施例7:使用实施例1中制备得到的分离介质，用于蛋白质的离子交换色谱分离， 结果如附图1所示，可以看出该分离介质对四种混合蛋白具有良好的分离性 能。色谱条件为色谱柱50x4.6mm不锈钢柱；流动相A(平衡液)，20mmo1/1 磷酸二氢钾(pH 6.0)，流动相B(洗脱液)A + 0.5mol/l NaCl(pH 6.0);流动相流 速l.Oml/min;线性梯度20min, 100°/oA- 100%B, 100%B延长lOmin.标准蛋 白l.肌红蛋白；2.a-糜蛋白-A; 3.细胞色素-C; 4,溶菌酶。实施例8:使用实施例3中制备得到的分离介质，用于蛋白质的离子交换色谱分离， 结果如附图2所示，可以看出该分离介质对四种混合蛋白具有良好的分离性能，且分离柱效较高。色谱条件为色谱柱50x4.6mm不锈钢柱；流动相A(平衡液)，20mmol/l 磷酸二氢钾(pH7.5);流动相B(洗脱液):A + 0.5mol/lNaCl(pH7.5); 3、流动相 流速3ml/min， 4、线性梯度20min， 100%A- 100%B, 100%B延长10min;标准 蛋白l.肌红蛋白；2.核糖核酸酶-A; 3.细胞色素-C; 4,溶菌酶。实施例9:使用实施例1中制备得到的分离介质，按照文献方法(WEI Yinmao*, Huang Xiaodong, W a/. / Zi《.CAn matogT: T^c/wo/., 2001，24(19):2983-2998)螯合Zn2+，得到螯合Zr^+的ct-氨基苯丙四唑填料。该金属 螯合分离介质对蛋白质的分离如附图3所示，可以看出该分离介质对四种混 合蛋白具有良好的分离性能。色谱条件为色谱柱50x4.6mm不锈钢柱；流动相A(平衡液)，50mmol/l 磷酸二氢钾(pH6.0);流动相B(洗脱液)，A+1.0mol/lNaCl(pH6.0);流动相流 速l.Oml/min;线性梯度20min，线性梯度20min， 100%A- 100%B， 100%B延 长10min.;标准蛋白l.MyO, 2. RNase-A, 3. 4. Cyt-C， 5.1ys。实施例10:使用实施例3中制备得到的分离介质，按照文献方法(WEI Yinmao*, Huang Xiaodong, W a/. / Zi . CTwrwwfogy: <fe 7fec/2"o/.， 2001，24(19):2983-2998)螯合Zn2+，得到螯合Zn"的a-羟基苯乙四唑填料。该金属 螯合分离介质对蛋白质的分离如附图4所示，可以看出该分离介质对五种混 合蛋白具有良好的分离性能，且分离柱效较髙。。色谱条件为色谱柱5.0x4.6 cm不锈钢柱；流动相A(平衡液)，50mmol/l 磷酸二氢钾(pH6.0),流动相B(洗脱液)，A + 0.5mol/lNaCl(pH6.0);流动相流 速lml/min;线性梯度20min，线性梯度20min， 100%A- 100%B， 100%B延长 lOmin.;标准蛋白l.肌红蛋白；2.a-糜蛋白-A; 3核糖核酸酶-A; 4.细胞色 素-C; 5，溶菌酶实施例11:使用实施例1中制备得到的分离介质，用于基因工程产品重组人干扰素-Y 的8mol/L脲提取液的分离，结果如附图5所示，可以看出干扰素-Y获得了良 好分离。色谱条件为固定相Zn"螯合的ot-氨基苯丙四唑硅胶；色谱柱50x4，6mm 不锈钢柱；流动相A:(平衡液)，50mmol/l磷酸二氢钾(pH6.0),流动相B(洗 脱液)，A + 0.5mol/lNaCl(pH6.0);流动相流速lml/min线性梯度20min，线性 梯度20min， 100%A- 100°/。B, 100%B延长10min。 *纯化后重组人干扰素-y， 纯度为90%。
权利要求
1、以四唑为功能基的多用途分离介质，具有如下结构通式代表硅胶、琼脂糖或葡聚糖；R1为O或NH；R2为H、C1-C4的烷基、苯基或苄基。
2、 根据权利要求l所述的多用途分离介质，其特征在于R2为氢原子、甲 基、异丙基或异丁基。
3、 根据权利要求1所述的多用途分离介质，其特征在于R2为苯基或节基。
4、 权利要求l所述的多用途分离介质的制备方法，其特征在于硅狡与y-缩水甘油醚氧丙基三乙氧基硅烷反应，合成表面键合环氧基的硅胶，然后与a-氨基四唑或a-羟基四唑在碱或三氟化硼乙醚催化剂作用下反应即得四哇多用途 分离介质；所述的a-氨基四唑结构如下<formula>formula see original document page 2</formula> R2为H、 CrQ的烷基、苯基或节基; 所述的a-羟基四哇结构如下ffN、NHR2 R2为H、 CrQ的烷基、苯基或节基。
5、权利要求l所述的多用途分离介质的制备方法，其特征在于葡聚糖或 琼脂糖凝胶与环氧氯丙烷反应，合成表面键合环氧基的葡聚糖或琼脂糖凝胶， 然后与a-氨基四唑或a-羟基四唑在碱或三氟化硼乙醚催化作用下反应即得四哇 多用途分离介质；所述的a-氨基四唑结构如下<formula>formula see original document page 3</formula><formula>formula see original document page 3</formula>为H、 d-C4的烷基、苯基或节基； 所述的a-羟基四哇结构如下R2 R2为H、 d-C4的烷基、苯基或苄基。
6、 权利要求l所述的多用途分离介质的制备方法，其特征在于硅胶与， 缩水甘油醚氧丙基三乙氧基硅烷反应，合成表面键合环氧基的硅胶，然后在三 氟化硼乙醚催化下与a-羟基腈反应，在键合a-羟基腈的硅胶中，加入DMF、NaN3 和NH4Cl反应即得四唑多用途分离介质。
7、 权利要求l所述的多用途分离介质的制备方法，其特征在于葡聚糖或 琼脂糖凝胶与环氧氯丙烷反应，合成表面键合环氧基的葡聚糖或琼脂糖凝胶， 然后在三氟化硼乙醚催化下与oc-羟基腈反应，在键合ot-羟基腈的葡聚糖或琼脂 糖凝胶中，加入DMF、 NaN3和NH4Cl反应即得四唑多用途分离介质。
全文摘要
本发明公开了以四唑为功能基的多用途分离介质及其制备方法。具体地说是用化学方法将四唑键合在硅胶、葡聚糖和琼脂糖凝胶分离基质表面，制备了一种结构新颖的分离介质。本发明具有在离子交换色谱和金属螯合色谱中应用的双重用途；该介质用于蛋白质的离子交换分离，蛋白质的分离择性高、易再生、分离速度快，蛋白质量和活性回收率高；该介质用于蛋白质的金属螯合色谱，蛋白质的分离择性高，金属离子流失小，分离速度快，蛋白质量和活性回收率高；本发明可在基因工程产品及血浆蛋白的快速分离纯化中获得应用。
文档编号B01J20/281GK101224414SQ20071001890
公开日2008年7月23日 申请日期2007年10月18日 优先权日2007年10月18日
发明者卫引茂, 雷根虎 申请人:西北大学