专利名称：罗丹明b分子印迹固相萃取填料的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种食品安全技术领域的方法，具体的说，是涉及罗丹明B分子 印迹固相萃取小柱的制备方法，并用于食品安全样品中的罗丹明B的高选择性分离、纯化 和富集。
背景技术：
罗丹B (Rhodamine B)，又叫玫瑰红B，化学分子式为C28H31N203C1，是一种具有桃红 色的人工合成的三苯甲烷类碱性染料。罗丹明B可用作实验室中细胞荧光染色剂、有色玻 璃、特色烟花爆竹等行业。罗丹明B具有脂溶性，曾经用作食品添加剂，被用作调味品(主 要是辣椒粉和辣椒油)染色剂。实验证明罗丹明B具有潜在的致癌和致突变性，我国和欧 盟现在都已不允许在食品中使用。 在食品残留检测中，样品的前处理过程至关重要，固相萃取(Solid PhaseExtraction，SPE)是一种新型的样品前处理技术，由液固萃取和柱液相色谱技术结合 发展而来，具有操作简单和省时省力等特点，在食品残留分子中被广泛应用，正成为样品净 化的主流。 常规使用的SPE填料可分为正相柱、反相柱、离子交换柱和吸附树脂柱。分子印 迹固相萃取柱(Molecularly imprinted solid-phase extraction, MISPE)是利用MIP选 择性吸附机理制备SPE填料，不仅可以提高SPE净化效果，实现低浓度残留的富集，提高检 测方法的灵敏度，而且可以实现SPE柱的多次重复使用，降低检测成本。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种罗丹明B分子印迹固相萃取填料的制备方法，能 对罗丹明B特异性、选择性地分离和高效富集。 本发明的另一个目的在于提供一种装有罗丹明B分子印迹固相萃取填料的分离 柱，能够简单、快速和高效地测定食品中罗丹明B残留量，并选择性纯化和富集，可直接用 于对于罗丹明B的特异性、选择性分离和高效富集，结合高效液相色谱法即可实现食品中 罗丹明B的快速检测，便于在例行分析检测中普及和推广。 本发明的另一个目的在于提供一种分子印迹固相萃取填料的分离柱在选择性分 离、富集和纯化食品中罗丹明B残留样品的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的 —种罗丹明B分子印迹固相萃取填料的制备方法，包括以下步骤 (1)溶液A :将丙烯酰胺单体和罗丹明B溶解在乙腈中；溶液B :将交联剂二甲基丙
烯酸乙二醇酯和引发剂偶氮二异丁腈和乙腈混合；溶液A和溶液B混合后，超声5min，通氮 气除氧15min后密封；6(TC下聚合24小时，生成分子印迹聚合物； 所述的罗丹明B、丙烯酰胺、二甲基丙烯酸乙二醇酯摩尔比例为 1:6: 30-1 : 8 : 30 ;沉淀剂乙腈80-120mL ;
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(2)将步骤(1)反应体系离心，分离得到聚合物微球，再将分离出的聚合物微 球，置于滤纸筒中，以乙酸甲醇(10/90， V/V)溶剂为萃取剂，索氏萃取48小时除去罗丹 明B后，再用甲醇洗去残留溶剂，3(TC真空干燥24小时；所得聚合物微球的平均粒径为 10_35iim。 将步骤(2)制得的聚合物微球填充于空管内，空管两端分别装上筛板，即得罗丹 明B分子印迹固相萃取柱。 本发明上述方法制备的罗丹明B分子印迹固相萃取柱，应用于食品中罗丹明B残 留样品的选择性分离、富集、纯化，具体步骤如下 (1)固相萃取小柱装填好后，依次用2-3个柱体积的乙腈和2-3个柱体积甲醇活 化； (2)取样品提取液或样品溶液滴加至固相萃取小柱；
(3)用1-2个柱体积的二氯甲烷淋洗一次； (4)用2-3个柱体积的甲醇洗脱，即得洗脱液，经0. 45 m的有机过滤膜过滤后 HPLC分析。 萃取柱一般指体积l-60ml的固相萃取小柱，如lml、3ml、5ml、 10ml、20ml和60ml 等，本发明优选1-lOml的固相萃取小柱，如lml、3ml和5ml等。 —种制备食品中罗丹明B残留样品的分子印迹固相萃取方法，具体步骤如下
(1) lml固相萃取小柱装填好后，依次用2. 5mL乙腈、2. 5mL的甲醇活化；
(2)样品提取液或样品溶液l-5mL滴加至固相萃取小柱；
(3)用lmL 二氯甲烷淋洗一次； (4)用2. 5mL甲醇洗脱，即得洗脱液，经0. 45 y m的有机过滤膜过滤后HPLC分析。
本发明实现的有益效果 本发明提供了一种罗丹明B分子印迹固相萃取填料的制备方法，所得到的印迹物 微球是一种具有固定孔穴大小、形状和有确定排列功能的高分子交联聚合物，对罗丹明B 分子的立体结构具有动态"记忆"功能，能实现罗丹明B特异性、选择性地分离和高效富集。 采用本发明制得的填料装填的罗丹明B分子印迹固相萃取柱，可应用于食品中罗丹明残留 量的提取溶液的选择性纯化和富集，此方法对罗丹明B样品的回收率高(大于90%)、相对 偏差小，具有操作更为简单、快速，且效率更高等特点。
具体实施例方式以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅供说明具体方法，该方法的其
规模不受实施例的限制。 实施例1 —、罗丹明B分子印迹固相萃取小柱的制备
(1)含罗丹明B的分子印迹聚合物微球的制备 将罗丹明B、丙烯酰胺、二甲基丙烯酸乙二醇酯按照1 : 6 : 30的摩尔比例溶解于 100mL乙腈中，加入引发剂偶氮二异丁腈，超声5min后，通氮除氧15min密封反应器。在氮 气保护下油浴6(TC反应24小时，高速离心得到印迹聚合物微球；
(2)聚合物中罗丹明B的洗脱
将上述含有罗丹明B的分子印迹聚合物微球置于乙酸甲醇(10/90， V/V)的溶液中，在索氏提取器中提取48h，除去罗丹明B以及未反应的化合物；再将聚合物微球置于纯甲醇中，在索氏提取中提取24h，将获得聚合物微球真空干燥至恒重，即为罗丹明B分子印迹聚合物微球； (3)罗丹明B分子印迹固相萃取小柱的制备 首先用2. 5mL甲醇冲洗柱内壁，然后称取0. 10g的上述罗丹明B分子印迹聚合物微球装柱装填高度约为lcm，填料的顶端和底端分别装有聚乙烯筛板；采用乙腈为装柱匀浆液将匀浆液装入聚丙烯固相萃取住，盖紧筛板。 二、罗丹明B分子印迹固相萃取小柱应用于辣椒中罗丹明B残留样品的提取液的高选择性分离、富集和纯化 (1)固相萃取小柱装填好后，依次用2. 5mL乙腈、2. 5mL的甲醇活化； (2)称取lg市售辣椒，表面喷洒一定浓度的罗丹明B溶液，放置过夜。加入20ml
含20%丙酮的正己烷，涡旋振荡10min，过滤，滤渣再加入10mL的20%丙酮的正己烷重复提
取一次，合并2次提取液，浓縮到lmL左右，慢慢加入层析柱中； (3)用lmL 二氯甲烷淋洗一次； (4)用2. 5mL甲醇洗脱，即得洗脱液，经0. 45 y m的有机过滤膜过滤后HPLC分析。
所制的的固相萃取小柱对辣椒粉中的罗丹明B具有专一选择性的富集和纯化，对辣椒粉样品中提取液中加标回收率为91. 7% -103. 5%，相对标准偏差为2. 8% -6. 3%。
实施例2 —、罗丹明B分子印迹固相萃取小柱的制备
(D含罗丹明B的分子印迹聚合物微球的制备 将罗丹明B、丙烯酰胺、二甲基丙烯酸乙二醇酯按照1 : 8 : 40的摩尔比例溶解于120mL乙腈中，加入引发剂偶氮二异丁腈，超声5min后，通氮除氧15min密封反应器。在氮气保护下油浴6(TC反应24小时，高速离心得到印迹聚合物微球；
聚合物中罗丹明B的洗脱 将上述含有罗丹明B的分子印迹聚合物微球置于乙酸甲醇(10/90， V/V)的溶液中，在索氏提取器中提取48h，除去罗丹明B以及未反应的化合物；再将聚合物微球置于纯甲醇中，在索氏提取中提取24h，将获得聚合物微球真空干燥至恒重，即为罗丹明B分子印迹聚合物微球； (3)罗丹明B分子印迹固相萃取小柱的制备 首先用2. 5mL甲醇冲洗柱内壁，然后称取0. 10g的上述罗丹明B分子印迹聚合物微球装柱装填高度约为lcm，填料的顶端和底端分别装有聚乙烯筛板；采用乙腈为装柱匀浆液将匀浆液装入聚丙烯固相萃取住，盖紧筛板。， 二、罗丹明B分子印迹固相萃取小柱应用于辣椒中罗丹明B残留样品的提取液的高选择性分离、富集、纯化 (1)固相萃取小柱装填好后，依次用2. 5mL乙腈、2. 5mL的甲醇活化；
(2)称取lg市售辣椒油，喷洒一定浓度的罗丹明B溶液，放置过夜。加入5ml含20%丙酮的正己烷，振荡4min，取上清液，重复2_3次，合并提取液，浓縮到lmL左右，慢慢加入层析柱中；
(3)用lmL 二氯甲垸淋洗一次； (4)用2. 5mL甲醇洗脱，即得洗脱液，经0. 45 P m的有机过滤膜过滤后HPLC分析。
所制的的固相萃取小柱对辣椒油中的罗丹明B具有专一选择性的富集和纯化，对 辣椒油样品中提取液中加标回收率为92. 3% -105. 8%，相对标准偏差为1. 2% -5. 6%。
权利要求
一种罗丹明B分子印迹固相萃取填料的制备方法，其特征在于包括以下步骤步骤一溶液A将丙烯酰胺单体和罗丹明B溶解在乙腈中；溶液B将交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯和偶氮二异丁腈和乙腈混合；溶液A和溶液B混合后，超声5min，通氮气除氧15min后密封；60℃下聚合24小时，生成分子印迹聚合物；步骤二将步骤一反应体系离心，分离得到聚合物微球，再将分离出的聚合物微球，置于滤纸筒中，以体积比10/90的乙酸-甲醇溶剂为萃取剂，索氏萃取48小时除去罗丹明B后，再用甲醇洗去残留溶剂，真空干燥24小时；得到聚合物微球。
2. 根据权利要求1所述的罗丹明B分子印迹固相萃取填料的制备方法，其特征在于所述的罗丹明B、丙烯酰胺、二甲基丙烯酸乙二醇酯摩尔比例为i : 6 : 30-1 : 8 : 30。
3. 根据权利要求1所述的罗丹明B分子印迹固相萃取填料的制备方法，其特征在于所 述的乙腈用量为80-120mL。
4. 根据权利要求1所述的罗丹明B分子印迹固相萃取填料的制备方法，其特征在于所 述真空干燥的温度为30°C。
5. 根据权利要求1所述的罗丹明B分子印迹固相萃取填料的制备方法，其特征在于所 述聚合物微球的平均粒径为10-35 iim。
6. —种罗丹明B分子印迹固相萃取柱，其特征在于所述萃取柱装填有根据权利要求 1-5之一所述方法制备的萃取填料。
7. 根据权利要求6所述罗丹明B分子印迹固相萃取柱，其特征在于所述萃取柱体积为 l-60ml。
8. 根据权利要求6所述罗丹明B分子印迹固相萃取柱，在选择性分离、富集和纯化食品 中罗丹明B残留样品中应用。
9. 一种应用权利要求6所述罗丹明B分子印迹固相萃取柱选择性分离、富集和纯化食 品中罗丹明B残留样品的方法，具体步骤如下1) 固相萃取小柱装填好后，依次用2-3个柱体积的乙腈和2-3个柱体积甲醇活化；2) 取样品提取液或样品溶液滴加至固相萃取小柱；3) 用1-2个柱体积的二氯甲烷淋洗一次；4) 用2-3个柱体积的甲醇洗脱，即得洗脱液，经0. 45 m的有机过滤膜过滤后HPLC分析。
全文摘要
本发明公开了一种罗丹明B分子印迹固相萃取填料的制备方法，罗丹明B、丙烯酰胺、交联剂和引发剂于沉淀剂中反应，再萃取除去模板分子罗丹明B得到微球填料。再将所得填料装填成柱，用于检测食品中罗丹明B残留样品提取溶液的选择性纯化和富集。不仅能对罗丹明B样品实现高回收率和低相对偏差，还具有操作更为简单、快速，且效率更高等特点。
文档编号B01J20/30GK101733082SQ20091015580
公开日2010年6月16日 申请日期2009年12月28日 优先权日2009年12月28日
发明者奚奇辉, 易翔, 曾延波, 李蕾, 沈兵, 王练 申请人:嘉兴学院;中华人民共和国嘉兴出入境检验检疫局