专利名称：以hp20树脂为填料的固相萃取试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒及其使用方法，具体涉及一种以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒及其使用方法。属于生物化学工程技术领域。
背景技术：
高效液相色谱是目前分析紫杉烷混合样品的主要手段，但由于高效液相色谱分析柱容易被污染，且价格较高，故需要对样品进行预处理，以提高高效液相色谱分析柱的寿命，降低使用成本。
造成高效液相色谱柱污染的主要原因主要有两个一是样品中含有一些与高效液相色谱填料高度亲和，或者不可逆结合的杂质，针对常用反相柱，这些杂质是一些高度非极性的物质，它们进入色谱柱后很难被洗脱下来，而是覆盖在高效液相色谱填料的表面，使高效液相色谱柱丧失分离能力；二是一些大颗粒，由于其粒径大于或者接近高效液相色谱分析柱中的孔隙直径，容易在高效液相色谱分析柱柱头位置聚集，造成堵塞和柱压上升。同时样品中高度极性的杂质存在，将导致色谱图开始阶段的图谱复杂化，不利于目标物的分析。
经对现有技术的文献检索发现，雒丽娜等人在《分析试验室》2005年24卷7期80-84页发表了题为“固相萃取高效液相色谱法快速测定红豆杉枝叶中的3种紫杉烷类化合物”的论文，使用一种新型的PRP-6高分子树脂作为填料填装到底部加载海绵过滤的Φ10×500mm层析柱中，制备成填料高度为10mm的固相萃取柱，将90％甲醇的红豆杉枝叶萃取液加到固相萃取柱顶端，在氮气加压驱动下通过固相萃取柱，然后分别用20mL水、20％甲醇、40％甲醇进行杂质洗脱，最后用50mL纯甲醇进行目标紫杉烷洗脱，对红豆杉枝叶中的紫杉烷类物质进行了初步纯化，然后对甲醇洗脱液进行浓缩和0.45μm孔径的滤膜过滤后，进行高效液相色谱检测。经分析发现，上述固相萃取过程中紫杉醇收率为91％，经过固相萃取预纯化，减轻了后续高效液相色谱分析压力，增加了高效液相色谱柱的使用寿命。但是，上述方法在对紫杉烷样品进行预处理时，采用有机溶剂洗脱方案，对杂质的去除不彻底；同时，上述固相萃取柱不具备超滤功能，不能有效消除混合样品中存在的颗粒物，而必须在萃取后附加进行超滤，才能去除造成高效液相色谱堵塞的颗粒物，从而使步骤繁琐；另外该方法中采用甲醇作为溶剂，一方面容易造成紫杉烷降解，另一方面由于甲醇具有强烈的毒性，对操作人员健康不利；最后，该方法采用纯甲醇进行高强度洗脱，过度注重紫杉烷收率，使最后的洗脱液中含有部分的高度非极性物质，不利于最大限度提高高效液相色谱的使用寿命。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒及其使用方法，使其实现紫杉烷样品的完整、高效分离、高收率的固相萃取，且工艺简单、安全、能有效去除样品中的杂质，并提高了高效液相色谱的使用寿命。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明提供的以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒包括离心固相萃取柱和固相萃取试剂瓶组，两者装在同一个盒中，配套使用。
所述HP20树脂为日本三菱化学生产的Diaion品牌大孔吸附树脂的一种，它以聚苯乙烯基苯为基体，吸附量高、颗粒均匀、机械强度好、不易破碎、残留物少、预处理方便，HP20树脂的孔容积为1.3ml/rpm、比表面积为600m2/rpm、孔半径大于200()、表观密度为680rpm/L、水含量为55-65％、均匀系数小于1.6。
所述的离心固相萃取柱包括上部的储液槽和下部的填料管两部分，使用时套在1-2mL离心管内，依靠离心力来驱动洗脱液通过填料层，完成固相萃取和超滤功能；储液槽作为离心前样品和各种洗液的加样槽，而填料管中填充有HP20树脂材料，在离心过程中加样槽中的液体在离心力作用流动通过填料管，实现固相萃取过程。
为便于所述的离心固相萃取柱与实验室常规1-2mL离心管配套使用，储液槽直径为0.5-0.8cm、高度为1-3cm、对应储液槽容积为0.2-1mL，固定储液槽的膨大卡环距离储液槽底部0.5-1cm、卡环厚度3mm，填料管长度为0.5-1cm、直径为2-5mm、对应填装HP20树脂填料体积为15-200μL，填料层形状细长，具有更强的层析分离能力，可以更大程度的实现样品的纯化，在填料层的上下两端分别设0.22-0.45μm孔径的尼龙超滤膜，实现对样品中颗粒物的清除功能。
所述的固相萃取试剂瓶组，包括样品稀释液瓶，装有用作样品稀释液的pH8-10的磷酸缓冲液；第一杂质洗脱液瓶，装有作为第一杂质洗脱液的，含5-30％乙醇(体积百分比浓度)、pH12的缓冲液；第二杂质洗脱液瓶，装有作为第二杂质洗脱液的，含2-20％乙醇(体积百分比浓度)、pH2的乙醇溶液；以及紫杉烷洗脱液瓶，装有作为紫杉烷洗脱液的，含85-99％乙醇(体积百分比浓度)、pH5的乙醇溶液。
本发明提供的以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒的使用方法，具体步骤如下1)将离心固相萃取柱放在离心管中，加6倍填料体积的乙醇到该萃取柱的储液槽中，离心，冲洗该萃取柱，以上操作反复进行不少于3次，实现柱再生，然后加不少于4倍填料体积的样品稀释液到再生后的离心固相萃取柱的储液槽中，离心，实现柱平衡，废弃滤液，将平衡后的离心固相萃取柱放入另一离心管中待用；2)将紫杉烷样品溶解在乙醇中，然后向紫杉烷乙醇溶液中加3倍体积的样品稀释液，震荡后直接上样到平衡后的离心固相萃取柱的储液槽中，在室温下静止至少5分钟，然后离心，弃去滤液；3)加3倍填料体积的第一杂质洗脱液到经步骤2)处理后的离心固相萃取柱的储液槽中，离心，弃去滤液；4)加3倍填料体积的第二杂质洗脱液到经步骤3)处理后的离心固相萃取柱的储液槽中，离心，弃去滤液；5)将经步骤4)处理后的离心固相萃取柱放入另一离心管中，加2倍填料体积的紫杉烷洗脱液到该萃取柱的储液槽中，静止至少5分钟后，离心，收集滤液，该滤液即为经过固相萃取后的紫杉烷萃取液。
以上各步骤中所述的离心，其速度为1000-10000rpm。
本发明试剂盒中的离心固相萃取柱采用HP20树脂为填料，在萃取过程中同时实现超滤功能，一次处理后可以直接进行高效液相色谱检测，避免了附加的超滤操作，简化了操作步骤。本发明摆脱了以往单纯依靠有机溶剂洗脱纯化的思路，而是采用有机溶剂洗脱和变pH洗脱结合的二维洗脱方案，可以更有效的去除混合样品中的杂质，进一步减轻后续高效液相色谱测量的压力。
本发明提出了以HP20树脂为填料的离心固相萃取柱和配套的萃取方法，充分利用了紫杉烷的中度非极性和弱碱性的特点，最大限度的分离杂质，富集紫杉烷。柱平衡后的稀释液清洗以及紫杉烷样品的稀释，使样品上样过程中紫杉烷最大限度的吸附在HP20填料上，保证了整个固相萃取过程的收率。两步杂质清洗步骤中强碱性的低浓度乙醇溶液用来实现酸性杂质，如脂肪酸类的分离；而强酸性的低浓度乙醇溶液用来实现强碱酸性杂质以及极性较强杂质的分离。最后以弱酸性高浓度乙醇溶液来实现吸附在HP20填料上的紫杉烷类物质的洗脱和富集。同时填料层两端的尼龙超滤膜在洗脱过程中可以自动实现超滤功能，去除可能引起高效液相色谱分析柱堵塞的大颗粒。
此外，由于本发明在固相萃取过程采用离心力作为推动力，通过离心机提供的均匀离心环境，可以实现多样品平行萃取，克服真空萃取中真空度不均匀引起的重复性差的问题，提高实验的重现性。
图1为本发明以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒结构示意图。
图2为固相萃取前后100次红豆杉叶片提取液高效液相色谱测量过程中紫杉醇滞留时间的变化。
图3为固相萃取前后100次红豆杉叶片提取液测量对高效液相色谱色谱柱柱压影响。
具体实施例方式
以下结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
如图1所示，以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒包括离心固相萃取柱1，由上端的储液槽、下端的填料管两部分组成，储液槽中部设计有固定用的膨大卡环，使用时卡在离心管口保持萃取柱悬空状态；固相萃取试剂瓶组，分别为样品稀释液瓶2、第一杂质洗脱液瓶3、第二杂质洗脱液瓶4和紫杉烷洗脱液瓶5。离心固相萃取柱和固相萃取试剂瓶组装在同一个盒中，配套使用。
离心固相萃取柱1的储液槽直径为0.5-0.8cm、高度为1-3cm、对应储液槽容积为0.2-1mL，膨大卡环距离储液槽底部0.5-1cm、卡环厚度3mm，填料管长度为0.5-1cm、直径为2-5mm、对应填装HP20树脂填料体积为15-200μL，填料层形状细长，在填料层的上下两端分别设0.22-0.45μm孔径的尼龙超滤膜。
样品稀释液瓶2，装有用作样品稀释液的pH8-10的磷酸缓冲液。
第一杂质洗脱液瓶3，装有作为第一杂质洗脱液的，含5-30％乙醇(体积百分比浓度)、pH12的缓冲液。
第二杂质洗脱液瓶4，装有作为第二杂质洗脱液的，含2-20％乙醇(体积百分比浓度)、pH2的乙醇溶液。
紫杉烷洗脱液瓶5，装有作为紫杉烷洗脱液的，含85-99％乙醇(体积百分比浓度)、pH5的乙醇溶液。
实施例2以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒的使用方法，利用本发明实现紫杉烷标准样品的高效液相色谱预处理用购买自SIGMA的紫杉烷标准品配置含有三种重要紫杉烷类物质的乙醇溶液1毫升，其中含有10微克/升的10DAB(10去乙酰基巴卡亭三)、5微克/升的BACCATINIII(巴卡亭三)和10微克/升的TAXOL(紫杉醇)。
采用本发明以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒，其中离心固相萃取柱1中填料管长度为0.5cm，直径为2mm，对应填装HP20树脂填料体积为15μL，填料层两端各安装一个0.22μm孔径尼龙滤膜，储液槽直径为0.8cm，高度为1cm，对应储液槽容积为0.5mL。
按照本发明所述的以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒的使用方法进行固相萃取过程
1)将离心固相萃取柱1放在离心管中，加60μL的乙醇到该萃取柱1的储液槽中，1000rpm离心，冲洗离该萃取柱1，以上操作反复进行3次，实现柱再生，然后加60μL的pH为10的样品稀释液到再生后的离心固相萃取柱1的储液槽中，1000rpm离心，实现柱平衡，废弃滤液，平衡后的离心固相萃取柱1放入另一离心管中待用；2)取紫杉烷标准品乙醇溶液100μL，然后向紫杉烷标准品乙醇溶液300μL的pH为10的样品稀释液，震荡后直接上样到离心固相萃取柱1的储液槽中，在室温下静止5分钟，然后1000rpm离心，弃去滤液；3)加45μL乙醇浓度为30％的第一杂质洗脱液到经步骤2)处理后的离心固相萃取柱1的储液槽中，静止1分钟后，10000rpm离心弃去滤液；4)加45μL乙醇浓度为10％第二杂质洗脱液到经步骤3)处理后的离心固相萃取柱1的储液槽中，静止1分钟后，10000rpm离心弃去滤液；5)将经步骤4)处理后的离心固相萃取柱1放入另一离心管中，加30μL乙醇浓度为92％的紫杉烷洗脱液到该萃取柱1的储液槽中，静止5分钟后，5000rpm离心收集滤液，该滤液即为经过固相萃取后的紫杉烷萃取液。
标准品以及每一步萃取收集获得的洗脱液，都通过高效液相色谱系统分析其含量。高效液相色谱测量参数如下采用WATERS ANNIANCE系统，RP-C18分析柱3.5μm×150mm，柱温35℃，流动相为60％的甲醇水溶液，进样量为10μL。
为便于比较，将各滤液中的紫杉烷含量按照原始紫杉烷标准品中的含量进行归一化处理，如下表。
表1利用本发明固相萃取试剂盒萃取紫杉烷标准品收率分析
从表中可以看出，在固相萃取过程中，上样步骤中存在一定的紫杉烷损失，碱洗过程紫杉烷损失最小，这与紫杉烷具有弱碱性相关。碱性环境下紫杉烷更多的以疏水状态的分子形式存在，从而更紧密的吸附到树脂填料上，减少进入洗液产生损失的机会；相比较而言，酸性洗脱则产生了最大的损失，因为在酸性环境中紫杉烷容易结合质子而形成亲水的离子形态，从而从疏水性的树脂填料上脱附，进入液相而产生损失。最后获得的紫杉烷萃取液中三种紫杉烷的收率都在95％以上，其中BACCATINIII的收率更是达到了99.6％，损失达到了可以忽略不计的程度。如果样品中碱性杂质比较少的情况下，可以省略酸性步骤，从而进一步提高固相萃取过程的收率。
从以上分析可以看出，本实施例可以高效率的回收紫杉烷类物质，回收率在95.5-99.6％之间。另外考虑到最后获得的紫杉烷萃取液只有60μL，而原始的紫杉烷标准液体积为100μL，因此按照紫杉烷标准液中的浓度，本发明获得的萃取液中紫杉烷浓度提高了59-66％；而按照萃取开始的稀释标准液，则将紫杉烷溶液浓缩了6.36-6.64倍。
实施例3以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒的使用方法，利用本发明实现红豆杉提取液的高效液相色谱预处理取5g新鲜蔓地亚红豆杉叶片，在液氮环境下研磨粉碎，然后用5毫升乙醇超声萃取30分钟，过滤收集乙醇溶液，并通过减压蒸馏浓缩到1毫升。
采用本发明以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒，其中离心固相萃取柱1中填料管长度为1cm，直径为3mm，对应填装HP20树脂填料体积为70μL，填料层两端各安装一个0.45μm孔径尼龙滤膜，储液槽直径设计为0.8cm，高度为2cm，对应储液槽容积为1mL。
按照本发明方法进行固相萃取过程1)将离心固相萃取柱1放在离心管中，加420μL的乙醇到上述萃取柱1的储液槽中，10000rpm离心，冲洗上述萃取柱1，以上操作反复进行5次，实现柱再生，然后加420μL pH为8的样品稀释液到再生的离心固相萃取柱1的储液槽中，10000rpm离心，实现柱平衡，废弃滤液，将平衡后的离心固相萃取柱1放入另一离心管中待用；
2)取红豆杉叶乙醇萃取液200μL，然后向红豆杉叶乙醇萃取液中加600μ的pH为8的样品稀释液，震荡后直接上样到平衡后的离心固相萃取柱1的储液槽中，在室温下静止10分钟，然后5000rpm离心，弃去滤液；3)加210μL乙醇浓度为20％第一杂质洗脱洗液到经步骤2)处理后的离心固相萃取柱1的储液槽中，静止1分钟后，5000rpm离心弃去滤液；4)加210μL乙醇浓度为20％第二杂质洗脱液到经步骤3)处理后的离心固相萃取柱1的储液槽中，静止1分钟后，5000rpm离心弃去滤液；5)将经步骤4)处理后的离心固相萃取柱1放入另一离心管，加200μL乙醇浓度为85％的紫杉烷洗脱液到该萃取柱1的储液槽中，静止10分钟后，1000rpm离心收集滤液，该滤液即为经过固相萃取后的紫杉烷萃取液。
原始的红豆杉叶片乙醇萃取液和上述固相萃取最后获得的萃取液分别取10μL进行高效液相色谱检测，结合各自的体积计算紫杉烷含量。
高效液相色谱测量参数如下采用WATERS ANNIANCE系统，RP-C18分析柱3.5μm×150mm，柱温35℃，流动相为60％的甲醇水溶液，进样量为10μL。
分析发现，和实施例1类似，采用本发明试剂盒对红豆杉叶片乙醇萃取物进行固相萃取，三种重要紫杉烷类物质的收率都达到95％以上，分别为10DAB96.8％，BACCATINIII 99.2％和TAXOL 95.1％分析同时发现，原始的红豆杉叶片乙醇萃取液的高效液相色谱谱图中有非常多的杂质峰，三种紫杉烷所对应的峰面积之和只占到所有峰面积总和的1％。而经过本发明方法萃取后的萃取溶液中，这一比例上升到32％。由于高效液相色谱的图谱中物质的含量与其对应的峰面积成正比，因此可以确定经过本发明方法萃取后，在保证95％以上紫杉烷收率的同时，红豆杉叶片乙醇萃取液中的30％(色谱含量)左右的高度极性、高度非极性、酸性以及强碱性杂质被除去，实现了样品的初步纯化，减轻了高效液相色谱分析的压力，延长了高效液相色谱分析柱的使用寿命。
实施例4以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒的使用方法，利用本发明预处理红豆杉提取液对高效液相色谱测量稳定性和寿命的影响取20g新鲜蔓地亚红豆杉叶片，在液氮环境下研磨粉碎，然后用20毫升乙醇超声萃取30分钟，过滤收集乙醇溶液，并通过减压蒸干，然后加乙醇溶解形成1毫升乙醇溶液。
采用本发明以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒，其中离心固相萃取柱1中填料管长度为1cm、直径为5mm、对应填装HP20树脂填料体积为200μL，填料层两端各安装一个0.33μm孔径的尼龙滤膜，储液槽直径为0.8cm，高度为3cm，对应储液槽容积为1.5mL，离心管为2ml的常规离心管。
按照本发明方法进行固相萃取过程1)将离心固相萃取柱1放在离心管中，加1000μL的乙醇到该萃取柱1的储液槽中，10000rpm离心，冲洗该萃取柱1，以上操作反复进行6次，实现柱再生，然后加1000μL的pH为9的样品稀释液到再生后的离心固相萃取柱1的储液槽中，10000rpm离心，实现柱平衡，废弃滤液，将平衡后的离心固相萃取柱1放入另一离心管中待用；2)取红豆杉叶乙醇萃取液200μL，然后向红豆杉叶紫杉烷乙醇萃取液中加600μL的pH为9的样品稀释液，震荡后直接上样到平衡后的离心固相萃取柱1的储液槽中，在室温下静止15分钟，然后10000rpm离心，弃去滤液；3)加600μL的乙醇浓度为5％的第一杂质洗脱液到经步骤2)处理后的离心固相萃取柱1的储液槽中，静止1分钟后，5000rpm离心弃去滤液；4)加600μL的乙醇浓度为2％的第二杂质洗脱液到经步骤3)处理后的离心固相萃取柱1的储液槽中，静止1分钟后，1000rpm离心弃去滤液；5)将经步骤4)处理后的离心固相萃取柱1放入另一离心管中，加400μL的乙醇浓度为99％的紫杉烷洗脱液到该萃取柱1的储液槽中，静止15分钟后，10000rpm离心收集滤液，该滤液即为经过固相萃取后的紫杉烷萃取液。
向上述固相萃取后获得400μL萃取液中加样品稀释液600μL，形成1mL红豆杉叶片固相萃取液；取原始的红豆杉叶片乙醇萃取液200μL，加入样品稀释液800μL形成1mL红豆杉叶片原液。将上述获得的红豆杉叶片固相萃取液和红豆杉叶片原液分别进行100次高效液相色谱测量，每次进样量20μL，观察随进样次数的增加紫杉醇滞留时间以及柱压的变化，监测高效液相色谱色谱柱被污染的程度高效液相色谱测量参数如下采用WATERS ANNIANCE系统，RP-C18分析柱3.5μm×150mm，柱温35℃，流动相为60％的甲醇水溶液，进样量为10μL。
高效液相色谱分析发现，红豆杉叶片固相萃取液中紫杉烷含量分别为红豆杉叶片原液中的10DAB 95.9％，BACCATINIII 98.9％和TAXOL 95.0％，相应收率都达到95％以上。
从图2、3可以看出，随着测量次数的增加，经过本发明处理过的萃取液，在整个100次的测量过程中，滞留时间和柱压基本保持不变，紫杉醇滞留时间波动在0.04分钟以内，柱压从2780帕上升到2783帕，仅轻微上升了3帕(约0.05％)，说明整个测量过程对色谱柱保持稳定，样品测量造成的污染基本可以忽略不计。按照柱压4000帕的报废标准计算，可以测量个4万个样品；而在对红豆杉叶片原液的100次高效液相色谱测量过程中，发现柱压从2783帕增加到3098帕，上升了11％，按照这种增加速度，该高效液相色谱柱只能进行不到300次的测量就会由于柱压升高到4000帕而报废。同时发现在高效液相色谱测量过程中紫杉醇的滞留时间从18.2提前到15.2，缩短了3分钟，显示样品中存在一些高度极性杂质永久不可逆的结合在填料上，覆盖了C18吸附表面，从而造成滞留时间明显提前。
权利要求
1.一种以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒，包括离心固相萃取柱和固相萃取试剂瓶组，两者装在同一个盒中，其特征在于，所述的离心固相萃取柱包括上部的储液槽和下部填料管两部分，储液槽作为离心前样品和各种洗液的加样槽，填料管中填充有HP20树脂材料，填料层的上下两端分别设尼龙滤膜；所述的固相萃取试剂瓶组，包括样品稀释液瓶，装有用作样品稀释液的pH8-10的磷酸缓冲液，第一杂质洗脱液瓶，装有作为第一杂质洗脱液的、含体积百分比浓度5-30％乙醇、pH12的缓冲液，第二杂质洗脱液瓶，装有作为第二杂质洗脱液的、含体积百分比浓度2-20％乙醇、pH2的乙醇溶液，以及紫杉烷洗脱液瓶，装有作为紫杉烷洗脱液的、含体积百分比浓度85-99％乙醇、pH5的乙醇溶液。
2.根据权利要求1所述的以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒，其特征是，所述的离心固相萃取柱，套在1-2mL的离心管内使用。
3.根据权利要求1所述的以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒，其特征是，所述的储液槽，直径为0.5-0.8cm，高度为1-3cm，对应储液槽容积为0.2-1.5mL。
4.根据权利要求1或者3所述的以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒，其特征是，所述的储液槽用膨大卡环固定，膨大卡环距离储液槽底部0.5-1cm，卡环厚度3mm。
5.根据权利要求1所述的以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒，其特征是，所述的填料管，长度为0.5-1cm，直径为2-5mm，对应填装的HP20树脂填料体积为15-200μL。
6.根据权利要求1或者5所述的以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒，其特征是，所述的填料层形状细长，在填料层的上下两端分别设0.22-0.45μm孔径的尼龙滤膜。
7.一种根据权利要求1中所述的以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒的使用方法，其特征在于，具体步骤如下1)将离心固相萃取柱放在离心管中，加大于等于4倍填料体积的乙醇到该萃取柱的储液槽中，离心，冲洗该萃取柱，以上操作反复进行，实现柱再生，然后加大于等于4倍填料体积的样品稀释液到再生后的离心固相萃取柱的储液槽中，离心，实现柱平衡，废弃滤液，将平衡后的离心固相萃取柱放入另一离心管中待用；2)将紫杉烷样品溶解在乙醇中，然后向紫杉烷乙醇溶液中加3倍体积的样品稀释液，震荡后直接上样到平衡后的离心固相萃取柱的储液槽中，在室温下静止，然后离心，弃去滤液；3)加3倍填料体积的第一杂质洗脱液到经步骤2)处理后的离心固相萃取柱的储液槽中，离心，弃去滤液；4)加3倍填料体积的第二杂质洗脱液到经步骤3)处理后的离心固相萃取柱的储液槽中，离心，弃去滤液；5)将经步骤4)处理后的离心固相萃取柱放入另一离心管中，加2倍填料体积的紫杉烷洗脱液到该萃取柱的储液槽中，静止后，离心，收集滤液，该滤液即为经过固相萃取后的紫杉烷萃取液。
8.根据权利要求7所述的以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒的使用方法，其特征是，所述的离心，其速度为1000-10000rpm。
9.根据权利要求7所述的以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒的使用方法，其特征是，所述的操作反复进行，其次数大于等于3次。
10.根据权利要求7所述的以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒的使用方法，其特征是，所述的静止，其时间至少5分钟。
全文摘要
本发明公开了一种以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒及其使用方法，属于生物化学工程领域。本发明试剂盒包括离心固相萃取柱和固相萃取试剂瓶组，两者装在同一个试剂盒中，配套使用。离心固相萃取柱包括上部的储液槽和下部填料管两部分，储液槽作为离心前样品和各种洗液的加样槽，填料管中填充有HP20树脂材料；固相萃取试剂瓶组包括样品稀释液瓶，第一杂质洗脱液瓶，第二杂质洗脱液瓶，以及紫杉烷洗脱液瓶。本发明还提供了以HP20树脂为填料的固相萃取试剂盒的使用方法，包括离心固相萃取柱的再生和平衡、样品吸附、强碱洗脱、强酸洗脱、以及弱酸洗脱和富集。本发明可以实现紫杉烷样品的完整、高效分离、高收率的固相萃取。
文档编号B01J20/281GK1963493SQ20061011925
公开日2007年5月16日 申请日期2006年12月7日 优先权日2006年12月7日
发明者苗志奇, 于湘莉, 汪业春, 苗海彬, 唐克轩 申请人:上海交通大学