灯盏细辛中咖啡酸酯的提取工艺的制作方法

灯盏细辛中咖啡酸酯的提取工艺的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种从灯盏细辛中提取精制可用于注射剂的咖啡酸酯的方法，经过将灯盏细辛用水或者乙醇煎煮、浓缩、酸沉、过滤，滤液过聚酰胺柱，梯度洗脱，得到的咖啡酸酯的纯度可达到注射用咖啡酸酯的要求。
【专利说明】灯盏细辛中咖啡酸酯的提取工艺

【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药领域的药用制剂，具体是一种植物药材灯盏细辛中含有的有效成 分咖啡酸酯的提取工艺，尤其是适合于注射液剂型的咖啡酸酯的提取纯化工艺。

【背景技术】
[0002] 缺血性心脑血管疾病如中风、冠心病是人类死亡的主要原因，急性发作致死率极 高，存活者多会不同程度留下偏瘫、失语、口眼歪斜、视力模糊或者频发心绞痛、心律失常， 降低生活质量，给病人及家属带来沉重的身心和经济负担。据统计，我国越有4000万患者， 随着人口老龄化发展，发病人群还在快速增长，每年新发病人数高达450万。开发此类预防 治疗药物是世界新药研宄的热点。心脑缺血后影响能量代谢，继发乳酸堆积、钙超载、自由 基损伤等多种变化。多靶点逆转或改善这些变化，提高综合治疗效是药物治疗的重要目标。 病毒性肝炎也是一种严重危害人类健康的传染性疾病，其流行范围之光、发病率之高、传染 性之强是其它疾病所不能比拟的，目前尚缺乏真正有效的治疗药物。植物药化学组成具多 样性特征，结构各异的有效成分通过作用于不同靶点或病理环节联合奏效，常发挥明显的 协同效应。从历史悠久的中草药或民族药开发新药有其独特优势。本发明的目的即是通过 对云南苗族植物药灯盘细辛（灯盘花）（Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand. -Mazz)的研 宄为上述疾病的预防和治疗提供一种成分明确、质量可控、安全有效的药用组合物及其制 剂。
[0003] 灯盏花为菊科飞蓬属草本植物，主要分布于云南省，民间广泛用于治疗中风后遗 症、风湿病、胸痹等症，取得了较好效果。早在1976年云南学者即开始对灯盏花的化学成 分进行研宄，分离鉴定了灯盏花乙素（即野黄芩苷，scutellarin)、焦袂康酸、飞蓬甙等成 分，其中灯盏花乙素经药理筛选被证明是治疗中风的有效成分，在此基础上研制成功以灯 盏花素为原料（黄酮类有效部位，主成分为野黄芩甙）约占90%的药品"灯盏花素片"，后 来一些厂家又开发了"灯盏花素注射液"和"注射用灯盏花素"。与灯盏花素相关的专利有 CN1053609、CN10595934、CN1133180、CN1252277、CN1228959、CN1191730、CN1187356 等，涉 灯盏花素原料提取及口服、注射制剂的制备工艺。但，对灯盏花化学成分中的咖啡酸酯成分 的认识还远未充分。
[0004] 咖啡酸酯类成分尤其是灯盏细辛中含有的咖啡酰奎宁酸类成分有多种生物活性： 抗氧化性，抗炎活性，抗微生物作用，肝细胞保护作用，抑制血小板聚集作用[1]，一些发明 专利也涉及咖啡酸酯的医药用途：例如对糖尿病有治疗保健作用CN103239435B;可治疗贾 第虫病CN102626404B，对抗流感特别对抗禽流感病毒（H5N1)的作用CN102274208B，对呼吸 道合胞病毒及乙肝病毒中的应用CN101284799B，抗炎、抗细菌、抗耐药菌株CN102100720B。 治疗支原体感染疾病药物CN101829077B，5-咖啡酰奎宁酸具有抑制新生血管生成功能 的作用，能够通过抑制肿瘤新生血管的生成而抑制肿瘤的生长和转移，从而达到抗肿瘤 目的CN102000051B，二咖啡酰奎宁酸类成分是新的一类具有较好脑神经保护的有效成 分，具有促进体外大脑皮层神经细胞存活和抗氧化作用，且具有一定透过血脑屏障能力 CN101642450B，二咖啡酰奎尼酸衍生物在治疗冠状病毒CN1200705C，用于治疗或预防肾炎、 肾衰竭、脉管炎、静脉栓塞、心脑血管、肺心病等疑难病症CN1064234C。
[0005] 咖啡酸酯类成分作为菊科飞蓬属植物灯盏花的一大类成分，含量较高，总咖啡酸 酯的含量在大多批草中高于灯盏花乙素含量。灯盏花乙素已经单独成药，比如灯盏花素片， 注射用灯盏花素，灯盏花素注射液等。而灯盏细辛中的咖啡酸酯类成分作为活性组分在灯 盏细辛注射液，灯盏细辛滴丸，灯盏细辛胶囊，灯盏细辛软胶囊，灯盏细辛合剂等中都存在。 然而还没有专门的灯盏细辛中的咖啡酸酯独立成药或者成为保健品。由于以上介绍咖啡酸 酯的各种活性，作为一类活性明显，突出的物质，在抗病毒，抗癌，抗炎，抗氧化，调节血脂， 降血糖等方面都能独立成药。
[0006] 目前，我国已有含咖啡酸酯的小容量注射剂在生产，生产厂家很少，主要是受制于 原料及制剂工艺的不完善，经常出现例如制剂不稳定，澄明度差、不符合注射制剂的相关要 求等一系列的问题，这就需要进一步提纯灯盏细辛提取物中的有效成分。


【发明内容】

[0007] 本发明目的就是寻找一种纯化的咖啡酸酯的工艺，以达到注射用级别。
[0008] 本发明提供了一种灯盏细辛中咖啡酸酯的提取精制方法，该方法包括：
[0009] 取灯盏细辛，加水或醇煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩成清膏；取清膏调 节pH直至溶解，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH1?5,滤过，得滤液和沉淀；
[0010] 取滤液，过聚酰胺柱，用水洗脱，弃去水洗脱液，再用20% -90%浓度的乙醇梯度 洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩成清膏，用水溶解性< 80g/L(20°C)有机溶剂萃 取，收集有机溶剂提取液，回收有机溶剂，得到的清膏为咖啡酸酯。该咖啡酸酯的纯度可达 到注射用咖啡酸酯的要求。
[0011] 上述"水或醇煎煮"中所述的醇为0% -95%浓度的乙醇；优选低浓度的乙醇，该低 浓度的乙醇优选0 % -45 %的乙醇。
[0012] 上述的提取方法，其中以液相法测定5个咖啡酸酯含量相对面积大于60%，紫外 法测定咖啡酸酯的含量大于40%。
[0013] 本发明的目的是最大限度去除与单咖啡酸酯极性相近（指在高效液相图谱上出 峰时间相近的）的杂质同时最大限度保留二咖啡酸酯成分，还去除了杂质类成分焦袂康 酸，使得注射液的有效成分更精纯以及更精准。上述方法经过多次验证可以得到本发明的 预期目的，尤其是采用水煎煮或者低浓度的醇煎煮得到的提取液，经过上述步骤后得到的 产品杂质控制到极低的范围，产品符合注射之际的要求。
[0014] 上述方法优选为：
[0015] 取灯盏细辛，加水或低浓度的乙醇煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至 75°C下相对密度为1. 15-1. 25的清膏；取清膏加水稀释，调节pH7. 5?9,滤过，滤液加硫 酸或盐酸溶液调节PH2?3,滤过，得滤液和沉淀；
[0016] 取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，用至少2倍量的水洗脱，弃去水洗脱液，再用 20% -90%浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇并浓缩成清膏，加氢氧化钠溶液，调节 pH7?10,用水溶解性彡80g/L有机溶剂萃取，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH2?3， 用有机溶剂萃取，收集有机溶剂提取液，回收溶剂，得到的清膏为咖啡酸酯。
[0017] 其中，上述萃取用的水溶解性< 80g/L有机溶剂包括乙酸乙酯、乙醚、氯仿，石油 醚，或者是两种或者两种以上有机溶剂的混合等等，优选乙酸乙酯。
[0018] 在本发明优选实施例中，该咖啡酸酯的提取精制工艺方法为：
[0019] 取灯盏细辛，以灯盏细辛药材800g计，加水或者低浓度的乙醇煎煮至少二次，合 并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1. 15-1. 25 (75°C)的清膏。取清膏加3倍量水 稀释，加5%氢氧化钠溶液调节pH7. 5?8. 5,滤过，滤液加10%硫酸溶液调节pH2?3， 滤过，得滤液和沉淀；取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，用至少2倍量的水洗脱，弃去水洗 脱液，再用20% -90%乙醇洗脱，收集浓度为40%乙醇洗脱时的乙醇洗脱液以及70%乙醇 洗脱的洗脱液，回收乙醇并浓缩至70°C下相对密度为1. 10?1. 20的清膏，加碱溶液，调节 pH7?10,用乙酸乙酯萃取至少1-3次，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH2?3,用乙酸 乙酯萃取2次，收集乙酸乙酯提取液，减压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加水，煮沸，浓缩至 45°C下相对密度为1. 20?1. 30的清膏，即为咖啡酸酯。
[0020] 本文中的"适量"是指本领域普通技术人员所常规知晓的常规量。
[0021] 本文中的"低浓度乙醇"是指浓度为0 % -45 %的乙醇。
[0022] 上述的碱溶液优选氢氧化钠，更优选5 %的氢氧化钠。
[0023] 本发明的提取工艺制得的咖啡酸酯可以直接用于注射用组合物制剂，解决了业 内存在多年的咖啡酸酯纯度不高、达不到注射剂要求、咖啡酸酯在工业化生产的过程中收 率太低的问题，尤其解决了咖啡酸酯的纯度，这是业内一直无法解决的难题，也是困扰灯盏 细辛注射液多年的疑难问题。本发明的发明人通过深入系统地提取分离精制纯化，以及相 对应的用理化试验和指纹图谱鉴定试验，发现其咖啡酸酯中含量更高的二咖啡酸酯是重要 活性成分，具有明显的抗氧化、抑制胆固醇合成、降低血清甘油三酯浓度、抑制15-脂氧酶、 舒张平滑肌、抗血小板聚集、抑制组胺释放等活性，而且对乙肝病毒也有显著抑制作用。但 是这类成分包括多种单、二咖啡酰奎宁酸化合物，其中与单咖啡酸酯极性相近的水溶性成 分实验证明属于杂质，并且长期试验证明与单咖啡酸酯极性相近的物质含量直接影响药 液澄明度。本发明的发明人还精准确定了二咖啡酸酯的组成为3, 4-0-二咖啡酰奎宁酸， 3, 5-0-二咖啡酰奎宁酸，4, 5-0二-咖啡酰奎宁酸，飞蓬酯乙及灯盏细辛酯；以高效液相法 计算相对含量，其中3, 4-0-二咖啡酰奎宁酸为9-20%，3, 5-0-二咖啡酰奎宁酸4-12%， 4, 5-0二-咖啡酰奎宁酸10-25%，飞蓬酯乙10-25 %和灯盏细辛酯10-25%。
[0024] 基于上述要求，本发明 申请人:首次将灯盏细辛注射液这一多成分注射剂的固体物 质化学结构阐明，并将其含量范围做了限定，以高效液相指纹图谱对其中多个成分含量加 以控制，包括二咖啡酸酯类成分（3, 4-0-二咖啡酰奎宁酸，3, 5-0-二咖啡酰奎宁酸，4, 5-0 二-咖啡酰奎宁酸，飞蓬酯乙及灯盏细辛酯）入药的活性成分，更着重对这些物质加以控 制含量。以高效液相法计算相对含量，其中3, 4-0-二咖啡酰奎宁酸为9-20%，3, 5-0-二 咖啡酰奎宁酸4-12%，4, 5-0二-咖啡酰奎宁酸10-25%，飞蓬酯乙10-25%和灯盏细辛酯 10-25% ;用紫外法测定咖啡酸酯大于40%以上。
[0025] 本发明的目的是最大限度去除与单咖啡酸酯极性相近（指在高效液相图谱上出 峰时间相近的）的杂质同时最大限度保留二咖啡酸酯成分，使得注射液的有效成分更精纯 以及更精准。
[0026] 本发明提供的如上所述的工艺得到的咖啡酸酯，在满足二咖啡酸酯的纯度达到 60%或者更多的同时，利用聚酰胺柱梯度洗脱，最大限度地除去了水溶性杂质，除去了极性 大和极性小的有关物质，与同类文献提供的提取精制方法所得到的提纯物质相比，具备上 述优点的同时，还除去了灯盏细辛注射液中影响澄明度的单咖啡酸酯等难以去除的杂质， 这是现有技术所难以企及的高收率+高纯度的技术和高度。
[0027] 在上精制纯化咖啡酸酯的过程中，关键技术在于聚酰胺柱。同类产品中某专利技 术是将提取物过大孔吸附树脂，在以注射液为例的剂型中，大孔吸附树脂残留一直是难以 解决的难题，这也是该项技术的众多拥趸者没能成功得到有关灯盏细辛产品新药批件的原 因之一。本发明经过一次上柱，梯度洗脱，尤其是设定了依次用2-10倍量（优选3-5倍量） 的水、40%乙醇、70%乙醇洗脱，弃去水洗脱液，收集浓度为40%乙醇洗脱时的乙醇洗脱液， 以及70%乙醇洗脱的洗脱液，S卩，当流出的洗脱液是40%乙醇洗脱出来的溶液即为本发明 予以收集保留的有效部位溶液，直至用70%乙醇洗脱，收集40%?70%梯度段的洗脱液， 该洗脱液中含有的咖啡酸酯既去除了其他水溶性大分子杂质以及极性小的杂质，还去除了 有肝毒副作用的焦袂康酸，尤其是在灯盏细辛提取物中去除焦袂康酸，这是本领域技术至 今没有企及的，本发明取得了阐明了五个二咖啡酸酯的结构并且二咖啡酸酯在咖啡酸酯浸 膏中相对含量达到60%以上（液相法），用紫外法测定咖啡酸酯大于40%以上。实践证明 控制好二咖啡酸酯的含量对于制剂的稳定性和澄明度都是十分有效的控制方法。这是令 人惊喜的结果，也是至今为止所有的公开技术以及本领域技术人员公知常识难以达到的效 果，此为本发明的一个重要创新点。
[0028] 在本发明的优选实施例中，提供了该组合物为以下方法制得：
[0029] 取灯盏细辛800g，加水或低浓度乙醇煎煮二次，第一次加水10倍量，煎煮2 小时，第二次加水5倍量，煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为 1. 15-1. 25 (75°C)的清膏。取清膏加3倍量水稀释，加5%氢氧化钠溶液调节pH7. 5?8. 5， 滤过，滤液加10%硫酸溶液调节pH2?3,滤过，得滤液和沉淀；取滤液，通过聚酰胺柱，分 别用4倍量水、4倍量40%乙醇、2倍量70%乙醇洗脱，弃去水洗脱液，收集40%乙醇洗脱 液、70%乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1. 10?1. 20 (70°C)的清膏，加5%氢 氧化钠溶液，调节pH7. 5?8. 5,用乙酸乙酯萃取2次，每次3倍量，取碱水层用10%盐酸 溶液调节PH2?3,用乙酸乙酯萃取2次，每次3倍量，收集乙酸乙酯提取液，减压回收乙酸 乙酯溶液，剩余稠膏加5倍量水，煮沸，浓缩至相对密度为1. 20?1. 30 (45°C)的清膏，与上 述备用的干膏粉，分别加注射用水适量，用5%氢氧化钠调节pH7. 5?8. 5,滤过，滤液即为 咖啡酸酯。
[0030] 本发明的上述工艺，在提纯咖啡酸酯成分时，在梯度洗脱的条件下，第二次用乙酸 乙酯萃取是收集乙酸乙酯层的步骤，即富集二咖啡酸酯，含在乙酸乙酯层溶液里，发明人发 现，第二次用乙酸乙酯萃取，只有萃取2次，得到的咖啡酰奎宁酸最纯，萃取1次，乙酸乙酯 层的杂质没有除净，而萃取3次或者3次以上，乙酸乙酯层竟然杂质又开始返回增多的趋 势，无数次实验证明，在收集萃取液的第二次加乙酸乙酯萃取的过程，优选萃取2次，得到 的有效咖啡酸酯纯度高、杂质少、得率高，创下咖啡酸酯精制史上的三高，这是意想不到的 结果，也是具有非显而易见性，无法被本领域技术人员结合公知常识进行预知和推测，这是 本发明的创新点之一。
[0031] 在本发明又一优选实施例中，该组合物由以下方法制得：
[0032] 取灯盏细辛800g，加水煎煮二次，第一次加水10倍量，煎煮2小时，第二次加水5 倍量，煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1. 15-1. 25 (75°C)的清膏。 取清膏加3倍量水稀释，加5%氢氧化钠溶液调节pH7. 5?8. 5,滤过，滤液加10%硫酸溶 液调节pH2?3,滤过，得滤液和沉淀；其中沉淀部分为含有灯盏乙素的提取物；取滤液，通 过聚酰胺柱，分别用4倍量水、4倍量40%乙醇、2倍量70%乙醇洗脱，弃去水洗脱液，收集 40%乙醇洗脱液、70%乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1. 10?1. 20 (70°C)的清 膏，加5%氢氧化钠溶液，调节pH7. 5?8. 5,用乙酸乙酯萃取2次，每次3倍量，取碱水层 用10%盐酸溶液调节pH2?3,用乙酸乙酯萃取2次，每次3倍量，收集乙酸乙酯提取液，减 压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加5倍量水，煮沸，浓缩至相对密度为1. 20?1. 30 (45°C) 的清膏，即为本发明的咖啡酸酯。
[0033] 以上均为重量百分比或者份数。
[0034] 本发明的创新点之二是，建立了本发明上述工艺得到的咖啡酸酯混合物的指纹图 谱，并完全阐明了二咖啡酸酯的所有成分，采用高效液相色谱进行用指纹图谱对咖啡酸酯 提取物成分的质量监控。
[0035] 色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷为填料；采用梯度洗脱，流动相A为甲醇，流动 相B为含0. 5%的甲酸水溶液，C为乙腈溶液；
[0036] 梯度洗脱程序如下：
[0037] 0分钟时，5 %流动性A，92 %流动相B，3 %流动相C;
[0038] 15分钟时，15%流动性A，73. 5%流动相B，11. 5%流动相C;
[0039] 45分钟时，15%流动性A，73. 5%流动相B，11. 5%流动相C;
[0040] 55分钟时0 %流动性A，55 %流动相B，45 %流动相C;
[0041] 65分钟时，0%流动性A，15%流动相B，85%流动相C;
[0042] 65. 1分钟时，5 %流动性A，92 %流动相3 %流动相C;
[0043] 80分钟时，5%流动性A，92%流动相B，3%流动相C。
[0044] 流速I.OmL/min;检测波长 335nm;柱温 30°C。
[0045] 经过反复试验，确定了本发明从灯盏细辛中提取纯化后可用于注射的咖啡酸酯的 指纹图谱，在上述色谱条件下，该含有咖啡酸酯的组合物有效成分中主要五种成分（组分） 保留时间如下：
[0046] 3, 4-0-二咖啡酰奎宁酸 26-33min，
[0047] 3, 5-0-二咖啡酰奎宁酸 28-35min，
[0048] 飞蓬酯乙 33-42min，
[0049] 4, 5-0-二咖啡酰奎宁酸 40-50min，
[0050] 灯盏细辛酯43-52min。
[0051] 因此，本发明还提供一种咖啡酸酯的指纹图谱进行检测的方法，在色谱柱填料为 十八烷基硅烷、流速I.OmL/min、检测波长335nm、柱温30°C的色谱条件下，采用梯度洗脱， 流动相A为甲醇，流动相B为含0. 5%的甲酸水溶液，C为乙腈溶液；梯度洗脱步骤为，
[0052] 0分钟时，5 %流动性A，92 %流动相B，3 %流动相C;
[0053] 15分钟时，15%流动性A，73. 5%流动相B，11. 5%流动相C;
[0054] 45分钟时，15%流动性A，73. 5%流动相B，11. 5%流动相C;
[0055] 55分钟时，0 %流动性A, 55 %流动相B，45 %流动相C;
[0056] 65分钟时，0%流动性A，15%流动相B，85%流动相C;
[0057] 65. 1分钟时，5 %流动性A，92 %流动相3 %流动相C;
[0058] 80分钟时，5 %流动性A，92 %流动相B，3 %流动相C;
[0059] 该组合物有效成分中五种成分保留时间为：3, 4-0-二-咖啡酰奎宁酸 30. 0-32. 0min，3, 5-0-二-咖啡酰奎宁酸 32. 0-34.Omin，飞蓬酯乙 37. 5-40. 5min， 4, 5-0-二咖啡酰奎宁酸44. 5-48.Omin，灯盏细辛酯48. 0-51. 5min。
[0060] 该咖啡酸酯由以下步骤制得：
[0061] 取灯盏细辛，加水或醇煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩成清膏；取清膏调 节pH直至溶解（pH7?12)，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH1?5,滤过，得滤液和 沉淀；
[0062] 取滤液，过聚酰胺柱，用水洗脱，弃去水洗脱液，再用20% -90%浓度乙醇梯度洗 脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩成清膏，用水溶解性< 80g/L(20°C)有机溶剂（例 如：正丁醇或乙酸乙酯）萃取，收集有机溶剂提取液，回收有机溶剂，得到的清膏为咖啡酸 酯。
[0063] 在本发明的优选实施例中，上述咖啡酸酯的提取纯化工艺为：
[0064] 取灯盏细辛，加水或醇煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至75°C下相对密 度为1. 15-1. 25的清膏；取清膏加水稀释，调节pH7. 5?9,滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液 调节pH2?3,滤过，得滤液和沉淀；
[0065] 取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，用至少2 (例如2-10)倍量的水洗脱，弃去水洗 脱液，再用20% -90% (例如40%、70% )乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇并浓缩成清膏， 加氢氧化钠溶液，调节PH7?10,用水溶解性彡80g/L(20°C)有机溶剂（例如：正丁醇或 乙酸乙酯）萃取，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH2?3,用有机溶剂（优选乙酸乙酯） 萃取，收集有机溶剂提取液，回收溶剂，得到的清膏为咖啡酸酯（包括二咖啡酰奎宁酸、灯 盏花甲素、飞蓬酯乙和灯盏细辛酯）。
[0066] 优选地，上述咖啡酸酯的提取纯化方法为：
[0067] 取灯盏细辛，加水或醇（0% -95%的乙醇，优选0% -45%的乙醇）煎煮至少二次， 合并煎液，滤过，滤液浓缩至75°C下相对密度为1. 15-1. 25的清膏；取清膏加水稀释，调节 pH7. 5?9,滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH2?3,滤过，得滤液和沉淀；
[0068] 取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，依次用2-10倍量的水、40 %乙醇、70 %乙醇洗 脱，弃去水洗脱液，收集浓度为40%乙醇洗脱时的乙醇洗脱液以及70%乙醇洗脱的洗脱 液，回收乙醇并浓缩至70°C下相对密度为1. 10?1. 20的清膏，加碱溶液，调节pH7?10， 用乙酸乙酯萃取至少1-3次，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH2?3,用乙酸乙酯萃取2 次，收集乙酸乙酯提取液，减压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加水，煮沸，浓缩至45°C下相对 密度为1. 20?1. 30的清膏，即为咖啡酸酯。
[0069] 更优选地，上述方法为：
[0070] 取灯盏细辛800g，加水煎煮二次，第一次加水10倍量，煎煮2小时，第二次加水5 倍量，煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1. 15-1. 25 (75°C)的清膏。 取清膏加3倍量水稀释，加5%氢氧化钠溶液调节pH7. 5?8. 5,滤过，滤液加10%硫酸溶 液调节pH2?3,滤过，得滤液和沉淀；
[0071] 取滤液，通过聚酰胺柱，分别用4倍量水、4倍量40%乙醇、2倍量70%乙醇洗脱， 弃去水洗脱液，收集40%乙醇洗脱液、70 %乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度为 1. 10?1.20 (70°C)的清膏，加5 %氢氧化钠溶液，调节pH7. 5?8. 5,用乙酸乙酯萃取2 次，每次3倍量，取碱水层用10%盐酸溶液调节pH2?3,用乙酸乙酯萃取2次，每次3倍 量，收集乙酸乙酯提取液，减压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加5倍量水，煮沸，浓缩至相对 密度为1. 20?1. 30 (45°C)的清膏，为咖啡酸酯。
[0072] 本发明的咖啡酸酯的提取方法中，为了验证高纯度所采用的高效液相色谱法为： 取咖啡酸酯浸膏适量约〇. 〇3g，置小烧杯中，加5mlN，N-二甲基甲酰胺超声使溶解，滤过， 取续滤液；精密吸取IOul，注入液相色谱仪；
[0073] 在色谱柱为十八烷基硅烷为填料，采用梯度洗脱，流动相A为甲醇，流动相B为含 0. 5%的甲酸水溶液，C为乙腈溶液，梯度洗脱程序如下的色谱条件下，进行洗脱，
[0074] 0分钟时，5 %流动性A，92 %流动相B，3 %流动相C;
[0075] 15分钟时，15%流动性A，73. 5%流动相B，11. 5%流动相C;
[0076] 45分钟时，15%流动性A，73. 5%流动相B，11. 5%流动相C;
[0077] 55分钟时0 %流动性A，55 %流动相B，45 %流动相C;
[0078] 65分钟时，0%流动性A，15%流动相B，85%流动相C;
[0079] 65. 1分钟时，5 %流动性A，92 %流动相3 %流动相C;
[0080] 80分钟时，5 %流动性A，92 %流动相B，3 %流动相C;
[0081] 然后在流速I.OmL/min;检测波长335nm;柱温30°C的检测条件下，得到该咖啡酸 酯的指纹图谱，该指纹图谱上，上述组合物有效成分的保留时间如下，
[0082] 3, 4-0-二咖啡酰奎宁酸 26-33min，
[0083] 3, 5-0-二咖啡酰奎宁酸 28-35min，
[0084] 飞蓬酯乙 33-42min，
[0085] 4, 5-0-二咖啡酰奎宁酸 40-50min，
[0086] 灯盏细辛酯43-52min。
[0087] 本发明的咖啡酸酯的提取方法中，为了验证高纯度所采用的紫外检测法为：取 搅拌均匀后的咖啡酸酯3?7mg，精密称定，加60%乙醇2ml，振摇使溶解，转移至250ml容 量瓶中，加水至刻度，摇匀，在305nm波长处测定吸收度，按吸收系数560计算，即得；

【权利要求】
1. 一种灯盏细辛中咖啡酸酯的提取纯化方法，包括： 取灯盏细辛，加水或乙醇煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩成清膏；取清膏调节 pH直至溶解，滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH 1?5,滤过，得滤液和沉淀； 取滤液，过聚酰胺柱，用水洗脱，弃去水洗脱液，再用20% -90%浓度乙醇梯度洗脱，收 集乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩成清膏，得到的清膏为咖啡酸酯。进一步纯化：将清膏用碱 溶解后，用水溶解性< 80g/L有机溶剂萃取，去掉有机溶剂萃取部分，调节水溶液pH值至酸 性（pH 1-5)，用水溶解性<80g/L的有机溶剂萃取，收集有机溶剂提取液，回收有机溶剂 得到浸膏，即得咖啡酸酯。
2. 如权利要求1所述的方法，其中，该方法为： 取灯盏细辛，加水或〇% -95%的乙醇煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至75°C 下相对密度为1. 15-1. 25的清膏；取清膏加水稀释，调节pH 7. 5?9,滤过，滤液加硫酸或 盐酸溶液调节pH 2?3,滤过，得滤液和沉淀； 取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，用至少2倍量的水洗脱，弃去水洗脱液，再用 20% -90%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇并浓缩成清膏，加氢氧化钠溶液，调节pH 7? 10,用水溶解性< 80g/L有机溶剂萃取，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH 2?3,用有机 溶剂萃取，收集有机溶剂提取液，回收溶剂，得到的清膏为咖啡酸酯。
3. 如权利要求2所述的方法，其中，该方法为： 取灯盏细辛以800g计，加水或0% -45%煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩 至相对密度为1. 15-1. 25 (75°C )的清膏。取清膏加3倍量水稀释，加5%氢氧化钠溶液调 节pH 7. 5?8. 5,滤过，滤液加10%硫酸溶液调节pH 2?3,滤过，得滤液和沉淀；取滤液， 通过聚酰胺柱，梯度洗脱，用至少2倍量的水洗脱，弃去水洗脱液，再用20 % -90 %乙醇洗 脱，收集浓度为40%乙醇洗脱时的乙醇洗脱液以及70%乙醇洗脱的洗脱液，回收乙醇并浓 缩至70°C下相对密度为1. 10?1. 20的清膏，加碱溶液，调节pH 7?10,用乙酸乙酯萃取 至少1-3次，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH 2?3,用乙酸乙酯萃取2次，收集乙酸乙 酯提取液，减压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加水，煮沸，浓缩至45°C下相对密度为1. 20? 1.30的清膏，即为咖啡酸酯。
4. 如权利要求1-3任一项所述的方法，该方法还包括，将得到的咖啡酸酯进行指纹图 谱检测并计算含量，同时通过紫外法检测总咖啡酸酯含量；以液相法测定5个咖啡酸酯含 量相对面积大于60% ;紫外法测定咖啡酸酯的含量大于40%。
5. 如权利要求4所述的方法，该方法中所述的高效液相色谱法为：取咖啡酸酯浸膏适 量约〇.〇3g，置小烧杯中，加5ml N，N-二甲基甲酰胺超声使溶解，滤过，取续滤液；精密吸取 l〇ul，注入液相色谱仪； 在色谱柱为十八烷基硅烷为填料，采用梯度洗脱，流动相A为甲醇，流动相B为含0. 5% 的甲酸水溶液，C为乙腈溶液，梯度洗脱程序如下的色谱条件下，进行洗脱， 0分钟时，5%流动性A，92%流动相B，3%流动相C ; 15分钟时，15%流动性A，73. 5%流动相B，11. 5%流动相C ; 45分钟时，15%流动性A，73. 5%流动相B，11. 5%流动相C ; 55分钟时0%流动性A，55%流动相B，45%流动相C ; 65分钟时，0%流动性A，15%流动相B，85%流动相C ; 65. 1分钟时，5%流动性A, 92%流动相3%流动相C ; 80分钟时，5%流动性A，92%流动相B，3%流动相C ; 在流速1. OmL/min ;检测波长335nm ;柱温30°C的检测条件下，得到该咖啡酸酯的指纹 图谱，该指纹图谱上，上述组合物有效成分的保留时间如下， 3, 4-0-二咖啡酰奎宁酸26-33min， 3, 5-0-二咖啡酰奎宁酸28-35min， 飞蓬醋乙33_42min， 4, 5-0-二咖啡酰奎宁酸40-50min， 灯盏细辛酯43-52min。
6. 权利要求4所述的方法，其中，该方法为： 取灯盏细辛，加水煎煮至少二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1. 15-1. 25 的清膏；取清膏加水稀释，调节pH 7. 5?9,滤过，滤液加硫酸或盐酸溶液调节pH 2?3,滤 过，得滤液和沉淀； 取滤液，通过聚酰胺柱，梯度洗脱，依次用2-10倍量的水、40 %乙醇、70%乙醇洗脱，弃 去水洗脱液，收集浓度为40%乙醇洗脱时的乙醇洗脱液以及70%乙醇洗脱的洗脱液，回收 乙醇并浓缩至70°C下相对密度为1. 10?1.20的清膏，加碱溶液，调节pH 7?10,用乙酸乙 酯萃取至少1-3次，取碱水层用硫酸或盐酸溶液调节pH 2?3,用乙酸乙酯萃取2次，收集 乙酸乙酯提取液，减压回收乙酸乙酯溶液，剩余稠膏加水，煮沸，浓缩至相对密度为1. 20? 1.30的清膏，即为咖啡酸酯。
7. 如权利要求6所述的制备方法，其中，该方法为： 取灯盏细辛800g，加水煎煮二次，第一次加水10倍量，煎煮2小时，第二次加水5倍量， 煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1. 15-1. 25的清膏；取清膏加3倍 量水稀释，加5%氢氧化钠溶液调节pH 7. 5?8. 5,滤过，滤液加10%硫酸溶液调节pH2? 3,滤过，得滤液和沉淀； 取滤液，过聚酰胺柱，分别用4倍量水、4倍量40%乙醇、2倍量70%乙醇洗脱，弃去水 洗脱液，收集40%乙醇洗脱液、70%乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度1. 10?1. 20 的清膏，加5%氢氧化钠溶液，调节pH 7. 5?8. 5,用乙酸乙酯萃取2次，每次3倍量，取碱 水层用10%盐酸溶液调节pH 2?3,用乙酸乙酯萃取2次，每次3倍量，收集乙酸乙酯提取 液，减压回收乙酸乙酯溶液，稠膏加5倍量水，煮沸，浓缩至相对密度1.20?1.30的清膏， 即为咖啡酸酯。
【文档编号】B01D15/42GK104473919SQ201410764764
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月11日 优先权日:2014年4月21日
【发明者】林炎海, 林艳和 申请人:林艳和