逆流切向色谱的方法及装置的制作方法

专利名称：逆流切向色谱的方法及装置的制作方法
技术领域：
本发明总体涉及色谱。更具体地，本发明涉及利用逆流来促进期望产物的分离并且提高整个色谱处理的效率的切向色谱的方法、系统及装置。
背景技术：
以单克隆抗体类及其他蛋白质为主的新药品生产已有显著且持续的增长，每年约为15-20%。该增长归因于扩张药品渠道以及更有效的细胞系和生物反应器增长优化。生物生产的年成本当前估计为沈亿美元。药品制造商必须进行的最显著投资之一为色谱处理(每年约30%或8. 5亿美元)。色谱是药品生产的构成部分；其在生物技术工业中的目的在于从污染物质从纯化产物蛋白质。业界已开始意识到用于纯化产物蛋白质的色谱步骤的效率不再跟得上生产需求。对此存在多个原因首先，在过去30年中未对柱型色谱处理进行任何显著的改进-产业中的大部分工作着重于新树脂研发。值得注意的例外是业界近来采用的膜色谱。第二，在同一时期内上游技术发生了惊人的改进-生物反应器更大(达到20，000 升)，并且滴定率高得多(较之五年前的l_2g/L，达到15g/L)。由于较长的发酵时间，在生物反应器流出物溶液中通常存在更多的杂志。所有上述原因导致对下游纯化的更重的负荷。第三，柱型色谱具有固有的物理局限性。直径大于2米的柱无法按比例扩大。市场中最大的柱具有2米直径和40厘米底座高度。它们适合1，250L的树脂。假定为树脂的30g/L的粘合容量(对于单克隆抗体类的普遍的蛋白A树脂的容量)，单个循环可粘合 38kg。具有10g/L的输出的20，000L生物反应器将产生200kg的负荷。这意味着市场中最大的柱不得不运行至少6个全循环来加工单批。操作会占用M小时并且会导致对制造工艺的显著瓶颈。最后，在现有的市场中，制造工艺中的一次性正得到普及。一次性加工步骤节约劳力、不需要清洁验证并且对于制造全体人员而言较易于运作。大多数下游工艺中已大幅具有一次性系统。这些是-生物反应器(达到2，000L容积，Xcellerex公司)、微孔过滤(来自I^all公司的KleenPak TFF技术)、深度过滤(POD，MiIlipore公司)、无菌过滤(所有主要制造商)、切向流过滤(所有主要制造商)以及膜色谱(Mustang，I^all公司，Sartobind和 Sartorius公司)。柱型色谱技术由于其固有的局限性而无法成为一次性趋向的一部分。因此，当前不能具有完全一次性的下游工艺-纯化链必须包括无法成为一次性的色谱步骤。
因此，本发明发明人意识到目前技术水平的突破将包括对上述问题的解决方案。 已意识到的是业界需要1)更大规模的操作；2)更快的加工时间；3) —次性；4)介质/树脂费用的减少；以及5)固定设备投资的减少。
在此背景下提出了本发明的各实施例。发明概述因此，本发明的一个实施例是可量的、可靠的且为一次性的技术，其使用再循环原理来显著增加处理效率、增加操作规模并且降低树脂成本。在本发明中，用由两个或更多个连通的切向流动过滤器和静态混合器组成的模块替代色谱柱。色谱树脂单程地流过该模块，同时对树脂进行类似于常规色谱处理的操作 (粘合、洗涤、洗脱、再生以及平衡)。沿着树脂流动的逆流方向将用于这些操作的缓冲剂泵送到所述模块中，并且将来自稍后阶段的渗透物溶液反向循环到先前阶段中。这沿着树脂流动的逆流方向在所述切向流动过滤器的渗透物溶液中产生浓度梯度，从而节约缓冲剂容积并且提高处理效率。来自粘合、洗涤、平衡以及再生操作的渗透物溶液被废弃。来自洗脱操作的渗透物溶液是被收集到单独产物罐中的纯化产物流。据此，本发明的一个实施例是用于逆流切向色谱的模块100(参见图1)，包括第一输入端口(101)，其用于接收输入溶液；第一混合器(102)，其用于将所述输入溶液与来自第二输入端口(10 的再循环溶液相混合以产生第一混合器输出；I级过滤器(104)，其用于浓缩所述第一混合器输出以产生I级渗余物，其中I级渗透物溶液从所述I级过滤器经由第一输出端口(10 流出所述模块；第二混合器(106)，其用于将来自所述I级过滤器 (104)的I级渗余物与来自第二输入端口(107)的任选缓冲剂溶液相混合；以及II级过滤器(108)，其用于浓缩从所述第二混合器(106)的输出以产生II级渗余物，所述II级渗余物从所述II级过滤器经由第二输出端口(110)流出所述模块，其中II级渗透物溶液从所述II级过滤器经由第三输出端口(109)流出所述模块。本发明的另一实施例是上述模块，其中所述输入溶液包括树脂和未纯化产物溶液。本发明的另一实施例是上述模块，其中所述I级渗透物溶液是废液。本发明的另一实施例是上述模块，其中所述I级渗透物溶液是产物。本发明的另一实施例是上述模块，其中所述第二混合器接收清洁缓冲剂溶液。本发明的另一实施例是上述模块，其中所述第二混合器不接收清洁缓冲剂溶液。本发明的另一实施例是上述模块，其中所述第三输出端口(109)经由泵(112)和三通阀(111)连接至所述第二输入端口(103)。(参见图1。)本发明的另一实施例是上述模块，其中所述三通阀(111)将从所述第三输出端口 (109)的输出送至废液区或产物区(11 或送至所述第二输入端口(10 。(参见图1)本发明的另一实施例是上述模块，其中所述I级过滤器和所述II级过滤器是切向流动过滤器。本发明的又一实施例是一种用于逆流切向色谱的系统(300)(参见图3)，包括 用于逆流切向色谱的模块(100)；第一树脂罐(302)，其用于贮存与所述模块的第一输入端口(101)连接的清洁树脂；输入罐(304)，其用于贮存与所述第一输入端口(101)连接的输入溶液；泵(11 和三通阀(111)，其将所述模块的第二输入端口(10 与第三输出端口(109)连通；第二树脂罐(325)，其用于贮存经由泵(32 和三通阀(317)而与所述模块的第二输出端口(110)连接的树脂和经由泵(313)而与所述模块的第一输入端口(101)连接的树脂；产物罐(309)，其用于捕获经由三通阀(307)和泵(308)而与所述模块的所述第一输出端口(10 连接的产物溶液；以及一个或多个缓冲剂罐(316、318、320、322)，其用于贮存经由泵(314)而与所述模块的所述第三输入端口(107)连接的缓冲剂溶液，其中所述第一树脂罐(302)经由三通阀(317)连接至第二树脂罐(325)和泵(323)。本发明的另一实施例是上述系统，还包括附加的逆流切向色谱阶段，其包括第三混合器(530)和第三过滤器(532)以提高所述系统的效率。(参见图5)本发明的其他实施例包括对应于上述系统的方法、由上述模块而构成的系统以及上述系统和模块的操作方法。从如附图中所例示的本发明各实施例的下述更加详细的描述中将明了本发明各实施例的其他特征和优点。


图1示出了根据本发明的一个实施例的逆流切向色谱的模块。图2A示出了在粘合模式期间模块中的流动方向，而图2B示出了在洗脱、洗涤、平衡以及再生模式期间模块中的流动方向。图3示出了根据本发明的一个实施例的在分批模式中操作的逆流切向色谱系统的框图。图4示出了图3的逆流切向色谱系统的另一框图。图5示出了根据本发明的另一实施例的另一逆流切向色谱系统的框图。图6示出了根据本发明的又一实施例的在连续模式中操作的另一逆流切向色谱系统的框图。图7A、7B以及7C示出了根据本发明的又一实施例的在分批模式中操作的逆流切向色谱的处理流程图。图8示出了根据本发明的又一实施例的在连续模式中操作的逆流切向色谱的处理流程图。图9示出了根据本发明的原理的二级逆流切向色谱系统的数学模型的结果，示出了针对各种筛分系数而言缓冲剂与树脂的流速之比(伽马)对百分比产量。图10示出了根据本发明的原理的三级逆流切向色谱系统的数学模型的结果，示出了针对各种筛分系数而言缓冲剂与树脂的流速之比(伽马)对百分比产量。
具体实施例方式定义下沭专业术语将在整篇说明书中具有以下赋予的含义。粘合樽式是树脂和未纯化产物形成可逆ff合物的操作阶段。洗涤樽式是利用洗涤缓冲剂洗涤具有粘合产物的树脂以去掉杂质树脂的操作阶段。 Μ式是将树脂和产物的复合物逆转并且收集纯化产物的操作阶段。再牛樽式是为了再利用或为了后续循环而清洁树脂的操作阶段。平衡樽式是在中性缓冲剂中使系统平衡的操作阶段。
如发明内容部分所陈述的那样，在本发明中，用由两个或更多个连通的切向流动过滤器和静态混合器组成的模块替代色谱柱。色谱树脂单程地流过该模块，同时对树脂进行与常规色谱处理相似的操作(粘合、洗涤、洗脱、再生以及平衡)。沿着树脂流动的逆流方向将用于这些操作的缓冲剂泵送到该模块中，并且将来自稍后阶段的渗透物溶液反向循环到先前阶段中。这沿着树脂流动的逆流方向在切向流动过滤器的渗透溶液中产生浓度梯度，从而节省缓冲剂容积并且提高处理效率。来自粘合、洗涤、平衡以及再生操作的渗透物溶液被废弃。来自洗脱操作的渗透物溶液是被收集到单独产物罐中的纯化产物流。据此，图1示出了逆流切向色谱的模块100的框图(虚线之内)。输入溶液在端口 101进入，并且输入溶液与来自端口 103的任何输入(在粘合模式期间没有输入)在静态混合器102内混合。从静态混合器102的输出进入切向流动过滤器104，渗透物在端口 105从切向流动过滤器104退出模块。来自切向流动过滤器104的渗余物被送入静态混合器106， 静态混合器106可在端口 107接收纯化缓冲剂。从静态混合器106的输出被送入切向流动过滤器108，渗透物在端口 109从切向流动过滤器108经由泵112被泵送到模块之外。三通阀111用于将液流引向废液区113或引向端口 103。来自切向流动过滤器108的渗余物在端口 110流出模块。在洗涤、洗脱、平衡以及再生期间，三通阀111将液流引向端口 103，其中端口 103与输入101在静态混合器102中混合。在粘合期间，三通阀111将液流引向废液区113。图2A示出了在粘合模式期间图1的模块100中的流动方向。注意到液流的单程性质以及在端口 103和端口 107没有液流进入的事实。树脂与非纯化产物溶液的混合物在左侧通过端口 101进入(通过混合器102)，流过过滤器104(渗透物在端口 105流出为废液)，流过混合器106，流过过滤器108(渗透物在端口 109经由泵112和三通阀111流出为废液)，并且在右侧通过端口 110流出模块。图2B示出了在洗脱、洗涤、再生以及平衡模式期间模块100中的流动方向。注意到液流的单程性质以及液流从端口 109经由泵112和三通阀111到端口 103沿逆流方向循环的事实。注意到如何在该构造中，清洁缓冲剂溶液在端口 107进入，并且循环缓冲剂溶液在端口 103进入。还注意到液流的逆流性质，其中被处理溶液如图2A那样从左向右流动， 而循环缓冲剂溶液沿着被处理溶液的从左向右流动的“逆流”方向经由泵112和三通阀111 从右向左流动。图3示出了根据本发明的另一实施例的在分批模式中操作的逆流切向色谱系统 300的框图。模块100以与关于图1所示和所述的相同方式操作。模块100的输入端口 101 连接至泵303、305以及313。泵303泵送来自第一树脂罐302的树脂。泵313泵送来自第二树脂罐325的树脂。泵305泵送来自输入罐304的未纯化产物溶液。如图1所示，模块 100的端口 103经由三通阀111和泵112连接至模块100的端口 109。废液在113流出系统。从端口 105的输出连接至泵306，泵306连接至三通阀307。三通阀307连接至产物罐 309和废液区308。端口 107经由泵314接收到模块100的输入，泵314经由阀315、317、 319以及321连接至平衡罐316、洗涤罐318、洗脱罐320以及再生罐322。从端口 110的输出经由泵323和三通阀317被泵送至第一树脂罐302和第二树脂罐325。将图3中的系统设计为利用分批模式操作处理树脂。树脂随着其从第一树脂罐 302向第二树脂罐325循环而依次受到不同色谱处理(粘合、洗涤、洗脱、再生以及平衡)的处理，反之亦然。例如，在第一阶段(粘合)期间，树脂经由泵303从左向右通过模块100 从罐302通向罐325。在下一阶段(洗涤)期间，树脂经由泵313从左向右通过模块100从罐325通向罐302。其他阶段(洗脱、再生以及平衡)以类似的方式轮换罐。洗涤、洗脱、再生以及平衡期间的逆流操作允许更高的效率和缓冲剂节约。图4示出了图3中所示的逆流切向色谱系统的框图400，其中示出了模块100的内部结构。图4除了如图1中那样示出模块100的内部之外，同于图3。图5示出了根据本发明的另一实施例的另一逆流切向色谱系统500的框图500。 本实施例类似于图3和图4，除了添加有逆流过滤的附加(第三)阶段之外，该逆流过滤由如图5中所示的连通的混合器530、过滤器532、泵533以及三通阀531组成。废液在536 流出。图5中所示的实施例以类似于图3和图4中所示系统的方式操作，除了液流通过第三阶段之外，该第三阶段提高了处理效率并且减少了缓冲剂使用，但将某些复杂性引入设计。下述数学模型显示使用多于三级对于处理效率而言不产生任何显著提高而引入实质的复杂性。因此，多于三级尽管根据本发明的原理是可行的并且处在本发明的范围之内，但不再进一步描述。图6示出了根据本发明的又一实施例的在连续模式中操作的另一逆流切向色谱系统的框图600。模块610( “粘合阶段”)、模块620( “洗涤阶段”)、模块630( “洗脱阶段”)、模块640( “再生阶段”)以及模块650( “平衡阶段”)以类似于图1、图2A以及图2B 中所示的模块100的操作的方式操作。模块620、630、640以及650上的粗黑线代表在所示每个模块上第三输出端口(109)与第二输入端口(103)经由泵(112)和三通阀(111)的连接。为了清晰起见在图6中未示出这些泵和三通阀，但如图1所示它们存在于每个模块 620,630,640以及650中。注意到，模块610( “粘合阶段”)的第三输出端口 (609)和第二输入端口(607)不是连通的，这是因为在该模块中端口 609和端口 607均通向废液区。粘合阶段模块610在端口 605经由泵604连接至非纯化产物罐602，经由泵606连接至树脂罐608，并且经由三通阀658和泵657连接至平衡缓冲剂罐656。模块610上的端口 607和端口 609通向废液区。洗涤阶段模块620在端口 613经由泵612连接至粘合阶段模块610的输出端口 611。端口 621经由泵622通向废液区。洗涤缓冲剂从洗涤缓冲剂罐拟4经由泵拟6在端口 627进入。洗脱阶段模块630在端口 625经由泵拟4连接至洗涤阶段模块620的输出端口 623。洗脱缓冲剂从洗脱缓冲剂罐638经由泵639在端口 637进入。纯化产物在端口 627 经由泵636流出模块630至产物贮存罐632中。再生模块640在端口 635经由泵634连接至模块630的输出端口 633。废液在端口 643经由泵646流出。再生缓冲剂从再生缓冲剂罐642经由泵641在端口 645进入。平衡模块650在端口 649经由泵648连接至再生模块640的输出端口 647。从端口 651经由泵652将树脂泵送到树脂贮存罐608中。在端口 661经由泵653从模块650泵送废液。平衡缓冲剂从平衡缓冲剂罐656经由三通阀658和泵657在端口 659进入。据此，不同于被设计为以轮换分批模式处理树脂/产物的图3的系统，其中树脂在第一与第二树脂罐之间轮换，图6的系统被设计为以单次连续通过处理树脂/产物，其中树脂从树脂罐608通过模块610、620、630、640以及650连续流动并且返回至树脂罐608。图6中所示的系统的连续性质允许固定量的树脂用于处理基本不限量的未纯化产物，仅取决于树脂的使用寿命。图7A、7B以及7C示出了根据本发明的又一实施例的在分批模式中操作的逆流切向色谱的处理700的流程图。处理700开始于步骤702。如步骤704所示，用平衡缓冲剂冲洗系统。在步骤706中，开始粘合阶段(以粗体强调)。如步骤708所示，以适当的流速将树脂和非纯化产物泵送入系统。如步骤710所示，仅在粘合阶段期间将来自所有阶段的渗透物溶液作为废液废弃。如步骤712所示与粘合产物一起收集树脂。在步骤714中，开始洗涤阶段(以粗体强调)。如步骤716所示，用洗涤缓冲剂冲洗系统。如步骤718所示，在洗涤阶段期间再循环并且使用逆流渗透物以便根据本发明的原理提高处理效率并且节约缓冲剂溶液。如步骤7M所示，将具有粘合产物的树脂泵送回到系统的第一阶段，其中该树脂与再循环的洗涤缓冲剂混合。如步骤7 所示，将经洗涤的具有粘合产物的树脂收集到第一树脂罐中，而将渗透物溶液作为废液废弃。在步骤728中，开始洗脱阶段(以粗体强调)。如步骤730所示，用洗脱缓冲剂冲洗系统。如步骤732所示，在洗脱阶段期间再循环并且再使用逆流渗透物以便提高处理效率并且节约缓冲剂溶液。如步骤734所示，将粘合有产物的树脂泵送回到系统的第一阶段， 其中该树脂与再循环的洗脱溶液混合。在步骤736中，将来自第一阶段的渗透物溶液收集为产物溶液(以粗体强调)。如步骤738所示，将树脂收集到第二树脂罐中。在步骤740中，开始再生阶段(以粗体强调)。如步骤742所示，用再生溶液冲洗系统。如步骤744所示，在再生阶段期间再循环并且再使用逆流渗透物，以便提高处理效率并且节约缓冲剂溶液。如步骤746所示，将树脂泵送到第一阶段，其中该树脂与再循环的再生溶液混合。如步骤748所示，将渗透物溶液作为废液废弃。在步骤750中，将树脂收集到第一树脂罐中(以粗体强调)，因此完成循环并且允许树脂的再使用。最后，如步骤752所示，如果需要更多循环，则可重复使用平衡缓冲剂的平衡处理。选择性地，如步骤752所示，如果树脂需要贮存则可利用贮存溶液进行平衡处理。处理 700结束于步骤754。图8示出了根据本发明的又一实施例的在连续模式中操作的逆流切向色谱的处理800的流程图。处理800开始于步骤802。如步骤804所示，用平衡缓冲剂冲洗粘合阶段(图6的模块610)。如步骤806所示，用洗涤缓冲剂冲洗洗涤阶段(图6的模块620)。 如步骤808所示，用洗脱缓冲剂冲洗洗脱阶段(图6的模块630)。如步骤810所示，用再生缓冲剂冲洗再生阶段(图6的模块640)。如步骤812所示，用平衡缓冲剂冲洗平衡阶段 (图6的模块650)。如步骤814所示，以适当的流速将树脂和非纯化的产物送入系统的第一阶段(图6的模块610)。如步骤816所示，以适当的流速将所有缓冲剂溶液送入适当的阶段。如步骤818所示，从洗脱阶段(图6的模块630)收集纯化产物，而将所有其他缓冲剂溶液废弃至废液区。如步骤820所示，整个系统保持连续运行直到非纯化产物溶液完全被消耗为止。处理800结束于步骤822。MS产物回收率是色谱中最重要的成本动因之一。这是因为蛋白质分子具有极高的值。捕获式色谱处理应该具有至少90%的回收率。因此，决定对本发明的产物回收阶段(洗脱阶段)建模。在该模型中做出以下假设1.模块中的切向流动(TFF)膜能够以适当的转换因数(80%以上)处理树脂和洗脱缓冲剂的浆体。2.产物分子从树脂的脱附动力学是快速的。3. TFF膜的筛分系数在整个处理中应该恒定。4.系统是无“死角”的。在该模型中研究下述变量对百分比产量(％回收率)的影响1. “伽马(Y)”是洗脱缓冲剂流速与树脂缓冲剂流速之比，并且影响产物的稀释度、缓冲剂用量以及洗涤效率。该变量可由操作者控制。2. “S”是TFF膜对产物分子的筛分系数。S等于渗透物中的产物浓度除以渗余物中的产物浓度。这是膜的固有特性并且不能由操作者改变。3. “N”是级数；本模型研究操作中的二级和三级系统。随着级数增加，在所有其他变量保持恒定的情况下，洗涤效率和产物回收率增加。然而，更多的级数增大了系统的复杂性和成本。利用物质平衡并且求解％产量而导出模型方程。引入新变量α = Y 将变得方便。方程1示出了作为α的函数的二级系统的百分比产量
(1)% 产量=(1----* 100%
(l+a + a )方程2示出了作为α的函数的三级系统的百分比产量
(2)%产量=(1--l--) * ι οο%
(I-Hx+ a +a )图9和图10示出了该模型的结果；伽马(γ)是自变量，并且百分比(％)产量是因变量。对于两个模型的特定筛分系数(s = 0. 5,0. 7,0. 8，1. 0)生成百分比产量曲线。图9示出了对于二级逆流切向色谱系统的结果，其示出了针对各筛分系数s = 0.5，0.7，0.8，1.0而言缓冲剂与树脂的流速之比(伽马)对百分比产量。图10示出了对于三级逆流切向色谱系统的结果，其示出了针对各筛分系数s = 0.5，0.7，0.8，1.0而言缓冲剂与树脂的流速之比(伽马)对百分比产量。模型的结果显示二级和三级系统均可实现大于95%的产量。因为在该系统中所用的膜将是微孔的因而预计相对自由地通过产物分子，因此对于这些处理的筛分系数预计处于W. 8-1.0]的范围之内。二级系统将需要比三级系统高的缓冲剂与原料比(Y)来实现相同的百分比(％)产量。因此，对于二级系统而言推荐的操作伽马(Y)是4至6，对于三级系统而言推荐的操作伽马(Y)是3至4。此处所描述的建模实例是在如图5所示的在分批模式中操作的三级逆流切向色谱系统中具有20，000L生物反应器收获物、5g/L IgG浓度的蛋白质A捕获。该实例例举了本发明的许多操作模型之一。
该建模实例做出以下假设1.停留时间=0. 5分钟(理想“小”的蛋白质A颗粒)2.树脂容量=30g/L3.将General Electric 空心纤维用作TFF膜。根据现有的大规模 General Electric 模块使用面积和滞留容积。4.流量=100LMH5.在TFF过滤器中假定80%转换因数。表1.建模结果
容积 20000L 产物浓度 5g/L 总产物 IOOkg 总膜面积 300m2 级数3
洗涂稀释度因数4 树脂容积 300L 树脂容量 30g/L
流量100LMH
一个循环处理9kg MAB 一个循环容积 1800L
停留时间 0.5分钟静态混合器容积100L 总流速 200L/分钟树脂流速 28.6L/分钟总循环时间0.66小时
原料流速 171.4L/分钟循环数12
原料流量 34.3LMH 总处理时间7.9小时该模型的结果显示出下述1.可用300L的树脂处理20，000L的未纯化产物，这表示相对于传统的柱型色谱有所减少4倍。2.可以以单次8小时轮换进行操作。3.可以通过增加树脂容积来减少循环数。4.可通过增加流量来提高效率和处理时间。
12
粘合阶段时间0.175小时
洗涤容积4倍树脂容积(RV ) 1200L 洗涤阶段时间0.120小时
洗脱容积4倍树脂容积(RV) 1200L 洗脱阶段时间0.12小时
再生缓冲剂容积(4RV)任选1200L 洗涤时间0.120小时
平衡缓冲剂容积(4RV) 1200 洗涤时间0.120小时
发明人意识到本发明对于下游纯化处理的众多的基本优点，包括1.当前的技术可容易地适用于该处理，这是因为现有的组成部分在市场中可容易获得。也就是说，切向流动过滤器(过滤片、空心纤维以及陶瓷膜)和色谱树脂可容易获得。 利用比传统的柱型色谱小的颗粒开发针对本发明专门设计的新树脂线会是有利的。这将使质量传递限制无效，增加动态粘合容量并且使处理更加高效。2.类似于任何切向流动系统，可根据需要尽可能大地调整根据本发明的原理的切向色谱系统。这不是具有传统的柱型色谱的情况-市场中最大的可量柱当前局限于直径2 米。3.可以如图6所示那样设计连续模式的逆流切向色谱。通常，连续处理更高效并且需要较小的系统尺寸。4.以完全一次性方式运行本系统存在潜力。这是因为与柱型色谱相比该操作需要小得多的量的树脂(这对于诸如离子交换树脂等较便宜的树脂种类而言将是成立的)。另外，以较小尺度的切向流动过滤器也可一次性地使用。5.树脂的使用可以是低于传统色谱的数量级，导致多达80%的显著成本节约。因此，本发明人意识到本发明的众多应用导致每年8. 5亿美元以上的色谱处理市场。Jen-Chang Hsia的发明名称为“切向流动亲和超滤”的美国专利No. 4，780，210描述了用于胰蛋白酶纯化的处理。更具体而言，该专利涉及生物化学纯化的处理，其组合了亲和色谱的处理技术与切向超滤，并且能够连续流动地或半连续流动地进行操作，供所感兴趣的生物分子的纯化(或分离)之用。本发明的处理由于逆流和单程性质连同各种其他改进而可证实是不同的。美国专利No. 4，780’ 210中所描述的处理不适合于生物技术市场。Henry B. Kopf 的美国专利 No. 6，139，746 和 No. 6，214，221 (在下文中为“Kopf 专利”)描述了利用横向过滤器元件系统从源液体中纯化目标物质的处理和装置。如图2、图 5以及图6所示，Kopf专利描述了这样的系统和处理其使源液体与树脂接触，允许树脂粘合目标物质的期望馏分，在横向流动过滤器系统中再循环树脂并且最终从树脂中回收目标物质。逆流切向色谱(CTC)显示了与这些专利的至少三个区别第一，CTC是基于材料的连续且恒态的处理(单程)的处理和系统；第二，CTC使用逆流再循环回路来将缓冲剂再循环至处理的起点；第三，CTC使用静态混合或静态混合器来将树脂与源液体结合，这与搅拌式或完全流动混合相反。下面依次分别讨论这些连续且恒态的处理CTC允许在目标产物流过CTC系统时与树脂进行一次通过的、 连续且恒态的溶解。与非连续/非恒态系统/处理相比，该树脂处理和产物分离是高度有效的并且提供更高效的产量。Kopf专利依靠树脂的分批且非恒态的处理。Kopf系统也专门着重于小(几μπι)的无细孔颗粒，但CTC系统对于采用宽泛的颗粒类型足够灵活。逆流再循环回路=CTC描述了缓冲剂与树脂/渗透物之间的逆流流动。逆流流动沿着树脂流动的逆流方向在切向流动过滤器的渗透物溶液中产生浓度梯度。该逆流流动节省了缓冲剂容积并且增大了处理效率。以上所示的建模结果可提供对这些权利要求的支持。静态混合CTC使用静态混合或静态混合器。包含静态混合器在性能改进和成本改进方面是显著的。与CTC系统的批量实施相比，Kopf系统是最适当的；如先前所注意到的那样，Kopf结构不服从于连续操作。尽管两种情况下的分离器均为膜过滤装置，但接触单元不同在Kopf中为搅拌槽而在CTC中为静态混合器。静态混合器具有允许良好控制接触时间的优点，而搅拌槽导致接触时间的宽广分布。另外，搅拌槽中的阻塞较高；CTC单元中的相应阻塞较小。因此，Kopf系统的基建费用较高，但其也锁闭在操作规模中，这对于CTC 系统而言更易于改变，CTC系统具有相对廉价的功能单元并且确实可被处置为一次性。本发明的工业实用件和优点逆流切向色谱(CTC)方法提供了在摆脱普通的填充柱形式的框架内获得色谱纯化的某些益处的手段。该方案采用接触器-分离器功能单元，其与基于搅拌槽的变换方法相比允许更好地控制接触时间。这种单元在允许适于最优粘合效率的流速的匹配方面可特别有效。以相同的形式进行后续步骤(洗涤、洗脱、再生、平衡)。整个结构看来最适合于捕获步骤，并且提供了降低基建费用、易于扩大以及使用一次性组件的优点。以预备的粘合-洗脱模式操作的色谱固有地为分批处理，其设计必须平衡快速质量传递的优点与快速动量传递(表现为高压降)的缺点。这种权衡导致对流速、颗粒尺寸以及柱长的限制，同时涉及诸如流动分布等因素的实际问题限制柱直径。CTC框架允许避免若干上述问题，还引入某些附加因素尽管基本的CTC接触单元服从于分批操作，但也可经由接触单元的重复来实现完全连续操作。对于制药操作而言，连续操作由于低容积色谱系统处理大容积原料的优点而是重要的。基本的CTC接触单元是平衡阶段接触器-分离器单元的新式等效，尽管静态混合器和空心纤维或类似分离单元的使用显著减少了分散(反混)，其允许更好地控制接触时间。串联使用2-3个这些单元允许即使在相当短的接触时间内也可实现相对完全的质量传递。与良好混合系统接触的填充床的替换消除了对颗粒尺寸减小，即柱压降的主要约束。从而可以使用更小的颗粒尺寸，允许更快的质量传递，尤其在装料期间亦是如此。在良好混合系统中装料的另一优点是控制树脂流动与原料流动的容积平衡的能力。在稀释原料和相对高容量对于这些种类的处理而言是典型的情况下，将填充柱装料至接近全容量需要以低流速对许多柱容积给料，而树脂悬浮液的使用允许直接保持流量比。去除大的填充柱除去了主要的基建投资，而以较小、较便宜且潜在一次性的CTC 功能单元来代替。静态混合器和空心纤维模块均可获得为各种尺寸，使得扩大成为可能。实验结果材料和方法所有的代谱实验用强固的阴离子交换树脂，即由Bio-Rad实验室 (Hercules, CA)捐赠的Macro-Prep 25Q来实施。该树脂的公称颗粒尺寸是25微米，公称孔隙尺寸为725埃。由光谱实验室(RanchoDomingue^CA)捐赠MidiCros 空心纤维模块(产品编号-X32E-901-02N)。每个空心纤维模块封装十根具有0. 2微米孔隙尺寸的聚醚砜纤维，并且长约64cm，内径为1mm，从而每个模块的总表面积为200cm2。静态混合器长为 11. 25英寸，内径为0.4英寸，并且从Koflo公司(Cary, IL)购得。牛血清清蛋白(A7906) 和来自马骨骼肌的肌红蛋白(M0630)从Sigma-Aldrichd Louis，M0)购得。通过将适当量的磷酸氢二钠七水合物(J. T. Baker)和磷酸二氢钾晶体(J. T. Baker)溶解在去离子水中来制备磷酸缓冲剂，从电阻率大于18M Ω-cm的NANOpure Diamond水净化系统(BarnsteadThermolyne公司)获得去离子水。利用Hiermo Orion型420Aplus pH计来测量溶液的pH， 并且根据需要通过添加0. IM HCl或NaOH来调节。通过将适当量的氢化钠(J.T.Baker)溶解在PH为7的20mM离子强度的磷酸缓冲剂中来制备高离子强度的洗脱缓冲剂。分析利用分光光度计根据^Onm的吸光度确定从粘合动力学实验收集的样本中的BSA浓度。由连续稀释度对BSA建立校准曲线以便将吸光度读数转换为BSA浓度。尺寸排阻色谱被用于定量地分析在二级CTC处理期间收集的样本是否存在BSA和肌红蛋白。 将具有来自 GE Healthcare (Uppasala, Sweden)的 Superdex 200，10/300 凝胶渗透柱的 Agilent 1100HPLC系统用于尺寸排阻色谱，其给出BSA与肌红蛋白峰值之间的极佳的基线分辨度。将PH为7的50mM磷酸缓冲剂中的0. 15M NaCl用作流速为0. 4mL/min的流动相。 在30s的时期内注入100微升样本，并且在205nm的Agilent 1200系列UV-Vis检测器上对来自Superdex 200柱的流出物监控蛋白质浓度。将适当的校准曲线用于根据峰值面积计算BSA和肌红蛋白的浓度。二级CTC实验泵将浓缩的浆体从原料罐驱动至第一静杰混合器,在该处其与来自第二空心纤维模块的渗透物流以适当的比例混合。第一静态混合器提供浓缩的新鲜树脂浆体与来自第二空心纤维单元的渗透物流之间随充足停留时间的良好混合。来自第一静态混合器的经良好混合的稀释浆体进入第一空心纤维单元并且被分成两股流作为渗余物流的浓缩树脂浆体和无树脂的渗透物流。来自第一空心纤维模块的渗透物流作为产物或废液被收集在罐中。第一空心纤维模块的渗余物流进入第二静态混合器，在该处其再次与新鲜缓冲剂(在洗涤或洗脱步骤的情况下)或原料蛋白质溶液(在粘合步骤的情况下)以适当的比例相混合。来自第二静态混合器的稀释浆体进入第二空心纤维模块并且被分成两股流由浓缩树脂浆体构成的渗余物流和无树脂的渗透物流。来自第二空心纤维模块的渗透物被引向第一静态混合器同时将渗余物收集在单独罐中以进行进一步处理。使用双通道渗透泵在恒定流量模式下使用空心纤维膜模块，并且使用压力传感器监控沿着膜的压降以及与膜交叉的压降。
二元蛋白质系统(BSA/肌红蛋白)的完全分离达到了 99. 5%的BSA纯度和 93%的产量。理论建模和实验结果显示符合5%之内。据此，尽管参考按照特定顺序进行的特定操作描述并且示出了本文所公开的方法，但应当理解的是，在不背离本发明教义的情况下，这些操作可以组合、再细分或重排序以形成等效方法。据此，除非本文具体指出，否则操作的顺序和分组不是本发明的限制。最后，尽管参考本发明的特定实施例特定地示出并且描述了本发明，但本领域技术人员将理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，如所附权利要求所限定的那样，可对形式和细节进行各种其他修改。
权利要求
1.一种用于逆流切向色谱的模块，包括 第一输入端口(101)，其用于接收输入溶液；第一混合器(102)，其用于将所述输入溶液与来自第二输入端口(10 的再循环溶液相混合以产生第一混合输出；I级过滤器(104)，其用于浓缩所述第一混合输出以产生I级渗余物，其中I级渗透物从所述I级过滤器经由第一输出端口(10 流出所述模块；第二混合器(106)，其用于将来自所述I级过滤器(104)的I级渗余物与来自第三输入端口(107)的任选缓冲剂溶液相混合以产生第二混合输出；以及II级过滤器(108)，其用于浓缩所述第二混合输出以产生II级渗余物，所述II级渗余物从所述II级过滤器经由第二输出端口(110)流出所述模块，其中II级渗透物从所述II 级过滤器经由第三输出端口(109)流出所述模块。
2.如权利要求1所述的模块，其中，所述输入溶液包括树脂和未纯化产物溶液。
3.如权利要求1所述的模块，其中，所述I级渗透物是废液。
4.如权利要求1所述的模块，其中，所述I级渗透物是产物。
5.如权利要求1所述的模块，其中，所述第二混合器(106)接收清洁缓冲剂溶液。
6.如权利要求1所述的模块，其中，所述第二混合器(106)不接收清洁缓冲剂溶液。
7.如权利要求1所述的模块，其中，所述第三输出端口(109)经由泵(112)和三通阀 (111)连接至所述第二输入端口(103)。
8.如权利要求7所述的模块，其中，所述三通阀(111)将从所述第三输出端口(109)的输出送至废液区(11 或送至所述第二输入端口(103)。
9.如权利要求1所述的模块，其中，所述I级过滤器(104)和所述II级过滤器(108) 是切向流动过滤器。
10.如权利要求1所述的模块，其中，所述第一混合器(10 和所述第二混合器(106) 是静态混合器。
11.一种用于逆流切向色谱的系统，包括 用于逆流切向色谱的模块；第一树脂罐(302)，其用于贮存与所述模块的第一输入端口(101)连接的树脂； 输入罐(304)，其用于贮存与所述模块的第一输入端口(101)连接的未纯化产物溶液； 将所述模块的第二输入端口(10 与第三输出端口(109)连通的泵(11 和三通阀 (111)；第二树脂罐(325)，其用于贮存经由泵(32 和三通阀(317)而与所述模块的第二输出端口(110)连接的树脂和经由泵(313)而与所述模块的第一输入端口(101)连接的树脂； 产物罐(309)，其用于捕获经由三通阀(307)和泵(306)而与所述模块的所述第一输出端口(10 连接的纯化产物溶液；以及一个或多个缓冲剂罐，其用于贮存经由泵(314)而与所述模块的所述第三输入端口 (107)连接的缓冲剂溶液。
12.如权利要求11所述的系统，其中，所述用于逆流切向色谱的模块包括第一混合器(102)，其用于将输入溶液与来自第二输入端口(10 的再循环溶液相混合以产生第一混合输出；I级过滤器(104)，其用于浓缩所述第一混合输出以产生I级渗余物，其中I级渗透物从所述I级过滤器经由第一输出端口(10 流出所述模块，所述第一输出端口(10 经由泵(306)和三通阀(307)连接至所述产物罐(309)；第二混合器(106)，其用于将来自所述I级过滤器(104)的I级渗余物与来自第三输入端口(107)的任选缓冲剂溶液相混合以产生第二混合输出，其中所述第二输入端口(107) 连接至所述一个或多个缓冲剂罐；以及II级过滤器(108)，其用于浓缩所述第二混合输出以产生II级渗余物，所述II级渗余物从所述II级过滤器经由第二输出端口(110)流出所述模块，其中II级渗透物从所述II 级过滤器经由第三输出端口(109)流出所述模块。
13.如权利要求12所述的系统，还包括附加的逆流切向色谱阶段，其包括第三混合器(530)和第三过滤器(532)以提高所述系统的效率。
14.一种用于逆流切向色谱的方法，包括 接收来自第一输入端口(101)的输入溶液；将所述输入溶液与来自第二输入端口(10 的再循环溶液相混合以产生第一混合输出；浓缩所述第一混合输出以产生I级渗余物，其中I级渗透物经由第一输出端口(105) 流出；将所述I级渗余物与来自第三输入端口(107)的任选缓冲剂溶液相混合以产生第二混合输出；以及浓缩所述第二混合输出以产生II级渗余物，所述II级渗余物经由第二输出端口(110) 流出，其中II级渗透物经由第三输出端口(109)流出。
15.如权利要求14所述的方法，还包括平衡步骤，其包括在粘合步骤之前用中性缓冲剂冲洗。
16.如权利要求14所述的方法，其中，所述粘合步骤还包括 以适当的流速泵送来自第一树脂罐的树脂和非纯化产物； 将来自所有阶段的渗透物作为废液而废弃；以及将具有粘合产物的树脂收集在第二树脂罐中。
17.如权利要求14所述的方法，其中，所述洗涤步骤还包括 用洗涤缓冲剂冲洗；将具有粘合产物的树脂泵送到第一阶段内，在所述第一阶段所述具有粘合产物的树脂与来自第二阶段的再循环洗涤缓冲剂相混合；将具有粘合产物的经洗涤树脂收集在第一树脂罐中；以及将来自所述第一阶段的渗透物作为废液而废弃。
18.如权利要求14所述的方法，其中，所述洗脱步骤还包括 用洗脱缓冲剂冲洗；将具有粘合产物的树脂泵送到第一阶段内，在所述第一阶段所述具有粘合产物的树脂与来自第二阶段的再循环洗脱缓冲剂相混合；将来自所述第一阶段的渗透物作为纯化产物进行收集；以及将树脂收集在第二树脂罐中。
19.如权利要求14所述的方法，还包括再生步骤，在所述再生步骤期间对树脂进行清洁以备下一循环再使用。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述再生步骤还包括 用再生溶液冲洗；将树脂泵送到第一阶段内，在所述第一阶段所述树脂与来自第二阶段的再循环再生溶液相混合；将来自所述第一阶段的渗透物作为废液而废弃；以及将树脂收集在第一树脂罐中。
21.如权利要求19所述的方法，还包括附加的平衡步骤，包括如果需要附加的循环则在所述再生步骤之后用平衡缓冲剂冲洗。
22.如权利要求19所述的方法，还包括贮存步骤，包括如果树脂需要贮存则用贮存溶液冲洗。
全文摘要
本发明涉及色谱技术中的突破，其允许1)更大规模的操作；2)更快的处理时间；3)一次性；4)介质/树脂费用的减少；以及5)固定设备投资的减少。在本发明中，用由两个或更多个连通的切向流动过滤器和静态混合器组成的模块替代色谱柱。色谱树脂单程地流过该模块，同时对树脂进行类似于常规色谱处理的操作(粘合、洗涤、洗脱、再生以及平衡)。沿着树脂流动的逆流方向将用于这些操作的缓冲剂泵送到所述模块中，并且将来自稍后阶段的渗透物溶液反向循环到先前阶段中。这沿着树脂流动的逆流方向在所述切向流动过滤器的渗透物溶液中产生浓度梯度，从而节约缓冲剂容积并且提高处理效率。
文档编号B01D15/08GK102421494SQ201080018318
公开日2012年4月18日 申请日期2010年3月14日 优先权日2009年3月14日
发明者O·申卡兹 申请人:卓曼坦公司