一种孔雀石绿免疫亲和柱及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明涉及一种孔雀石绿免疫亲和柱及其制备方法和用途。该免疫亲和纯化柱利用蛋白G偶联到琼脂糖凝胶上载体，然后用抗孔雀石绿的抗体与琼脂糖上的蛋白G偶联。然后再利用交联剂对结合孔雀石绿抗体的蛋白G-琼脂糖凝胶载体进行交联。交联后的载体制备免疫亲和柱。该纯化柱主要用于对于食品中、水产品及其他多种样本中的孔雀石绿的纯化，有利于后期对样本中孔雀石绿的高效液相色谱(HPLC)和荧光检测。
【专利说明】一种孔雀石绿免疫亲和柱及其制备方法和用途
【技术领域】
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[0001]本发明涉及一种孔雀石绿的免疫亲和柱及其制备方法和用途。属于食品安全检测领域。
【背景技术】
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[0002]孔雀石绿(Malachite green,MG,)属于三苯甲烧类化合物,是一种染料类杀菌剂，可用于治疗鱼类或鱼卵的寄生虫、真菌或细菌感染，曾在多个国家和地区的水产养殖疾病防治中得到广泛使用。然而，MG进入鱼体后会引起鱼类的腮和皮肤上皮细胞轻度炎症。其在水生生物体内的主要代谢产物为隐色孔雀石绿(Leucomalachite green, LMG,)。近年来，MG及LMG高毒、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用逐渐暴露，人类长期食用有MG残留的水产品，容易造成亚慢性或慢性中毒。因而，20世纪90年代以来，许多国家都将其列为水产养殖的禁用药物。根据欧盟法案2002/675/EC规定，动物源性食品中MG和LMG残留总量限制为2 μ g/kg ；日本的肯定列表也明确规定在进口水产品中不得检出MG残留。我国在农业行业标将MG列为禁用药物。但因其抗菌效果好、价格便宜，仍有个别养殖户在违规使用。我国水产品和环境中MG及LMG残留超标现象常有发生，如欧盟、日本、香港等国家和地区均曾从我国大陆进口的鳗鱼中检出其残留，这不仅带来了一定的生态环境问题，而且已成为影响我国水产品质量安全和国际市场竞争力的重要因素。因此，对MG及LMG残留的检测与监控尤为重要。
[0003]孔雀石绿的检测方法常用的有色谱法、免疫学方法、拉曼光谱法等。
[0004]免疫学方法包括酶联免疫吸附分析ELISA和胶体金检测方法。主要是利用孔雀石绿的抗体与样品中抗原相互作用。通过显色反应来检测样本中的孔雀石绿。该方法使用方便，检测灵敏度高。但是由于检测样本复杂，基质较多，检测的假阳性几率很高。并且免疫学方法很难区分孔雀石绿和隐性孔雀石绿。
[0005]拉曼散射是一种分子受光子激发而成的非弹性散射现象，其可以用来表征化学物质的分子结构特性，也可以用来鉴定分子中存在的功能基团，实现化学分子的指纹辩识。利用该方法检测孔雀石绿具有无需样品制备、可以无创快速检测。但是拉曼光谱检测需要特殊的设备，目前只有在少数科研报告中出现此方法。尚未大规模实际应用。
[0006]色谱学方法是利用色谱将样品中的孔雀石绿或隐性孔雀石绿进行分离和再分配。然后检测。可以进行定量分析，是目前为止应用最广泛的也最被认可的检测方法。我国于2005年和2006年相继制定了两套MG残留量的检测标准(GB/T19857-2005、GB/T20361-2006)，规定采用液相色谱-串联质谱法和高效液相色谱法测定水产品中MG。
[0007]对于孔雀石绿的色谱学检测来说，样品采集和前处理是目前分析方法的瓶颈，往往是测定误差的主要来源。因此，样品的前处理技术是目前MG和LMG分析研究的难点和热点之一。一般来讲，样品前处理分提取和净化2个步骤，实验大多采用固相萃取柱对样品提取液中的 MG 和 LMG 进行净化【Mitrowska K，等 J Chromatogr A, 2005,1089 (1/2):187]近年来，应用分子印迹聚合物固相萃取(MISE)分离和纯化MG的方法得到广泛的研究。如2010 年，Mart i nez 等【Marti nez BMJ AnalChim Acta, 2010,665 (I):47-54.】报道了采用MISE分离和纯化MG的方法，平均回收率可达98% ;在本发明中，我们制备孔雀石绿免疫亲和柱利用孔雀石绿特异性抗体对待检样本中的孔雀石绿进行分离和净化。操作简单，净化效率较高。
【发明内容】
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[0008]本发明的目的在于提供一种孔雀石绿免疫亲和柱及其制备方法和用途
[0009]为了达到上述目的，在本发明中，利用了蛋白G的功能，蛋白G是一种G型链球菌细胞壁上的蛋白，能特异性的与多种动物抗体的Fe部位相结合。并且具有很高的亲和力。我们克隆了蛋白G的基因序列，并且对其密码子进行了优化、重组后，在大肠杆菌中表达出了与抗体有高亲和力的基因重组蛋白G。将基因重组的蛋白G偶联到载体上后，再将孔雀石绿抗体偶联到蛋白G上，制备出了孔雀石绿-蛋白G-载体，再用交联剂将载体进行交联。交联后的载体装柱后就形成了高亲和力的孔雀石绿免疫亲和柱。该亲和柱操作简便，纯化孔雀石绿效率高。样本经过简单的处理后就可以进行纯化，得到纯度很高的孔雀石绿。用于高效液相色谱检测和荧光仪检测。
[0010]具体操作如下:
[0011]本发明最大的优势就是利用了蛋白G与Ig抗体特异性结合的特点，IgG抗体由两条重链和两条轻链构成，抗体分为Fab区和Fe区，其中，Fab区是抗原结合的区域。
[0012]蛋白G是链球菌细胞壁上的一种特殊的蛋白，与抗体的Fe区域有特异性的结合能力。蛋白G与抗体结合后，抗体的Fab区域游离在外，不影响抗体的抗原结合能力。经过我们基因优化重组后的蛋白G，I个分子的蛋白G可以结合3个分子的IgG抗体，具有很高的抗体亲和力。并且只有抗体能与蛋白G结合，其余蛋白均不能与蛋白G结合，特异性很高。以此蛋白G为基础制备的免疫亲和柱具有特异性好，孔雀石绿结合量大，纯化效率高的特点。
[0013]孔雀石绿免疫亲和柱及其制备方法说明如下:
[0014]1.载体活化
[0015]选择琼脂糖载体，sepharose4B,以环氧氯丙烷活化法进行活化。
[0016]取2%的预溶胀的琼脂糖凝胶sepharose4B,用20倍体积的蒸懼水充分冲洗,洗去残存的乙醇，用漏斗过滤掉水分。
[0017]称取滤去水份后的湿凝胶5克，加入7.5毫升0.8M的NaOH，30%的环氧氯丙烷2毫升，2mg/ml的硼氢化钠NaBH4，5毫升，在25°C下摇床反应8小时。
[0018]反应后，用大量的蒸馏水洗涤，去除凝胶中混杂的环氧氯丙烷。
[0019]2.将蛋白G与活化载体sepharose4B的偶联
[0020]将活化好的琼脂糖凝胶s印harose4B用偶联缓冲液(0.1M的NaHC03，0.8MNaCl,PH8.9)洗涤3次。加入2mg/ml的蛋白G，室温偶联4小时。
[0021 ] 将偶联好的琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次。偶联有蛋白G的琼脂糖载体sepharose命名为蛋白G-sepharose。
[0022]3.抗孔雀石绿抗体与蛋白G-sepharose载体上的蛋白G连接
[0023]蛋白G与抗体具有特异性的亲和力，在一定的反应条件下，将偶联有蛋白G的琼脂糖凝胶与抗体进行连接。将抗体连接于琼脂糖上。由于蛋白G与抗体的结合部位是抗体的Fe区域，抗体的抗原结合区不受影响，充分保证了抗体的抗原结合能力。
[0024]将抗孔雀石绿抗体溶于20mM、PH7.4的PBS中，终浓度2mg/ml。将抗体加入用20MmPH7.4的PBS缓冲液洗涤过的蛋白G-s印harose中。室温结合30分钟。
[0025]结合后的载体用PBS洗涤。连接有抗体的载体命名为抗体-蛋白G-s印harose。
[0026]4.载体交联
[0027]将抗体-蛋白G-s印harose用0.1M PH9.0的硼酸缓冲液洗涤3次。然后加入0.1MPH9.0的硼酸缓冲液，在缓冲液中加入交联剂如庚二亚氨酸二甲酯(DMP)至终浓度20mM。室温交联I小时。
[0028]加入50mM，PH9.0的乙醇胺终止反应。并用50mM的乙醇胺封闭10分钟。
[0029]交联后的抗体-蛋白G-sepharose载体用20mM, PH7.4的PBS洗漆3次。
[0030]5.装柱
[0031]将交联后的抗体-琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，可根据需要制备不同容量的孔雀石绿亲和纯化柱。层析柱的结构如附图1所示:
[0032]与现有技术相比，本发明具有如下优点:
[0033]I)充分的利用了蛋白G与IgG抗体特异性结合的特性，使抗体通过蛋白G偶联到载体上。并且IgG抗体的Fab片段充分的暴露在外，大幅度提高了孔雀石绿的捕捉能力，孔雀石绿的纯化效率也得到有效提高。。
[0034]2)本发明使用了基因改造后的蛋白G，通过对密码子的优化和IgG结合域基因的优化。使蛋白G的抗体结合能力大幅度提闻，进而提闻了孔雀石绿的纯化效率。
[0035]3)使用本发明纯化孔雀石绿操作简便，几步就可以得到纯度较高的孔雀石绿。更方便操作者使用。
[0036]4)使用本发明得到的孔雀石绿纯度很高，后续不用再做别的纯化处理就可以直接用于高效液相色谱检测或者荧光检测。节省了操作者的时间和费用。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1:孔雀石绿免疫亲和柱结构示意图
[0038]A:进样口 ；B:柱体；C:筛板；D:黄曲霉毒素抗体蛋白G-sepharose填料
[0039]E:筛板；F:出样口
[0040]图2:孔雀石绿标准品检测HPLC图谱
[0041]LMG:孔雀石绿峰；LGV:结晶紫峰
[0042]图3:鱼肉中孔雀石绿检测结果
[0043]LMG:孔雀石绿峰；LGV:结晶紫峰
【具体实施方式】
[0044]实施例1:孔雀石绿免疫亲和纯化柱的制备
[0045]本发明制备孔雀石绿免疫亲和纯化柱的一个优选的实施方案如下:
[0046]1.琼脂糖凝胶活化
[0047]取2%的琼脂糖凝胶s印harose2B，用20倍体积的蒸馏水充分冲洗，洗去残存的乙醇。用漏斗过滤掉水分。称取滤去水份后的湿凝胶5克，加入7.5毫升0.8M的NaOH，30%的环氧氯丙烷2毫升，2mg/ml的硼氢化钠NaBH4，5毫升，在25°C下摇床反应8小时。
[0048]反应后，用50毫升蒸馏水洗涤，去除凝胶中混杂的环氧氯丙烷。
[0049]2.蛋白G与活化的琼脂糖凝胶的偶联
[0050]取I克活化后的琼脂糖凝胶，用偶联缓冲液(0.1M的NaHCO3,0.8M NaCl,PH8.9)洗涤3次。加入2mg/ml的蛋白G20ml，室温偶联4小时。
[0051 ] 将偶联好的琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次。偶联有蛋白G的琼脂糖载体sepharose命名为蛋白G-sepharose。
[0052]3.抗孔雀石绿IgG单抗与蛋白G-sepharose结合
[0053]将抗孔雀石绿抗体溶于20mM、PH7.4的PBS中，终浓度2mg/ml，总体积1ml。将蛋白G-s印harose用20Mm PH7.4的PBS缓冲液洗涤三次，每次30ml。将溶解于PBS中的孔雀石绿抗体加入洗漆过的蛋白G-sepharose中。室温结合30分钟。
[0054]结合后的载体用20Mm PH7.4的PBS洗涤三次，每次30ml。连接有抗体的载体命名为抗体_蛋白G-sepharose。
[0055]4.结合IgG的琼脂糖sepharose交联
[0056]将抗体-蛋白G-sepharose用0.1M PH9.0的硼酸缓冲液洗漆3次,每次30ml。
[0057]将湿凝胶固体，加入0.1M PH9.0的硼酸缓冲液20ml，在缓冲液中加入交联剂庚二亚氨酸二甲酯(DMP)至终浓度20mM。室温交联I小时。
[0058]加入100mM，PH9.0的乙醇胺20ml终止反应。并用50mM的乙醇胺20ml封闭10分钟。
[0059]交联后的抗体-蛋白G-sepharose载体用20mM,PH7.4的PBS洗漆3次,每次30ml。
[0060]5.装柱
[0061]将交联后的s印harose用10毫升20mM PBS PH7.4重悬，然后装入空的亲和纯化柱柱体中。
[0062]实施例2:利用孔雀石绿免疫亲和柱回收孔雀石绿标准品
[0063]1.孔雀石绿标准品的配制
[0064]I)取孔雀石绿标准品，用0.0lM PH7.4的PBS缓冲液溶解，并稀释到3ppb。
[0065]2)取稀释好的孔雀石绿标准品10ml，全部上样检测。
[0066]2.将孔雀石绿免疫亲和纯化柱室温平衡30分钟。
[0067]3.取出免疫亲和柱，进样口与注射器针筒连接，注射器接入到气控操作架上。
[0068]4.用去离子水洗涤亲和柱3次，每次10毫升，调节气孔操作架气泵压力，使液体以3滴/秒的流速流出。
[0069]5.将样品加入纯化柱中，调节流量至1-2滴/秒。直至样品全部流出纯化柱。
[0070]6.用蒸馏水洗涤纯化柱3次，每次5毫升。
[0071]7.加入Iml甲醇，收集洗脱产物。
[0072]8.洗脱产物用高效液相色谱HPLC检测。
[0073]9.高效液相色谱检测结果如附图2:
[0074]根据检测图谱，孔雀石绿标准品回收率为75.2%。
[0075]实施例3:利用孔雀石绿免疫亲和柱纯化和检测鱼肉中的孔雀石绿
[0076]1.鱼肉样品处理
[0077]I)鱼肉去除非食用部分，用组织匀浆机均质样品；
[0078]2)称取2.0±0.05g匀浆样品至50ml离心管中；
[0079]3)依次加入0.4ml (0.25g/ml)盐酸轻铵溶液,0.8ml (lmol/L)对甲苯磺酸溶液，
0.8ml乙酸铵缓冲液和18ml乙腈，用涡旋仪或均质器振荡混匀，超声振荡提取2min，1500r/min振荡提取3min ；
[0080]4)室温下4000g离心3min,小心取出5ml上层液到一新离心管,50°C氮气吹干(吹干后立即取出)；
[0081]5)用1ml PBS (0.0lM PH7.4)缓冲液复溶后全部上样。
[0082]2.将孔雀石绿免疫亲和纯化柱室温平衡30分钟。
[0083]3.取出免疫亲和柱，进样口与注射器针筒连接，注射器接入到气控操作架上。
[0084]4.用去离子水洗涤亲和柱3次，每次10毫升，调节气孔操作架气泵压力，使液体以3滴/秒的流速流出。
[0085]5.将样品加入纯化柱中，调节流量至1-2滴/秒。直至样品全部流出纯化柱。
[0086]6.用蒸馏水洗涤纯化柱3次，每次5毫升。
[0087]7.加入Iml甲醇，收集洗脱产物。
[0088]8.洗脱产物用高效液相色谱HPLC检测。
[0089]9.高效液相色谱检测结果见表1，HPLC图谱见附图3:
[0090]表1:鱼肉样品孔雀石绿残留检测结果
[0091]
保留时间类型峰面积含量/峰面积含量组 名称 [min]_[LU*s]_[ng/ul]_
12.341.VV 1.31279 7.93E-01 2,0811
13.356 VB 3.24017 3.16E-01 2.05037
总量:_4.13147_
[0092]根据HPLC图谱可以看出，经过孔雀石绿免疫亲和柱纯化后，HPLC检测得到这份鱼肉样品中含有隐性孔雀石绿和结晶紫两个组份。总的孔雀石绿含量为4.13147ng/ul。
【权利要求】
1.一种孔雀石绿的免疫亲和柱，其特征在于包含有载体、蛋白G和抗孔雀石绿抗体。
2.根据权利要求1中所述的免疫亲和柱，其特征在于蛋白G通过化学键偶联在载体上，孔雀石绿抗体与蛋白G结合后用交联剂交联。
3.根据权利要求1中所述的免疫亲和柱，其特征在于蛋白G是基因重组表达的蛋白G。
4.根据权利要求2中所述的免疫亲和柱，其特征在于所述的蛋白G包括按照GenBankCAA27638.1序列表达的蛋白G,以及进过序列优化后表达的蛋白G。
5.根据权利要求3中所述的免疫亲和柱，其特征在于所述的序列优化的蛋白G，包括针对大肠杆菌表达进行的蛋白G密码子进行优化、对蛋白G进行抗体结合区域进行序列改变以增加亲和力以及增加蛋白G基因序列中抗体结合区域数量以提高抗体亲和能力。
6.根据权利要求1中所述的免疫亲和柱，其特征在于所述的载体是琼脂糖凝胶。
7.根据权利要求6中所述的免疫亲和柱，其特征在于所述的琼脂糖凝胶包含但不限于溴化氰活化的琼脂糖凝胶、交联的琼脂糖凝胶、聚丙烯酸琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶以及纤维素。
8.根据权利要求6中所述的免疫亲和柱，其特征在于所述的抗孔雀石绿抗体包括单克隆IgG抗体和多克隆抗体。
9.一种纯化孔雀石绿的免疫亲和柱制备方法，其特征在于 1)琼脂糖sepharose4B,加入0.8M的NaOH, 30 %的环氧氯丙烧,2mg/ml的硼氢化钠NaBH4,,在25°C下摇床反应8小时进行活化。或者购买溴化氰活化的sepharose4B。 2)每克活化的sepharose4B 加入 30_200nmol 的蛋白 G,在 0.1M NaHC03，0.5M NaClPH8.8的缓冲液中，室温偶联2小时。或者4°C偶联过夜。 3)偶联产物用IMTris.HCl PH8.0室温反应2小时。 4)偶连好的s印harose-蛋白G，用20mMPH7.4的PBS洗涤。 5)将孔雀石绿抗体溶解在同样的20mMPH7.4的PBS中，每克蛋白G-sepharose加入200nmol-l.2umol抗体。室温反应30分钟。 6)将孔雀石绿抗体-蛋白G-sepharose载体用20mMPBS PH7.4洗涤，然后加入终浓度0.2M的三乙醇胺和20mM的二甲基庚二酸酯(DMP)，PH8.3.室温反应I小时。 7)用20mMPH7.4的乙醇胺终止反应，用含有0.01%硫柳汞的1mMPBS PH7.4洗涤孔雀石绿抗体-蛋白G-sepharose载体。装柱,放于4°C保存。
10.根据权利要求1所述的免疫亲和柱检测孔雀石绿的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于:包含但不限于粮食、水产、食品中孔雀石绿的分离纯化。
【文档编号】B01J20/281GK104174185SQ201310188359
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月21日 优先权日:2013年5月21日
【发明者】柳家鹏, 张彦明, 魏光, 陆成慧 申请人:北京美正生物科技有限公司