一种粘多糖功能化亲水固相微萃取整体柱的制作方法

本发明属于整体柱制备领域，具体涉及一种粘多糖功能化亲水固相微萃取整体柱。

背景技术：

整体柱是一种采用有机、无机或有机-无机杂化方法进行原位聚合制备的新型色谱固定相。由于其具有渗透性优异、空间利用率高、制备方法简便、背压低、传质速度快等优点，在固相微萃取领域得到广泛应用。近年来，通过特殊功能化提高整体柱的特定性能，成为整体柱制备领域的一个重要研究方向。生物大分子（如蛋白质、多糖、纤维素等）由于具有独特的生物和化学性质，因此被广泛应用于整体柱的功能化。迄今为止，生物大分子功能化整体柱的制备主要是通过生物大分子在基质整体柱表面涂覆或化学键合等方式实现。例如，Lu等人（Junyu Lu, et al. J. Sep. Sci., 2011, 34, 2329-2336）采用巯基丙基三甲氧基硅烷作为功能单体制备硅胶整体柱，并在其表面固定金纳米颗粒；通过金纳米颗粒和蛋白质上氨基的相互作用，实现了牛血清白蛋白（BSA）在硅胶整体柱表面的功能化。本课题组（王家斌等, 色谱, 2011, 29(12), 1222-1229）在前期工作中采用N-丙烯酰琥珀酰亚胺（NAS）为基质单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）为交联剂，原位聚合制备聚（NAS-co-EDMA）毛细管整体柱，再通过化学键合法将生物大分子纤维素-三（4-甲基苯甲酸酯）共价键合到整体柱上，实现了纤维素功能化整体柱的制备。在这些工作中，生物大分子功能化整体柱的制备思路主要是在活性基质整体柱表面进行二次功能化衍生，因此其制备过程复杂、制备时间冗长、制备成功率较低，限制了生物大分子功能化整体柱技术的推广和应用。

粘多糖是一类含氮的不均一多糖，由不同的双糖单位重复联接而成；其中一个成分是N-乙酰氨基己糖，另一个则为糖醛酸或已糖。常见的粘多糖主要有：硫酸软骨素、透明质酸、透明质酸盐、肝素、硫酸皮肤素，硫酸类肝素和硫酸角质素等。这些多糖都是直链杂多糖，是构成细胞间结缔组织的主要成分，广泛存在于哺乳动物各种细胞内。粘多糖独特的分子结构使其表现出很强的极性和负电性，因此拥有很强的亲水性能，体现出很好的保湿、润滑、抗凝血、降血脂等作用，在生物医药、化妆品、组织工程等领域得到广泛应用。然而，以粘多糖为功能化物质制备整体柱还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种粘多糖功能化亲水固相微萃取整体柱，其针对生物大分子功能化整体柱制备领域存在复杂的二次衍生问题，利用粘多糖上的N-乙酰氨基可在酸或碱催化的条件下参与脲醛缩聚反应的特性，将粘多糖、尿素溶液、甲醛溶液、催化剂溶液混合，通过一步原位脲醛脱水缩聚制备粘多糖功能化整体柱，其中，粘多糖同时起到了整体结构交联和亲水功能化的双重作用。得益于键合的粘多糖的超强亲水性，该整体柱对极性分析对象体现出明显的亲水富集萃取能力。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种粘多糖功能化亲水固相微萃取整体柱，其是由粘多糖、带酰胺基的基质单体溶液、带醛基的基质单体溶液在催化剂溶液作用下原位脱水缩聚制得；其中，粘多糖起到整体结构交联和亲水功能化的双重作用。

按质量百分数之和为100%计，各组分所占质量百分数为：粘多糖0.1~1%、带酰胺基的基质单体溶液40~55%、带醛基的基质单体溶液36~50%、催化剂溶液8~10%。

其中，所述粘多糖包括透明质酸、透明质酸盐、硫酸软骨素、肝素、硫酸皮肤素，硫酸类肝素、硫酸角质素中的任意一种；

所述带酰胺基的基质单体溶液为尿素的水溶液，其浓度为1 g/mL；

所述带醛基的基质单体溶液为甲醛的水溶液，其中甲醛的质量浓度为33%~37%；

所述催化剂为盐酸、硫酸、磷酸或氢氧化钠的水溶液，其浓度为0.20 mol/L。

所述粘多糖功能化亲水固相微萃取整体柱的制备方法，包括以下步骤：

1）空管的清洗：将空管接上液相泵，用色谱纯甲醇在0.5 mL/min流速下冲洗10 min，然后通氮气，并置于60 ℃的烘箱中烘干10min，待用；

2）管内快速缩聚：将粘多糖与带酰胺基的基质单体溶液、带醛基的基质单体溶液、催化剂溶液均匀混合，快速超声振荡1~2 min，再将混合物快速注满洗净干燥的空管中，两端封闭并浸于70℃水浴中恒温加热10 min；

3）整体柱的冲洗：待反应完成后，以水为流动相，将整体柱在液相色谱泵上冲洗1h，以去除柱床内残留的溶剂和反应残留试剂，即得到所述粘多糖功能化亲水固相微萃取整体柱。

所用空管为特氟龙（PTFE）管或聚醚醚酮（PEEK）管。

本发明的显著优点在于：

1）天然大分子物质（比如蛋白质、多糖、纤维素等）通常都是通过整体柱表面涂覆或化学键合等方式，实现其对整体材料的功能化。本发明利用粘多糖自身带有乙酰氨基基团，可直接参与整体柱制备的缩聚反应，且粘多糖的使用还可在整体柱制备过程中起到整体结构交联的作用；此外，由于粘多糖本身具有强亲水性，它也赋予了整体柱优越的亲水萃取性能。因此，粘多糖的加入起到了交联和亲水的双重作用。

2）本发明粘多糖功能化亲水固相微萃取整体柱的制备只需一步缩聚，方法简便，反应速度快，省去了繁琐的整体材料表面二次衍生的步骤，大大提高了生物大分子功能化整体柱的制备效率，为生物大分子功能化整体柱的制备提供了一种新技术，将对生物大分子功能化整体柱的推广和应用带来很大的帮助。

3）对比通常使用的石英毛细管，本发明采用PTFE管或PEEK管作为整体柱的管材料，这两种材料具有机械强度高、柔韧性好的特点，使整体柱在制备及分析检测应用时不易出现折断等情况，提高了整体柱的适应性和易用性，延长了其使用寿命。

4）本发明所得粘多糖功能化整体柱应用于亲水固相微萃取时，在较广泛的样品溶液乙腈含量范围（40-95%）内，都能对极性分析对象体现出明显的亲水富集萃取能力，可实现三聚氰胺、氨基糖苷类抗生素等多种极性化合物的高效富集萃取与高灵敏检测。

附图说明

图1为含不同质量百分数透明质酸钠的功能化亲水固相微萃取整体柱对三聚氰胺的突破曲线；

图中A为透明质酸钠质量百分数为0%的整体柱对1mg/mL甲苯的突破曲线（表征体系死时间），B为透明质酸钠质量百分数为0%的整体柱对1mg/mL三聚氰胺的突破曲线，C为透明质酸钠质量百分数为0.3%的整体柱对1mg/mL三聚氰胺的突破曲线，D为透明质酸钠质量百分数为0.6%的整体柱对1mg/mL三聚氰胺的突破曲线，E为透明质酸钠质量百分数为0.8%的整体柱对1mg/mL三聚氰胺的突破曲线。

图2为以透明质酸钠质量百分数为0.8%的功能化整体柱作为固相微萃取介质，构建在线管内固相微萃取-高效液相色谱（In-tube SPME-HPLC）联用系统，在线富集检测奶粉样品中添加三聚氰胺（MEL）的色谱图；

图中A为添加20 ng/mL三聚氰胺（MEL）的奶粉样品的色谱图，B为空白奶粉样品的色谱图。

图3为以硫酸软骨素质量百分数为0.8%的功能化整体柱作为固相微萃取介质，构建在线管内固相微萃取-高效液相色谱（In-tube SPME-HPLC）联用系统，在线富集检测奶粉样品中添加的三聚氰胺时，样品溶液中乙腈含量对三聚氰胺富集效率的影响。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

（1）将内径为750 µm的PTFE管接上液相泵，用色谱纯甲醇在0.5 mL/min的流速下冲洗10 min，去除PTFE管内壁残留的有机物杂质等，然后通氮气，并置于60 ℃烘箱中烘干10min，待用；

（2）分别按表1、2整体柱组成配比称取透明质酸钠或硫酸软骨素、浓度为1 g/mL的尿素溶液、质量浓度为35%的甲醛溶液、浓度为0.2 mol/L的盐酸溶液或硫酸溶液，将其均匀混合，快速超声振荡1~2 min，再将混合物快速注满洗净干燥的PTFE管中，两端封闭并浸于70℃水浴中恒温加热10min；

（3）整体柱的冲洗：待反应完成后，以水为流动相，在液相色谱泵上冲洗PTFE管整体柱约1小时，以去除柱床内残留的溶剂，即得到相应透明质酸钠功能化亲水固相微萃取整体柱或硫酸软骨素功能化亲水固相微萃取整体柱。

表1 透明质酸钠功能化亲水固相微萃取整体柱组成

表2 硫酸软骨素功能化亲水固相微萃取整体柱组成

应用实施例1

以1 mg/mL甲苯溶液（ACN/H₂O=95%/5%，v/v）为流动相，微量注射泵流速为10 μL/min，紫外检测波长为214 nm，对制备的整体柱e进行突破曲线的死时间测试；并以1 mg/mL三聚氰胺溶液（ACN/H₂O=95%/5%，v/v）为流动相，微量注射泵流速为10 μL/min，紫外检测波长为214 nm，对制备的整体柱e、f、g、b分别进行突破曲线实验。

图1为含不同质量百分数透明质酸钠的功能化亲水固相微萃取整体柱对三聚氰胺的突破曲线。由图1可以看出，随着粘多糖（透明质酸纳）含量的增加，三聚氰胺的突破时间不断延长（由7.5min增加到31min），其对应的三聚氰胺的富集量分别为2.04×10³ μg/mL（柱e，透明质酸钠质量百分数为0%）、6.52×10³ μg/mL（柱f，透明质酸钠质量百分数为0.3%）、1.30×10⁴ μg/mL（柱g，透明质酸钠质量百分数为0.6%）、2.12×10⁴ μg/mL（柱b，透明质酸钠质量百分数为0.8%），这体现出粘多糖（透明质酸钠）功能化固相微萃取整体柱优越的亲水富集萃取性能。

应用实施例2

以制备的粘多糖（透明质酸钠）功能化亲水固相微萃取整体柱b构建在线管内固相微萃取-高效液相色谱（In-tube SPME-HPLC）联用分析系统，对加标20 ng/mL三聚氰胺（MEL）的奶粉样品（A）和空白奶粉样品（B）进行检测。进样样品及载样液组成为ACN/H₂O=50%/50%（v/v），进样流速0.2 mL/min，进样体积500 μL；洗脱液组成ACN/H₂O=10%/90%（v/v），洗脱流速0.1 mL/min，洗脱体积150 μL；分离流动相ACN/H₂O=10%/90%（v/v），分离流速：0.8 mL/min，柱温箱温度30 ℃，检测波长214 nm。

图2为利用在线管内固相微萃取-高效液相色谱联用分析系统在线富集检测奶粉样品中添加三聚氰胺的色谱图。由图2可见，在该联用系统条件下，粘多糖（透明质酸钠）功能化固相微萃取整体柱消除了奶粉基质中大量非极性物质对分离检测的干扰，并实现了奶粉样品中加标的微量三聚氰胺的高效富集萃取与高灵敏检测，表明了粘多糖（透明质酸钠）功能化固相微萃取整体柱优良的杂质去除能力和强大的亲水富集萃取性能。

应用实施例3

以制备的粘多糖（硫酸软骨素）功能化亲水固相微萃取整体柱j构建在线In-tube SPME-HPLC联用分析系统，考察样品溶液中乙腈含量对分析对象三聚氰胺峰面积的影响。进样样品及载样液组成为ACN/H₂O=40%/60%~95%/5%（v/v），进样流速0.2 mL/min，进样体积500 μL；洗脱液组成ACN/H₂O=10%/90%（v/v），洗脱流速0.1 mL/min，洗脱体积150 μL；分离流动相ACN/H₂O=10%/90%（v/v），分离流速：0.8 mL/min，柱温箱温度30 ℃，检测波长214 nm。

图3为在线富集检测奶粉样品中添加的三聚氰胺时，样品溶液中乙腈含量对三聚氰胺富集效率的影响。如图3所示，随着样品溶液中的乙腈含量由40%增加到95%，三聚氰胺的峰面积不断增加，当乙腈含量增加到95%时，三聚氰胺的峰面积最大，说明所制备的粘多糖（硫酸软骨素）功能化固相微萃取整体柱在较广泛的乙腈含量范围内都能体现出明显的亲水富集萃取能力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。