一种以酿酒酵母孢子作为新型吸附剂的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种酿酒酵母孢子的制备方法及应用，其中制备方法包括，酿酒酵母单菌落的培养以及酿酒酵母孢子的制备。本发明所制备的酿酒酵母孢子可以用来吸收金属离子或者脂肪类物质，并且表现出较强的吸附能力，有广泛的应用前景。本发明直接通过培养△dit1菌株获得大量的酵母细胞，再加以破壁纯化得到目的产品，就可以做相应的应用，而无需获得价格昂贵的壳聚糖，此方法易于操作，绿色环保。
【专利说明】一种以酿酒酵母孢子作为新型吸附剂的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物资源和环境生物【技术领域】，具体地说是涉及一种以酿酒酵母孢子为原料的新型吸附剂的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]壳聚糖是由几丁质经过脱乙酰反应得到的，其化学名称为聚葡萄糖胺(1-4) -2-氨基-β -D-葡萄糖，其最显著的一个特性是其吸附能力，其分子中的氨基和与之相邻的羟基与许多金属离子(如Hg2+、Ni2+、Cu2+、Pb2+、Ca2+、Ag+等)均能形成稳定的螯合物，因此可用于治理重金属废水、净化自来水及在湿法冶金中分离金属离子等。此外，壳聚糖能通过络合及离子交换作用，对染料、蛋白质、氨基、核酸、酶、卤酸素等进行吸附，用于染料废水、印染废水、食品工业废水的处理，从而净化环境，保护人类健康。目前已有利用壳聚糖来吸附污水中的一些金属离子(如Cu2+、Zn2+、Hg2+等)的报道，从而减轻水污染。壳聚糖除了在环保方面的应用外，在其他方面也有很大的用途，比如控制胆固醇的合成，抑制细菌活性，控制和预防高血压以及用作保健品、食品添加剂等领域。
[0003]目前，国内工业生产壳聚糖的方法主要是以虾、蟹壳为原料，利用酸脱钙、碱脱蛋白、高锰酸钾脱色等步骤制得产品，但是由于原料虾壳或蟹壳不易收集且原料的质量不能保证稳定，时间长还存在腐败的可能性，强酸或强碱处理会造成环境的污染。而且随着人们产品需求量的加大及环保意识的加强，急需挖掘出新的壳聚糖生产方法。
【发明内容】
[0004]本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
[0005]鉴于上述和/或现 有酿酒酵母孢子的制备方法及应用中存在的问题，提出了本发明。
[0006]因此，本发明的目的是提供一种酿酒酵母孢子的制备方法，以达到制备特定用途的酿酒酵母孢子的目的。
[0007]为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案:一种酿酒酵母孢子的制备方法，包括，酿酒酵母单菌落的培养，采用基因同源重组的方法敲除负责编码酿酒酵母SKl孢子壁最外层二酪氨酸层DITl基因，将得到的酿酒酵母缺陷菌株在YPAD固体培养基平板上划线，28°C?32°C培养长出酿酒酵母单菌落；酿酒酵母孢子的制备，挑取酿酒酵母单菌落到YPAD固体培养基中培养22h?26h，然后将菌液转接到YPAce培养基中，培养后收集细胞，再转到浓度为1%?3%的醋酸钾溶液中培养，使得醋酸钾溶液中细胞的浓度为2 X IO7/ml?4 X 10Vml，而后离心，将离心后的酿酒酵母菌体用PBS缓冲液洗涤，在36°C?38°C下用一定量的Iyticase处理0.5h?1.5h后,进行超声波破碎,得到游离状态的酿酒酵母孢子。[0008]作为本发明所述酿酒酵母孢子的制备方法的一种优选方案，其中:还包括，对酿酒酵母孢子进行纯化和冷冻干燥处理。
[0009]作为本发明所述酿酒酵母孢子的制备方法的一种优选方案，其中:所述对酿酒酵母孢子进行纯化，包括，配制Percoll溶液，将处理过的细胞用0.5%TritonX-100溶液洗涤，以除去其中的裂解酶等杂质，然后将细胞悬浮在0.5%TritonX-100溶液中，配制不同梯度50%?80%不同浓度梯度的Percoll溶液；酿酒酵母孢子的纯化，将所述Percoll溶液按照从高浓度到低浓度依次加入到离心管中，最后加酿酒酵母细胞悬浮液，离心，将上层液体除去，得到纯化的酿酒酵母孢子。
[0010]作为本发明所述酿酒酵母孢子的制备方法的一种优选方案，其中:所述酿酒酵母单菌落的培养，包括，引物设计，依据酿酒酵母DITl基因序列设计引物如下:
[0011]上游引物Pl
[0012]MTTTGTTMTATCCTMTTCGGTAMGCTTTGTCGAGACATTMCAAMCGGATCCCCGGGTTMTTM
[0013]下游引物P2
[0014]TGTTTMGTAAMGMCA·AAMGGTAGACCMTGTAGCGCTCTTACTTTAGMTTCGAGCTCGTTTAMC ；
[0015]PCR扩增，利用上游引物Pl和下游引物P2对质粒pFA6a_His3MX6进行PCR扩增，获得含酿酒酵母DITl基因上下游序列的敲除片段；
[0016]DITl基因的敲除，通过醋酸锂/PEG的转化方法将PCR扩增得到的his片段分别导入到酿酒酵母SKl的单倍体细胞4B和16D中，并进行筛选；
[0017]缺陷性菌株的筛选，将DITl基因的敲除后得到的转化菌株涂布到SD-His缺陷性平板上，待长出菌落后，挑取一定数目的菌落提取基因组，并进行PCR验证，以与野生型菌株的基因组进行对比，若验证成功，再将单倍体在SD-Leu-Arg平板上融合，得到缺陷性的二倍体菌株；
[0018]验证引物如下:
[0019]上游引物:CATAAATTGTGCTCCTCCGC
[0020]下游引物:CATTGCAGTGTCTCGAAACC。
[0021]作为本发明所述酿酒酵母孢子的制备方法的一种优选方案，其中:所述酿酒酵母单菌落的培养，YPAD固体培养基的配制为酵母提取物10g，蛋白胨20g，腺嘌呤30mg，琼脂20g,定容于900mL蒸懼水中，121°C灭菌15min后,补加IOOmL单独灭菌的20%葡萄糖。。
[0022]作为本发明所述酿酒酵母孢子的制备方法的一种优选方案，其中:所述酿酒酵母孢子的制备，YPAce培养基的配制为酵母提取物IOg,蛋白胨20g,腺嘌呤30mg,定容于900mL蒸馏水中，121°C灭菌15min后，补加IOOmL单独灭菌的20%醋酸钾。
[0023]本发明的另一目的是提供一种金属离子吸附剂，该吸附剂采用本发明中制备的酿酒酵母孢子。
[0024]为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案:一种酿酒酵母孢子作为金属离子吸附剂的应用。
[0025]作为本发明所述酿酒酵母孢子作为金属离子吸附剂的应用，其中:包括，将所述酿酒酵母孢子进行纯化和冷冻干燥处理后得到酿酒酵母孢子粉末；将所述酿酒酵母孢子粉末添加至含有金属离子的溶液中。
[0026]本发明的再一个目的是提供一种脂肪类物质吸附剂，该吸附剂采用本发明中制备的酿酒酵母孢子。
[0027]为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案:一种酿酒酵母孢子作为脂肪类物质吸附剂的应用。
[0028]作为本发明所述酿酒酵母孢子作为脂肪类物质的应用，其中:包括，将所述酿酒酵母孢子进行纯化和冷冻干燥处理后得到酿酒酵母孢子粉末；将所述酿酒酵母孢子粉末添加至脂肪类物质中。
[0029]本发明提出了一种酿酒酵母孢子的制备方法及应用，所制备的酿酒酵母孢子可以用来吸收金属离子或者脂肪类物质，并且表现出较强的吸附能力，有广泛的应用前景。本发明直接通过培养Λ ditl菌株获得大量的酵母细胞，再加以破壁纯化得到目的产品，就可以做相应的应用，而无需获得价格昂贵的壳聚糖，此方法易于操作，绿色环保。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1是去除孢子壁二酪氨酸层后的酿酒酵母孢子吸附金属离子和脂肪类物质原理示意图；
[0031]图2是根据本发明第一实施方式利用所述酿酒酵母孢子吸收Cu2+的效果示意图；
[0032]图3是根据本发明第二实施方式利用所述酿酒酵母孢子吸收牛黄胆酸钠的效果示意图。
【具体实施方式】
[0033]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的【具体实施方式】做详细的说明。
[0034]在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0035]其次，此处所称的“ 一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
[0036]正如本发明中【背景技术】中所指出的，酵母菌泛指能发酵糖类的一大类单细胞真菌，最典型的酵母菌是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。酿酒酵母在良好的营养和生长条件下，生长迅速，以出芽繁殖的方式进行生殖。但以醋酸盐为唯一或主要碳源，并辅以缺乏氮源等特定条件下(如只有乙酸钾存在)，酿酒酵母就会以孢子生殖的方式进行繁殖，在胞内形成孢子。此时的细胞即称为子囊。子囊经自然或人为破壁后，可释放出其中的子囊孢子。对于子囊孢子来说，其孢子壁由四层组成，从内到外依次为:甘露糖，葡聚糖，壳聚糖，二酪氨酸。由于其中的壳聚糖在工业上有很大的用途，所以本发明主要是通过基因操作的手段抑制孢子壁二酪氨酸层的生成，再破解子囊壁，从而可以使孢子壁的壳聚糖层完全暴露出来；这样一来，就可以利用壳聚糖作相应的用途了。本发明采用了对酿酒酵母产孢破碎后进行纯化的方式来作为新型的吸附剂，经我方实验证明，酿酒酵母产孢破碎后，即使不纯化孢子，直接来吸附，也能达到一定的效果。
[0037]本发明制备酿酒酵母孢子包括以下步骤:采用基因同源重组的方法敲除负责编码酿酒酵母SKl孢子壁最外层二酪氨酸层DITl基因，将得到的酿酒酵母缺陷菌株在YPAD固体培养基平板上划线，30°C培养至长出单菌落；其中，酿酒酵母Aditl突变株的构建采用如下方法进行:
[0038]I)引物设计:依据酿酒酵母DITl基因序列(GenBank)设计引物如下:
[0039]上游引物
[0040]MTTTGTTMTATCCTMTTCGGTAMGCTTTGTCGAGACATTMCAAMCGGATCCCCGGGTTMTTM
[0041]下游引物
[0042]TGTTTMGTAAMGMCAAAMGGTAGACCMTGTAGCGCTCTTACTTTAGMTTCGAGCTCGTTTAMC
[0043]2)PCR扩增:利用上游引物Pl和下游引物P2对质粒pFA6a_His3MX6 (来源于中国典型培养物保藏中心，可以购买获得)进行PCR扩增，获得含酿酒酵母DITl基因上下游序列的敲除片段。
[0044]3) DITl基因的敲除:通过醋酸锂/PEG的转化方法将PCR扩增得到的his片段分别导入到酿酒酵母SKl的单倍体细胞4B和16D中，并进行筛选。
[0045]4)缺陷性菌株的筛选:使用SD-His缺陷性平板进行筛选。将3)得到的转化菌株涂布到SD-His缺陷性平板上，待长出菌落后，挑取一定数目的菌落提取基因组，并进行PCR验证，以与野生型菌株的基因组进行对比。若验证成功，再将单倍体在SD-Leu-Arg平板上融合，得到缺陷性的二倍体菌株。
[0046]验证引物如下: [0047]上游引物:CATAAATTGTGCTCCTCCGC
[0048]下游引物:CATTGCAGTGTCTCGAAACC。
[0049]而IL YPAD培养基的配制为酵母提取物10g，蛋白胨20g，腺嘌呤30mg，定容于900mL蒸馏水中(固体培养基需加琼脂20g)，121°C灭菌15min后，补加IOOmL单独灭菌的
20%葡萄糖。
[0050]然后挑取上步骤中得到的单菌落到YPAD液体培养基中，30°C摇床中培养24h。将菌液转接到YPAce培养基中，过夜培养后收集细胞，转到2%的醋酸钾中培养，使醋酸钾中细胞的浓度为3X 107/ml，培养20h后，5000rpm离心IOmin后，菌体用PBS缓冲液洗涤，在37°C下用一定量的Iyticase处理Ih (625U/g细胞)，冰上进行超声波破碎:功率375watt，破ls，停2s，破lOmin，得到游离状态的孢子并对孢子进行纯化和冷冻干燥。
[0051]其中，IL YPACE液体培养基的配制为酵母提取物10g，蛋白胨20g，腺嘌呤30mg，定容于900mL蒸馏水中，121°C灭菌15min后，补加IOOmL单独灭菌的20%醋酸钾。
[0052]在这一实施例中，纯化包括如下步骤:先将处理过的细胞用0.5%Triton X-100溶液洗涤三次，以除去其中的裂解酶等杂质，然后将细胞悬浮在ImL0.5%Triton X-100溶液中。配制不同梯度50%-80%不同浓度梯度的Percoll溶液:
[0053](I) 8mL Percoll, ImL0.5%Triton-X, lmL2.5M 鹿糖;
[0054](2) 7mL Percoll, 2mL0.5%Triton-X, lmL2.5M 鹿糖；
[0055](3) 6mL percoll, 3mL0.5%Triton-X, lmL2.5M 鹿糖；
[0056](4) 5mL Percoll, 4mL0.5%Triton-X, lmL2.5M 鹿糖。
[0057]将上述Percoll溶液ImL按照从高浓度到低浓度依次加入到IOmL的离心管，最后加细胞悬浮液，15，OOOg, 4°C离心Ih后，梯度溶液将会分层，纯净的孢子将会位于离心管的底部，将上层液体除去，纯化后的孢子在冷冻干燥机中冷冻干燥。
[0058]第一实施方式如图2所示:酿酒酵母孢子对Cu2+的吸收。
[0059]Δ ditl菌株产生酿酒酵母孢子后，按照前述方法纯化并冷冻干燥后，称取一定重量的孢子粉末加入离心管中。配制lmmol/L的CuSO4.5H20 (Cu2+浓度为64mg/L)，向离心管中加入ImL的CuSO4.5Η20溶液使孢子处于悬浮状态，放在30°C摇床中反应5h后，15，OOOrpm离心lOmin，取上清液用原子吸收光谱测定其中Cu2+含量并计算被吸收的Cu2+含量。
[0060]
【权利要求】
1.一种酿酒酵母孢子的制备方法，其特征在于:包括， 酿酒酵母单菌落的培养，采用基因同源重组的方法敲除负责编码酿酒酵母SKl孢子壁最外层二酪氨酸层DITl基因，将得到的酿酒酵母缺陷菌株在YPAD固体培养基平板上划线，28°C?32°C培养长出酿酒酵母单菌落； 酿酒酵母孢子的制备，挑取酿酒酵母单菌落到YPAD固体培养基中培养22h?26h，然后将菌液转接到YPAce培养基中，培养后收集细胞，再转到浓度为1%?3%的醋酸钾溶液中培养，使得醋酸钾溶液中细胞的浓度为2X107/ml?4X107/ml，而后离心，将离心后的酿酒酵母菌体用PBS缓冲液洗涤，在36°C?38°C下用一定量的Iyticase处理0.5h?1.5h后，进行超声波破碎，得到游离状态的酿酒酵母孢子。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母孢子的制备方法，其特征在于:还包括，对酿酒酵母孢子进行纯化和冷冻干燥处理。
3.根据权利要求2所述的酿酒酵母孢子的制备方法，其特征在于:所述对酿酒酵母孢子进行纯化，包括， 配制Percoll溶液，将处理过的细胞用0.5%Triton X-100溶液洗涤，以除去其中的裂解酶等杂质，然后 将细胞悬浮在0.5%Triton X-100溶液中，配制不同梯度50%?80%不同浓度梯度的Percoll溶液； 酿酒酵母孢子的纯化，将所述Percoll溶液按照从高浓度到低浓度依次加入到离心管中，最后加酿酒酵母细胞悬浮液，离心，将上层液体除去，得到纯化的酿酒酵母孢子。
4.根据权利要求1所述的酿酒酵母孢子的制备方法，其特征在于:所述酿酒酵母单菌落的培养，包括， 引物设计，依据酿酒酵母DITl基因序列设计引物如下: 上游引物Pl
AATTTGTTAATATCCTAATTCGGTAAAGCTTTGTCGAGACATTAACAAAACGGATCCCCGGGTTAATTAA
下游引物P2
TGTTTAAGTAAAAGAACAAAAAGGTAGACCAATGTAGCGCTCTTACTTTAGAATTCGAGCTCGTTTAAAC ；PCR扩增，利用上游引物Pl和下游引物P2对质粒pFA6a-His3MX6进行PCR扩增，获得含酿酒酵母DITl基因上下游序列的敲除片段； DITl基因的敲除，通过醋酸锂/PEG的转化方法将PCR扩增得到的his片段分别导入到酿酒酵母SKl的单倍体细胞4B和16D中，并进行筛选； 缺陷性菌株的筛选，将DITl基因的敲除后得到的转化菌株涂布到SD-His缺陷性平板上，待长出菌落后，挑取一定数目的菌落提取基因组，并进行PCR验证，以与野生型菌株的基因组进行对比，若验证成功，再将单倍体在SD-Leu-Arg平板上融合，得到缺陷性的二倍体菌株； 验证引物如下: 上游引物:CATAAATTGTGCTCCTCCGC 下游引物:CATTGCAGTGTCTCGAAACC。
5.根据权利要求1所述的酿酒酵母孢子的制备方法，其特征在于:所述酿酒酵母单菌落的培养，YPAD固体培养基的配制为酵母提取物10g，蛋白胨20g，腺嘌呤30mg，琼脂20g，定容于900mL蒸懼水中，121°C灭菌15min后,补加IOOmL单独灭菌的20%葡萄糖。
6.根据权利要求1所述的酿酒酵母孢子的制备方法，其特征在于:所述酿酒酵母孢子的制备，YPAce培养基的配制为酵母提取物IOg,蛋白胨20g,腺嘌呤30mg,定容于900mL蒸馏水中，121°C灭菌15min后，补加IOOmL单独灭菌的20%醋酸钾。
7.—种如权利要求1?6所述的酿酒酵母孢子作为金属离子吸附剂的应用。
8.根据权利要求7所述的酿酒酵母孢子作为金属离子吸附剂的应用，其特征在于: 将所述酿酒酵母孢子进行纯化和冷冻干燥处理后得到酿酒酵母孢子粉末； 将所述酿酒酵母孢子粉末添加至含有金属离子的溶液中。
9.一种如权利要求1?6所述的酿酒酵母孢子作为脂肪类物质吸附剂的应用。
10.根据权利要求9所述的酿酒酵母孢子作为脂肪类物质吸附剂的应用，其特征在于: 将所述酿酒酵母孢子进行纯化和冷冻干燥处理后得到酿酒酵母孢子粉末； 将所述酿酒酵母孢子粉末 添加至脂肪类物质中。
【文档编号】B01J20/30GK103436481SQ201310420997
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月16日 优先权日:2013年9月16日
【发明者】高晓冬, 中西秀树, 张海妮, 李子杰 申请人:江南大学