超声方法

专利名称：超声方法
技术领域：
本发明涉及利用超声驻波来检测颗粒反应的产物的方法和设备，更
具体来说，本发明涉及检测颗粒凝集(particle agglutination)的产物的方法和设备。
背景技术：
当分子或颗粒例如由于该分子的环境或其他分子和/或颗粒的活动而导致变化时，就会发生反应。例如，反应可以包括通过电荷、化学键在诸如两个颗粒的两个实体之间，或者在诸如抗体到抗原、核酸到互补序列等的互补分子之间形成联接Ginkage)。科学工作者永远在致力于优化反应条件，特别是提高速度、效率和产量。优化通常包括从反应混合物中移除干扰物，例如反应抑制剂；环境的若干变化，例如用于复杂反应的不同步骤的流体(缓冲液)之间的移动；以及对反应的产物进行浓縮、提纯和检测。原始样本基体(matrix)中存在的干扰物会影响反应
的结果，这些干扰物的效应通常被称为"基体效应"。例如，基体效应可以与样本中感兴趣的分子或颗粒相互发生反应(co-react)或发生非特异
性反应，使得期望的反应受到影响或被抑制。因此，经过优化的处理可能实现起来比较复杂并包括许多步骤，特别是重复洗涤步骤来移除干扰物。因此，期望在保持优化的同时降低执行反应的复杂度。
生物反应是包括一种或更多种生物体(biological origin)物质的反应，所述生物体物质例如是植物、动物以及微生物中出现的物质。这些物质包括蛋白质、核酸、脂类(lipid)、碳水化合物以及它们的合成变体与衍生物。所述物质可以是反应中的引发剂(causative agent)，例如使用酶进行酶修饰，或者可以是被反应所改变的实体。物质还可以是识别要素，例如但不限于，基于蛋白质的识别要素(例如抗体、抗菌素、外源凝集素、载脂蛋白以及它们的片段与衍生物)、基于核酸的识别要素(例如多核苷酸、核酸适体以及它们的片段与衍生物)。抗体与抗原和多核苷酸与互补多核苷酸或寡核苷酸序列的结合通常是极特殊的，因此这种结合已经在诸如免疫测定和分子测定等多种诊断测试中被采用。
化学反应包括产生化学变化的化学路径中的任意和所有步骤，所述化学变化可以包括形式的变化，例如沉淀或凝集。
超声或声学驻波场能够将颗粒定位在该场的压力波节或波腹处的液体内。定位取决于多种不同因素，包括颗粒和流体的相对密度和可压縮度。
声学驻波场是通过叠加在相反方向上行进的相同频率的两个波而产生的，这两个波由两个不同源生成，或者由一个源生成并经固体边界反射。这种波的特征在于具有半波长空间周期的零局部压力(声压波节)的区域，这种区域之间出现了最大压力(声压波腹)区域。
超声是频率在20,000 Hz以上的声音。人们早已经证明，超声驻波谐振器中生成的声学辐射力可以将水悬浮液中均匀分布的颗粒/单元引至局部压力波节或波腹平面。因为传播阶段中的任何不连续性使辐射力升高，所以，例如颗粒、细胞、水滴或气泡由于处于声场中而获取了独立于位置的声学势能。因此，悬浮颗粒倾向于移向并聚集(aggregate)在最小声学势能的位置处。辐射力的比轴向分量约小两个数量级的横向分量在
这些平面内起作用，并且将单元/颗粒聚集在单层中。如国际专利申请WO 02/072236中所描述的，此现象已经被成功用于从悬浮液中分离颗粒，更具体来说，从血浆中分离血细胞。
这里通过引用而并入的国际专利申请WO 04/033087公开了用于在流体之间移动颗粒的设备和方法，具体但非排他地致力于微生物样本的洗涤。

发明内容
本发明总体上旨在提供用于检测颗粒反应的产物、提供颗粒在流体间的移动以及检测所得的产物，同时改善反应的速度并减小反应的复杂度的方法和设备，其中所述颗粒能够有助于移除干扰物。该目标旨在通过捕捉超声驻波场内的颗粒，由此提供使得能够在一个，或者可能在多于一个的位置处进行反应的平台来实现。该超声平台还使得颗粒能够在反应之前从所有或大多数的干扰物和/或污染物中分离出来。
这里所使用的颗粒具体来说是指细菌细胞、血细胞、血小板、细胞片段、孢子、质粒或病毒，但是也包括可以或可以不用多个不同的化学
或生物部分(moiety)中的一个来修饰或涂覆的合成颗粒或它们的合成衍生物。合成颗粒的例子包括但不限于，诸如乳胶和聚苯乙烯等聚合物、诸如涂金的聚苯乙烯等复合物、带有顺磁芯的颗粒以及可以或者可以不涂覆蛋白质、捕集部分(capture moieties)、识别要素、配体、放大部分或者其他化学或生物试剂的玻璃珠/硅珠。
在准备为病人输血的过程中要使用血型鉴定(blood typing)和血型定型(blood grouping)。不同的人类血型定型是因为存在或者不存在从红血细胞表面延伸的被称为血型糖蛋白的跨膜蛋白，例如，血型糖蛋白A决定了血型A。目前存在超过20种的从基因角度确定的血型系统。
血型鉴定的传统方法包括与特定血型糖蛋白相对的IgM抗体。IgM可以结合到多于一个血细胞上的抗原上，交联而形成多个细胞的复合体。多个交联促使凝集成形，所述凝集成形可以用多种手段测量。可以用类似方式来确定猕因子阳性(Rhesuspositive)和猕因子阴性血因子。
用于ABO/猕因子血型鉴定的常规方法既有优点也有缺点。例如，作为定性指标的测试卡乳胶颗粒凝集(LPA)经常不灵敏、是非定量的并且较难解释(MeinJ和LumG， 1999 Pathology, 31， 67-69)。固相粘附法(SPAM; SinorLT等，1985 Transfusion， 25， 21-23)给出了一种清楚的终点反应(endpointreaction)，其中可以容易地区分阳性和阴性结果。然而，该方法存在这样的缺点，即，需要用高提纯的抗体来包被微孔板。
因为捐献的血液中的抗体可能与病人血液样本不相容(或相反)，从而抗体可能附着到外来血细胞表面上的抗原上从而促使免疫系统攻击作为外来颗粒的血细胞并促成溶血反应，所以血型鉴定是很重要的。这可能是致命的。最普通的抗原是A、 B和D(对于猕因子)。还存在26种在临床上重要的抗原。因此，当从捐献者或病人获得血液时对血液进行表征，以确定它的ABOD分类并查看它是否包含所关注的抗原或抗体。在 实行输血之前还要检査病人的血液，以确保捐献者样本是相容的。最后， 将输入的每个捐献者样本与病人的血液进行交叉匹配，以确保不会发生 不良反应。
凝集是存在交联剂或目标分析物的情况下颗粒交联的总称。凝集通 常由抗体和抗原作为媒介，其中颗粒典型地为聚苯乙烯球， 一般被称为 "乳胶凝集"试剂。凝集还可以以提供颗粒交联的其他试剂作为媒介，从 而形成诸如生物素-亲合素等复合物。血凝是凝集的子集，其中颗粒为红 血细胞。
血型确定基于凝集反应来进行，其中血样本与血型糖蛋白特有的交 联剂相混合。通常来讲，单克隆的IgM抗体被用作主要血型(例如A、 B 和D)的交联剂。IgM结合到多于一个血细胞上的抗原上，交联而形成 复合物，导致红血细胞的血凝。可以通过多种手段来测量血凝的产物。
然而，单克隆的IgM抗体并不适合确定病人/捐献者交叉匹配的不相 容性。在这种情况下，使用用于确定病人的血清是否包含可以结合到捐 献者红血细胞上的抗原(或相反)的测试。这种中间和定属(generic) 方法被称为Coombs方法或Coombs测试，由此用被称为Coombs试剂的 试剂来混合并处理病人和捐献者的样本。这种试剂包括抗人IgG和抗补 体C3 (C3b+C3d)抗体以及抗IgM和抗IgA抗体，这些抗体可以结合到 血液中的IgG抗体上。如果Coombs试剂结合到已经附着到红血细胞上 的抗原的IgG抗体上，则将发生凝集。Coombs方法还包括在添加试剂之 前的洗涤步骤，用来移除未结合的抗体。这防止了病人血清中未结合的 IgG抗体结合到试剂，这可能导致错误的结果。
在Coombs方法中，未结合的IgG抗体是干扰物，并且，在执行 Coombs反应之前需要移除这些干扰物，这促成了用于血型定型的测试设 备的设计，这种移除是通过主要使用凝胶体来分离不同大小的群体的系 统来实现的。这种方法的缺点包括需要一个离心分离步骤。该途径在美 国专利5460940中已做了描述。
本发明还旨在提供用于检测颗粒凝集(尤其是血凝)的产物的方法和设备。
因此，在第一方面中，本发明提供了一种用于检测颗粒反应的产物 的方法，该方法包括以下步骤
i. 将颗粒的悬浮液引入到与提供驻波的装置相关联的导管内，从而 将所述颗粒保持在所述该驻波的压力波节处；
ii. 将一种或更多种反应物引入所述导管中；以及
iii. 检测和/或收集反应产物。
在优选实施方式中，步骤iii包括以下步骤通过提供以预定流速经 过所述导管的流体流来流检测所述反应的产物，其中所述预定流速使得能 够检测所述驻波中所述产物的存在而未反应或未改变的颗粒则检测不到。
优选地通过经过所述导管的清洗流体流来提供所述流体流。所述预 定流速可以为恒定的大小，或者可替换地为可变的大小，例如所述预定 流速可以包括线性地或者以相等或不等时段逐步地增大和/或减小流体流 的大小。
检测产物可以包括以所述预定流速将反应的产物保留在驻波中，或 者实际上，以所述预定流速从所述驻波中移除所述反应的产物。例如， 所述预定流速可以使未反应或未改变的颗粒能够从驻波中被清除或移 除，同时反应的产物仍然保留或保持在驻波中。另选的是，所述预定流 速可以使反应的产物能够从驻波中被清除或移除，从而以某一流速或在 所述产物特有的流速范围上从驻波中清除或移除所述产物。
在优选实施方式中，所述方法用于检测颗粒凝集的产物，其中步骤 ii包括将用于提供所述颗粒的凝集的一种或更多种反应物引入所述导管 中，并且步骤iii包括通过提供以预定流速经过所述导管的流体流来检测 颗粒凝集。在更优选的实施方式中，步骤iii包括通过提供以预定流速经 过所述导管的流体流，检测颗粒凝集而颗粒聚集则检测不到，其中所述预 定流速使得能够检测所述驻波中颗粒凝集的存在而颗粒聚集则检测不到。
申请人意外发现通过应用流体流，可以将保持在驻波中的颗粒聚 集的产物与保持在驻波中的颗粒凝集的产物区分开。
具体来说，预定流速的流体流能够将驻波中的颗粒聚集的产物(也就是聚集物)与驻波中的颗粒凝集的产物(也就是凝集物)区分开。所 述流体流还能够鉴别既包括颗粒凝集又包括颗粒聚集的产物的存在。相 对于保持在驻波中的聚集物，保持在驻波中的凝集物可以承受住高得多 的流速。通过应用预定流速，颗粒凝集的产物、颗粒聚集的产物以及任 何中间产物都可以被检测，并彼此加以区分。
这里所使用的聚集是一种颗粒结团在一起(特别是颗粒保持在驻波 的波节或多个波节处时)的现象。聚集体是聚集的产物。
这里所使用的凝集是在存在诸如抗体等目标分析物或交联剂的情况 下颗粒相互交联的现象。因此，颗粒以物理方式和域化学方式相互附着。 凝集体是凝集的产物。
可以按某一流速来引入步骤i中的悬浮液和/或步骤ii中的一种或更 多种反应物，然而，另选的是，可以在所述反应物和保持在驻波的波节 处的颗粒之间存在很小的或不存在相对移动时，即在静态系统中执行所 述反应。
此方法的步骤i可以包括提供驻波，从而将颗粒保持在该驻波的一 个波节或多个波节处。
优选的是，此方法包括以下附加步骤在引入所述一种或更多种反 应物之前建立经过所述导管的洗液流，使得能够移除未保持在驻波中的 悬浮液的成分，另外或另选地使得能够清洗保持在驻波中的颗粒。具体 来说，该步骤使得能够在保留颗粒的同时从悬浮液中移除基体效应，从 而颗粒可以在没有干扰的情况下进行反应。
申请人还发现声流可以垂直于流体流发生，且颗粒或聚集颗粒在 驻波中从波节移动到波腹。在帮助流体和可溶材料通过该驻波进行移动、 将反应物引入所述颗粒或聚集体中，以及从所述颗粒或聚集体中移除未 结合的材料以便于清洗和混合方面，这尤其有效。
优选的是，通过提供以预定流速经过所述导管的流体流使得能够进 行反应产物的收集，其中所述预定流速使得能够从驻波中清除或移除所 述产物。可以按恒定流速或另选地在可能是反应产物特有的流速范围内 从驻波中清除产物。另选的是，反应产物的收集可以通过以下方式来实现移除所述驻波，或者移动所述导管直到所述驻波的孔径能够移除颗 粒为止，或者利用产物与颗粒在重量、密度或尺寸上的不同从所述驻波
中自动释出(liberation)所述产物，从而所述产物不再保持在所述驻波的 波节或多个波节处。
此方法在步骤iii之前可以包括将一种或更多种反应物引入所述导管 的多个步骤，其中这多个步骤的每一个都可以被插入建立经过所述导管 的洗液流的步骤。这使得能够在单个导管中执行包括多个步骤的复杂反 应。这里所使用的多个步骤可以包括但不限于两个、三个、四个或五个 步骤。
优选的是，所述颗粒是细菌细胞、血细胞、血小板、细胞片段、孢 子、质粒或其他DAN、病毒、大蛋白质分子或聚苯乙烯，或者可以或可 以不用多个不同化学或生物部分(例如抗体)中的一个来修饰或覆盖的 其他合成物质或它们的合成衍生物。
此方法尤其涉及这样的方法，该方法用于血型鉴定并且特别用于检 测血凝，即红血细胞的凝集，由此预定流速使得能够仅检测驻波中血凝 的存在而红血细胞的聚集则检测不到。
因此，在第二方面中，本发明提供了一种用于检测血凝的方法，该 方法包括以下步骤
i. 将红血细胞的悬浮液引入到与提供驻波的装置相关联的导管内， 从而将红血细胞保持在该驻波的压力波节处；
ii. 将提供血凝的一种或更多种反应物引入所述导管中；以及
iii. 通过提供以预定流速经过所述导管的流体流，检测血凝而红血 细胞的聚集则检测不到，其中所述预定流速使得能够检测所述驻波中血 凝的存在而红血细胞的聚集则检测不到。
此方法对于血型鉴定是优选的，因此红血细胞的悬浮液优选地是一 种或更多种血液样本。此方法使用超声(驻波)和预定流速来将强阳性 (血凝的)样本与弱阳性样本、与阴性(聚集或未血凝的单细胞)样本 区分开。弱阳性可能是局部血凝(少数抗体或抗原进行了交联)或弱凝 集(抗体对于抗原具有较低的活性)的结果。例如，保持在驻波的波节或多个波节处的血凝了的红血细胞在施加给变换器30V电压的情况下可
以经受住35 ml/hr (毫升/小时)的流速，而保持在驻波的波节或多个波 节处的聚集了的红血细胞则不能。典型地，血凝了的红血细胞可以经受 住比聚集了的红血细胞高2或3倍的流速。
提供血凝的反应物可以包括能够与红血细胞直接交联的单克隆IgM 抗体，或能够与表面上附着有IgG抗体的红血细胞进行交联的Coombs 试剂。
此方法更优选地用于执行Coombs方法，或者另选地用于Coombs 方法的修改中的血型鉴定，由此红血细胞的悬浮液是血液样本的混合物， 优选地是病人的血液样本和可能的捐献者的血液样本的混合物。在此方 法的优选实施方式中，使用经过导管的洗液流在将一种或更多种反应物 引入所述导管之前移除不想要的成分，例如不期望的未结合到红血细胞 表面的IgG抗体("基体效应")。所述一种或更多种反应物优选地包括适 于结合到血液IgG抗体的抗体，例如抗人IgG抗体和/或抗补体C3抗体， 最优选地包括适于用在Coombs方法中的反应物。优选地，所述抗体具有 对人IgG抗体的定属特异性。
此方法使得能够保留红血细胞、移除不期望的非特异性的IgG抗体、 血凝，检测并收集一个连续处理中超声装置的导管内的产物。此方法克 服了执行标准Coombs方法的诸多问题。
在第三方面中，本发明提供了一种用于执行第一方面的方法的设备， 该设备包括导管、能够生成具有置于所述导管内的波节或多个波节的驻 波的装置以及能够提供流体流的装置。
该设备优选地包括国际专利申请WO 04/033087中公开的一个、多于
一个或全部特征。
在第四方面中，本发明提供了一种用于执行第一方面的方法的试剂 盒，该试剂盒包括第二方面的设备和一种或更多种反应物。
在一个实施方式中，所述反应物包括用于血型鉴定的IgM抗体。在 第二实施方式中，所述反应物包括用于实现所述Coombs方法或其修改的 执行的抗人IgG抗体和/或抗补体C3抗体。
具体实施例方式
超声驻波技术自身应用于多种所提出的免疫测定技术。大多数免疫 测定测试检测的是夹心或竞争形式的抗原或抗体(血清学)。血清学测试 检测的是血液样本中特定抗体的存在，并且通常被用来测量IgG或IgM
抗体以确定病程，但是它还可以用来检测其他类型的抗体，例如IgA、IgD 或IgE。
用于血型鉴定实验的洗液或清洗流体是使用去离子水制备的0.01M 磷酸盐缓冲液(Sigma, UK)。可以用于血型鉴定的其他洗液包括(i)从 以色列Beit Ha，emek生物工业(Biological Industries)获得的Dulbecco(杜 尔贝科)磷酸盐缓冲液(PBS); (ii)由含有4% (w/v)的聚乙二醇(PEG) 15000-20000MW (Fluka)和0.3% (w/v)的硫酸葡聚糖钠盐(阿莫仙生 物科学(Amersham Biosciences))的以1:1比例稀释于水的PBS制得的 溶液；(iii)含有0.001%-0，01% (w/v)聚氧乙烯-10-十三烷基醚(Sigma) 的PBS溶液。
用于血型定型的红血细胞悬浮液和反应物是从DiaMed和Immucor Gamma获得的。使用的悬浮液为
1. DiaMed缓冲悬浮液3中的A,、 A2、 B以及O型人源红血细胞。 防腐剂抗菌三甲氧苄氨嘧啶和磺胺甲恶唑。
2. DiaMed缓冲悬浮液4中的A,、 A2、 B以及O型人源红血细胞。
防腐剂抗菌三甲氧苄氨嘧啶和磺胺甲恶唑。
3. DiaMed缓冲悬浮液4中对IgG敏感的"Coombs控制IgG"人源红 血细胞。防腐剂抗菌三甲氧苄氨嘧啶和磺胺甲恶唑。
4. DiaMed缓冲悬浮液3中的DiaCell人源红血细胞I、 II以及III。
5. 三种类型的血浆抗D/C iV910、抗D/CiV。-19以及抗C #25。
6. 抗人球蛋白、抗IgG (鼠科单克隆)、C3d (Immucor Gamma)。 防腐剂0.1%叠氮化钠。
7. Capture-R ，阳性和阴性控制血清(Immucor Gamma)。防腐剂 0.1。/。叠氮化钠。所需要的红血细胞的浓度通过用PBS或ID-稀释剂2 (DiaMed)来 稀释初始悬浮液而获得。除非另外声明，否则引入超声室的最终的红血 细胞浓度为0.3%。
用PBS或ID稀释剂2将DiaClon抗A、抗B以及抗D抗体(DiaMed) 稀释为需要的浓度(除非另外声明， 一般为20倍稀释度)。
Coombs试剂包括i) DiaClon Coombs试剂(DiaMed)和多专一性的 AHG(兔抗IgG、单克隆抗C3d、细胞线C139-9; DiaMed)，含量<0.1% 的叠氮化钠作为防腐剂；ii)抗人球蛋白、抗IgG (鼠科单克隆)、C3d (Immucor Gamma), 0.1°/。的叠氮化钠作为防腐剂。DiaClon抗血清抗体 (DiaMed)和抗IgG (鼠科单克隆)、C3d (Immucor Gamma)用PBS或 ID稀释剂2 (DiaMed)稀释为需要的浓度。
用于血型鉴定实验的超声设备包括盘式压电换能器、石英玻璃反射 器、样本溶液的分隔层(spacer layer),以及用于将换能器与分隔层分离 开的耦合(coupling)不锈钢层。这种设备在L.A.Kuznetsova等人的 Langmuir 2007,23,3009-3016中已经做了描述。通过注射器在分隔层中填 充红血细胞悬浮液。然后，将分隔层的入口重新连接到KDS100注射泵 (KD科技公司，MA,USA)，所述注射泵抽吸经过超声室(chamber)的 PBS、抗体悬浮液或Coombs试剂。利用Olympus BX41M电子萤光显微 镜或带有TV縮放镜头的标准PAL CCD JVC视频摄像机(日本Victor公 司)来监测细胞移动。摄像机通过0.5显微镜适配器而连接，并且图像被 记录在标准录像带(videotape)上。
预先的电压/频率扫描建立了最佳频率。通过注射器将PBS和人的红 血细胞的悬浮液抽吸入分隔层。所述扫描是通过在换能器正常谐振频率 (1.5MHz)附近的范围内以较小增量进行扫频并标识最小电压处的频率 来执行的。在血型鉴定实验期间手动维持所建立的谐振频率。
如L.A.Kuznetsova等人在Langmuir 2007,23,3009-3016中描述的，根 据作用在悬浮液中的颗粒上的轴向辐射力和重力的平衡，实验估计所选 频率处的声压振幅。阈值电压1.3V处的声压振幅P()为39kPa，这允许根 据P。和V的线性依赖在实验条件下进行它的估计。对于每个实验，将红血球悬浮液的新鲜部分抽吸入超声室内。 一旦 应用了驻波，所述红血球就被声学辐射力驱至压力波节平面，并且在该 平面内在压力波节中形成聚集体。通过应用水动力流，可以清楚地观察 到聚集体与凝集体之间的差异。每个实验之后，都用洗涤剂来清洗分隔 层，并用去离子水进行清洗。用酒精对超声室进行杀菌。
超声形成的聚集体在流中的稳定性取决于声压振幅，而声压振幅与
换能器两端的电压成线性比例。除非另外指定，否则为实验选择30V的 电压。
实施例1-阴性控制血凝实验
阴性对照实验包括A型细胞与抗B抗体、B型细胞与抗A抗体、 A。 A2或B型细胞与抗D抗体以及0型红血细胞与抗A和抗B抗体的 相互作用。
相等体积的A和A2型红血细胞悬浮液与抗B抗体被预混合、抽吸 入分隔层内并进行超声处理。在分隔层的中心看到了大聚集体正在生长。 所述生长的主要贡献者是几排单细胞和小的细胞团。超声室外围是更小 的聚集体，它们中的一些最后与中心聚集体联接从而导致主聚集体重组。 在进行超声处理一分钟内形成了直径约为2mm的聚集体。此后立即以 8ml h"的速率启动洗液流。在x2到x5显微镜放大率下清楚地看到，洗 液流导致单细胞从主聚集体的边缘缓慢而持续地分离，并且更小的聚集 体快速分解，散布在超声室周围。随着流速增加，中心聚集体的分解也 增加。已经发现在35 mlh"和40mlh"之间，聚集体在约2分钟内完 全解离。
修改的实验过程包括将包含A型细胞的悬浮液抽吸入分隔层、开启 超声以及形成中心细胞聚集体。之后，将以8mlh"的流速向超声室中抽 吸不相容的抗B抗体2分钟。随着流速增加，聚集体解离的模式与上面 描述的模式相同。未观察到凝集。
相等体积的A,、 As或B型细胞与抗D抗体的预混悬浮液被暴露给 超声，导致压力波节平面中的细胞聚集。聚集体被分解，并且以35mlh" 的流速被清洗掉。当预先形成的细胞聚集体在不相容的抗体流中以较慢流速被清洗然后经受35ml h"的更高流速时，获得了相同的结果。
将O型红血细胞与抗A和抗B抗体的预混悬浮液暴露给超声，导致
细胞聚集。解离如上所述。
实施例2-阳性控制血凝实验
阳性控制实验包括A型红血细胞与抗A抗体、B型红血细胞与抗B 抗体以及O型红血细胞与抗D抗体的相互作用。
将相等体积的At和A2型红血细胞悬浮液与抗A抗体进行预混，或 者将相等体积的B型红血细胞悬浮液与抗B抗体进行预混，并进行超声 处理，超声处理一分钟内，在驻波的压力波节处得到了凝集的产物。形 成模式与实施例1中描述的形式显著不同。不是用輻射力吸引单细胞来 形成中心聚集体，而是用辐射力吸引小型和中型凝集体来形成中心凝集 体。在进行超声处理的一分钟内形成了一个较大的中心凝集体和几个较 小的周围凝集体。此后立即启动流。尽管中心凝集体的位置在流方向上 有了轻微的偏移，但是它在低流速和中流速下未表现出分解的迹象而是 保持完整，而较小的凝集体则被所述流从场中清除。在一些情况下，较 小的凝集体在主凝集体之后被清除，并且如果发生了接触，则附着到主 凝集体上。主凝集体保持完整，直到流速被增加到80ml h"和110ml h" 之间为止，此时，凝集体作为整体被清洗掉，即，对于凝集体而言，不 会发生针对聚集体的在实施例1中看到的单细胞的分离。
将相等体积的O型红血细胞与抗D抗体的预混悬浮液暴露给超声， 导致在超声室中心处形成了凝集体，该凝集体未表现出分解的迹象，直 到它在80ml h"的流速下作为整体被清除掉为止。将抗D抗体引入聚集 在驻波的压力波节处的O型红血细胞中也具有相同的效果。在这种情况 下，凝集表示了阳性猕因子血型。
实施例1和实施例2中的实验是在30V的换能器电压下进行的。注 意，在更低电压下，聚集体产物从驻波中被清除的流速和凝集体产物从 驻波中被清除的流速之间的差异更小，因此区分阳性结果和阴性结果将 更难实现。在高于50V的电压下，气穴气泡经常会干扰处理。
实施例3-Coombs方法Coombs方法实际上包括两种不同的测试，直接Coombs测试和间接 Coombs测试。直接Coombs测试被用来检测已经结合到体内红血细胞表 面抗原上的抗体或补体系统因子，而间接Coombs测试被用来在输血之前 检测病人或捐献者的血浆或血清中存在的较低浓度的抗体。这两种测试 基于以下概念免疫非人类物种所产生的抗人抗体将结合到人抗体(一 般为IgG或IgM)上。动物的抗人抗体也将结合到可以固定在红血细胞 的表面上的人抗体上，并且在适当的测试管条件下，这些红血细胞可能 会凝集。
直接Coombs测试-阳性
使0.4%的Coombs对照IgG预加载细胞(即已经附着了 IgG抗体的 供质量控制测试时使用的细胞)的悬浮液流入超声室中，并且进行超声 处理。细胞在超声室中心处聚集在压力波节内。使Coombs血清的IO倍 稀释液以8ml h"的流速流过超声室，导致细胞凝集。凝集体在80ml h" 的流速下作为整体被清洗掉。
当等体积的0.8% Coombs对照IgG预加载细胞和Coombs血清的 10倍稀释液的预混悬浮液(得到的最终细胞浓度为0.4%)暴露于超声场 时，也会发生凝集。在80mlh"流速下凝集体再次被完整地清洗掉。
直接Coombs测试-阴性对照
对等体积的0.6%的A。 A2、 B或O型红血细胞的10倍稀释液与 Coombs血清的IO倍稀释液的预混悬浮液(得到的最终细胞浓度为0.3%) 进行超声处理，导致波节平面中的细胞聚集。未发生凝集，并且以35ml h"的流速来清洗聚集体。
Coombs试剂滴定
进行滴定是为了确定造成细胞凝集的Coombs试剂的最小浓度。已 经发现当初始Coombs试剂浓度被稀释10和100倍时，发生了较强的 细胞凝集。凝集体表现出稳定性，并且仅在80-110 ml h"流速下作为整体 被从超声场中清除。在1000倍稀释液度下，观察到了局部细胞凝集，在 中等流速下从中心凝集体/聚集体上清洗掉了较小的细胞簇。在10,000和 100,000倍稀释度下，在较慢流速下开始从中心凝集体/聚集体上清洗掉细胞。
间接Coombs测试-阴性对照
将等体积的DiaCell in和血浆抗D/C Nr 10的预混悬浮液在室温下温 育15分钟，并且进行超声处理。在超声室中心处形成了红血细胞聚集体。 在PBS流中以8 ml h"流速清洗该聚集体2分钟，以移除血浆中存在的未 结合的抗体分子。Coombs方法面临的其中一个问题是血浆中存在的抗体 分子对Coombs试剂的"中和"。本方法允许清洗红血细胞，因此避免了此 问题。以8 ml h"流速将Coombs试剂的10倍稀释液抽吸经过超声室。随 着流速增加到12mlh.1，聚集体开始丢失细胞，并且发生了 35mlh"的快 速聚集体解离。这表明血浆不包含(或者包含不相容的)抗体。因此， Coombs测试是阴性的。
间接Coombs测试-阳性
对等体积的DiaCell I和血浆抗D/C Nr 10的预混悬浮液进行用于阴 性控制的过程。Coombs试剂的IO倍稀释液的引入导致了凝集。凝集体 在80 ml h"流速下被作为整体清除。
实施例4-免疫测定
应用到简单免疫测定的一个实施例的超声驻波系统将使用合成颗 粒，例如用相对于感兴趣的抗体(例如梅毒或弓形体病)的抗原涂覆的 聚苯乙烯。颗粒大小在直径方面可以在约lnm和50pm之间，但是优选 地为约3jim。根据颗粒的物理和化学特性、流细胞特性的物理维度以及 颗粒被保持在其中的媒质的成分来优化驻波场的条件。颗粒将被保持在 驻波内，并且优选地被保持在驻波的波节处，而溶液或悬浮液则通过导 管。杂质将被清洗掉。然后，通过导管来清洗包含化学或生物试剂的第 二溶液，以便发生反应。然后，可以通过施加流速增加的流体流来检测 和区分反应产物。
实施例5-抗体夹心测定
检测一类抗体是否存在的一般方法是使用相对于该类的第二抗体。 第二抗体可以包含标签，标签通常为酶，但是也可以是可见标签，例如纳 米颗粒、磁颗粒、萤光化合物或量子点。在一个实施例中，试剂将包含相对于用反光的金纳米颗粒做了标记的IgG或IgM抗体的抗体。于是，针对
该特定标签使用适当的检测系统将能够检测到信号。例如，激光和光学器 件的使用可以测量发散的光量，因此可以测量原始样本中存在的抗体量。 夹心免疫测定将使用表面附着有抗体的聚苯乙烯颗粒。这种颗粒可 以保持在驻波中，而悬浮液的其他组分通过导管被清洗，即，不会保持 在驻波处。驻波将被优化为颗粒的具体尺寸或尺寸范围。然后，可以使 包括该抗体的特异性抗原的第二溶液流过该驻波，由此该抗原将被结合 到颗粒上的抗体所捕获。第三溶液可以用来在将第四溶液引入到抗原之 前清洗未结合的材料，第四溶液是包括一种或更多种第二抗体的另一种 试剂。所述一种或更多种第二抗体将会结合到抗原上，从而形成夹心， 于是就可以从标签检测到信号，该信号可以与原始样本中的抗原量相关。
实施例6-竞争免疫测定
竞争免疫测定特别适合于仅具有一个可以结合到抗体的位置的较小 抗原。分析物可以包含已知量的附有标签的抗体。该抗体能够结合到驻 波中的颗粒的表面上的结合部分，并且能够提供可检测信号。仅包括抗 体的分析物所产生的信号表明了被称为100%结合的值。此时，如果分析 物中也存在该抗体的特异性抗原，则它将与抗体发生反应。由此，抗体
将不能结合到驻波中的颗粒的表面上的结合部分抗体的抗体结合位置
将被阻挡，并将由此流过导管，从而被清洗掉。因此，系统中抗原的存 在将导致与溶液中的抗原量成比例的可检测信号的减少。
实施例8-多核苷酸和寡核苷酸检测
多核苷酸和寡核苷酸检测可以包括杂交步骤。在本实施例中，可以 用一个或更多个寡核苷酸来覆盖驻波所保持的颗粒。样本中的目标多核 苷酸和寡核苷酸分析物可以呈现为单链形式，并穿过驻波，由此可能发 生与颗粒上的一个或更多个寡核苷酸的杂交。未结合的材料将被清洗掉。 包含用所附着的第二寡核苷酸做了标记的颗粒的反应物的引入将得到夹 心测定格式。金或银纳米颗粒可以用作这种颗粒，因此能够优选地通过 衍射或光散射来实现光检测。
权利要求
1、一种用于检测颗粒反应的产物的方法，该方法包括以下步骤i.将所述颗粒的悬浮液引入到与提供驻波的装置相关联的导管内，从而将所述颗粒保持在所述驻波的压力波节处；ii.将一种或更多种反应物引入所述导管中；以及iii.检测和/或收集反应产物。
2、 根据权利要求1所述的方法，其中步骤iii包括以下步骤通过提供以预定流速经过所述导管的流体流来流检测所述反应的产物，其中 所述预定流速使得能够检测所述驻波中所述产物的存在而未反应或未改 变的颗粒则检测不到。
3、 根据权利要求1所述的方法，用于检测颗粒凝集的产物，其中步 骤iii包括以下步骤通过提供以预定流速经过所述导管的流体流来检测 颗粒凝集，其中所述预定流速使得能够检测所述驻波中颗粒凝集的存在而颗粒聚集则检测不到。
4、 根据权利要求1到3所述的方法，该方法还包括以下步骤在引 入所述一种或更多种反应物之前建立经过所述导管的洗液流。
5、 根据权利要求1到4所述的方法，其中通过经过所述导管的清洗流体流来提供所述流体流。
6、 根据权利要求1到5所述的方法，用于血型鉴定，其中所述颗粒 的悬浮液包括一种或更多个血液样本，并且所述颗粒是红血细胞。
7、 根据权利要求6所述的方法，其中所述一种或更多种反应物提供 了血凝。
8、 一种用于检测血凝的方法，该方法包括以下步骤i. 将红血细胞的悬浮液引入到与提供驻波的装置相关联的导管内， 从而将红血细胞保持在所述驻波的压力波节处；ii. 将提供血凝的一种或更多种反应物引入所述导管中；以及iii. 通过提供以预定流速经过所述导管的流体流，检测血凝而红血 细胞的聚集则检测不到，其中所述预定流速使得能够检测所述驻波中血凝的存在而红血细胞的聚集则检测不到。
9、 根据权利要求8所述的方法，其中所述提供血凝的反应物包括单克隆IgM抗体。
10、 根据权利要求8所述的方法，用于执行Coombs方法。
11、 根据权利要求8到10所述的方法，其中所述红血细胞的悬浮液 是血液样本的混合物。
12、 一种用于执行权利要求1到11所述方法的设备，该设备包括导 管、能够生成具有置于所述导管内的波节的驻波的装置以及能够提供流 体流的装置。
13、 一种用于执行权利要求1到11所述方法的试剂盒，该试剂盒包 括权利要求11所述的设备和一种或更多种反应物。
14、 权利要求8或权利要求9所述的方法在血型鉴定方面的用途。
15、 权利要求8所述的方法在执行Coombs方法方面的用途。
全文摘要
本发明提供了用于检测保持在驻波的压力波节处的颗粒的反应的产物的方法和设备。该方法和设备尤其涉及血型鉴定和Coombs方法。
文档编号B01J19/10GK101517410SQ200780036027
公开日2009年8月26日 申请日期2007年9月27日 优先权日2006年9月27日
发明者达米安·邦德 申请人:泊克玛科技有限公司