一种酯化修饰的松香基高分子色谱柱分离天麻素的方法与流程

本发明属于高效液相色谱法领域，特别是一种酯化修饰的松香基高分子色谱柱分离天麻素的方法。

背景技术：

天麻素(Gastrodin)的化学结构式：

天麻素(Gastrodin)是名贵中药材天麻的有效成分，具有增加中央及外周动脉血管顺应性，降低外周血管阻力，增加心脑血管血流量，产生温和降压作用，且对心肌细胞、脑组织均有保护作用，同时具有镇静、催眠、镇痛、增强免疫等作用，在临床上广泛用于治疗头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、癫痫、抽搐、破伤风等病症，疗效显著，且无明显副作用。尤其近年来，天麻素在抑郁、阿尔茨海默病、腹水型肝癌、骨质疏松、肝纤维化、偏头痛等症状有新的研究进展，大大拓宽其医学应用领域；因此天麻素提取得率的高低是衡量天麻加工工艺的标志，研究开发对天麻素有选择性分离效果的填料意义重大。

高效液相色谱(High performance liquid chromatography，简称HPLC)有以下特点：速度快，通常分析一个样品在15～30min即可完成；分辨率高，可对差异性很小的物质对如手性物质进行分离分析；灵敏度高，紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg；柱子反复使用，用一根色谱柱可分离不同的化合物；由于它使用了非破坏性检测器，样品分析后，可除去流动相，回收少量珍贵药品，亦可用于样品的纯化制备。

目前，关于天麻素高效液相色谱分离法的报道，我们查到如下一些文献：

Huang jiao，Jiang Deng-jun.Determination of Gastrodin Contents in Wild and Cultivated Gastrodia elata from Different Regions of Chongqing by RP-HPLC.Medicinal Plant.2012,3(5)：42-44；采用反相高效液相色潽法，用C₁₈色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，以乙腈-0.05％磷酸溶液(3:97)为流动相，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长220nm。

刘玉红，易进海，RP-HPLC法同时测定天麻中游离天麻素、巴利森苷和总天麻素，中成药，2012，34(1)：182-184；采用反相高效液相色潽法，用C₁₈色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，以甲醇-1％冰醋酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速为0.8mL/min，柱温为35℃，检测波长270nm。

关于应用酯化修饰的松香基高分子色谱柱分离天麻素的方法，到目前为止未见报道。。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决上述存在的问题，提供一种酯化修饰的松香基高分子色谱柱分离天麻素的方法，该方法灵敏度高、操作简单，不会对药物、保健品、食品造成二次污染。

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种酯化修饰的松香基高分子色谱柱分离天麻素的方法，将酯化修饰的松香基高分子微球用装柱机湿法装柱制备色谱柱，HPLC分离天麻素及其衍生物4-甲氧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷，检测波长：220～280nm，温度30±10℃，流速0.3～1.0mL/min，即可实现天麻素和4-甲氧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷的分离。

作为技术方案的进一步改进，以上所述的酯化修饰的松香基高分子微球为球形多孔材料，其粒径为5～15μm，酸值5～50mgKOH/g，平均孔径为10～15nm，比表面积为80～150m²/g。

作为技术方案的进一步改进，以上所述酯化修饰的松香基高分子微球制备方法为：将马来松香丙烯酸乙二醇酯-(甲基)丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物即松香基高分子微球先用酰化试剂进行酰化反应，再用酯化试剂进行酯化反应，即可得到所述的酯化修饰的松香基高分子微球。马来松香丙烯酸乙二醇酯-(甲基)丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物的制备方法，在申请人在先申请的专利“一种含松香基的三元共聚物及其制备方法”(专利申请号：201010100733.4)公开。

作为技术方案的进一步改进，以上所述的酰化试剂为草酰氯或氯化亚砜。

作为技术方案的进一步改进，以上所述的酯化试剂甲醇、乙二醇或甘油中的一种。

作为技术方案的进一步改进，以上所述的酰化反应为：将马来松香丙烯酸乙二醇酯-(甲基)丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物即松香基高分子微球和溶剂环己烷、正己烷、庚烷、丙酮、辛烷、1,4-二氧六环中的一种按质量比为1：10～16置于反应容器中，在冰水浴、搅拌条件下，向反应中滴加酰化试剂，松香基高分子与酰化试剂质量比为1：0.3～0.9，滴加完毕后，在60～85℃条件下加热回流反应4～8小时，将酰化反应结束得到的反应体系采用减压蒸馏装置，蒸出多余的溶剂和酰化试剂，得到酰化的松香基高分子微球。

作为技术方案的进一步改进，以上所述的酯化反应为：将将酰化松香基高分子微球和溶剂环己烷、正己烷、庚烷、丙酮、辛烷、1,4-二氧六环中的一种按照质量比为1：7～13加入反应器中，然后加入酯化试剂，酰化松香基高分子微球和酯化试剂的质量比为1：0.2～3，在60～80℃条件下搅拌回流反应1～4小时，温水洗涤微球至PH＝6～7，乙醇抽提10～50h，加入蒸馏水搅拌加热沸腾除去乙醇等小分子物质，即可得到所述的酯化修饰的松香基高分子微球。

作为技术方案的进一步改进，以上所述的湿法装柱为将酯化修饰的松香基高分子微球混于甲醇、乙腈、或氯仿中的一种，超声分散均匀，将均浆液填充于空色谱柱中，用装柱机恒压泵在3000～3500psi压力下装填120～200min，待柱压平衡后，将色谱柱从装柱机上取下，装上柱头，制得酯化修饰的松香基高分子色谱柱。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.本发明制备出的酯化修饰的松香基高分子微球，膨胀度小、比表面积大，可用于分离天然产物的有效成分，并可在有机溶剂中使用，不会因膨胀而破坏分子微球的网状结构，导致识别能力丧失。

2.本发明以酯化修饰的松香基高分子微球为填料制备的酯化修饰的松香基高分子色谱柱，因富含大小不一的孔结构，具有通透性好、背压低、高效和高通量等优点，在较高的流速和压力下，没有出现压塌的现象，可以在高流速下使用。

3.本发明所使用的色谱柱，对天麻素与4-甲氧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷有较好的分离效果；在C₁₈柱上的分离度为0.37，在本发明专利色谱柱上的分离度为1.97以上。

4.本发明所使用的酯化修饰的松香基高分子以天然产物为原料合成得到，安全无毒，机械强度高。

5.本发明所使用的色谱柱，灵敏度高，操作简单。

附图说明

图1 C₁₈柱对天麻素与4-甲氧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷混合溶液的高效液相色谱谱图；

图2为本发明实施例4对天麻素与4-甲氧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷混合溶液的高效液相色谱谱图；

图3为本发明实施例5对天麻素与4-甲氧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷混合溶液的高效液相色谱谱图；

图4为本发明实施例6对天麻素与4-甲氧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷混合溶液的高效液相色谱谱图

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。

酯化修饰的松香基高分子微球的制备：

马来松香丙烯酸乙二醇酯-(甲基)丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物简称“松香基高分子微球”

实施例1

将称取松香基高分子微球5g和量取78g环己烷置于反应容器中，二者质量比为1:15.6，在冰水浴、搅拌条件下，向反应中滴加酰化试剂2.55g草酰氯，松香基高分子与酰化试剂质量比为1:0.51，滴加完毕后，加热回流80℃反应4小时，然后将酰化反应结束得到的反应体系采用减压蒸馏装置，蒸出多余的环己烷和酰化试剂，得到酰化的松香基高分子微球。

将前述得到酰化松香基高分子微球和溶剂环己烷39g加入反应器中，二者质量比为1:7.8，然后加入酯化试剂4.75g甲醇，酰化松香基高分子微球和酯化试剂的质量比为1:0.95，搅拌回流60℃反应1小时，温水洗涤微球至PH＝6.0，乙醇抽提10h，加入蒸馏水搅拌加热沸腾除去乙醇等小分子物质，即可得到所述的酯化修饰的松香基高分子微球。

经检测分析，本实施例得到的酯化修饰的松香基高分子微球，修饰后的高分子微球为球形多孔材料，其粒径为5～15μm，酸值5～50mgKOH/g，平均孔径为10～15nm，比表面积为80～150m²/g。

实施例2：

将称取松香基高分子微球10g和量取104g的1,4-二氧六环置于反应容器中，二者质量比为1:10.4，在冰水浴、搅拌条件下，向反应中滴加酰化试剂5.1g草酰氯，松香基高分子与酰化试剂质量比为1:0.51，滴加完毕后，加热至70℃反应6小时，然后将酰化反应结束得到的反应体系采用减压蒸馏装置，蒸出多余的1,4-二氧六环和酰化试剂，得到酰化的松香基高分子微球。

将前述得到酰化松香基高分子微球和溶剂1,4-二氧六环100g加入反应器中，二者质量比为1:10，然后加入酯化试剂9.93g乙二醇，酰化松香基高分子微球和酯化试剂的质量比为1:0.99，搅拌70℃反应3小时，温水洗涤微球至PH＝6.5，乙醇抽提24h，加入蒸馏水搅拌加热沸腾除去乙醇等小分子物质，即可得到所述的酯化修饰的松香基高分子微球。

经检测分析，本实施例得到的酯化修饰的松香基高分子微球，修饰后的高分子微球为球形多孔材料，其粒径为5～15μm，酸值5～50mgKOH/g，平均孔径为10～15nm，比表面积为80～150m²/g。

实施例3：

将称取松香基高分子微球5g和量取78.8g丙酮置于反应容器中，二者质量比为1:15.76，在冰水浴、搅拌条件下，向反应中滴加酰化试剂4.01g氯化亚砜，松香基高分子与酰化试剂质量比为1:0.8，滴加完毕后，加热回流60℃反应8小时，然后将酰化反应结束得到的反应体系采用减压蒸馏装置，蒸出多余的丙酮和酰化试剂，得到酰化的松香基高分子微球。

将前述得到酰化松香基高分子微球和溶剂丙酮59.1g加入反应器中，二者质量比为1:11.82，然后加入酯化试剂4.85g甘油，酰化松香基高分子微球和酯化试剂的质量比为1:0.97，搅拌回流80℃反应4小时，温水洗涤微球至PH＝7.0，乙醇抽提36h，加入蒸馏水搅拌加热沸腾除去乙醇等小分子物质，即可得到所述的酯化修饰的松香基高分子微球。

经检测分析，本实施例得到的酯化修饰的松香基高分子微球，修饰后的高分子微球为球形多孔材料，其粒径为5～15μm，酸值5～50mgKOH/g，平均孔径为10～15nm，比表面积为80～150m²/g。

实施例4

将称取松香基高分子微球5g和量取60g正己烷置于反应容器中，二者质量比为1:12，在冰水浴、搅拌条件下，向反应中滴加酰化试剂1.5g草酰氯，松香基高分子与酰化试剂质量比为1:0.3，滴加完毕后，加热回流85℃反应5小时，然后将酰化反应结束得到的反应体系采用减压蒸馏装置，蒸出多余的正己烷和酰化试剂，得到酰化的松香基高分子微球。

将前述得到酰化松香基高分子微球和溶剂正己烷45g加入反应器中，二者质量比为1:9，然后加入酯化试剂10g甲醇，酰化松香基高分子微球和酯化试剂的质量比为1:2，搅拌回流65℃反应2小时，温水洗涤微球至PH＝6.0，乙醇抽提50h，加入蒸馏水搅拌加热沸腾除去乙醇等小分子物质，即可得到所述的酯化修饰的松香基高分子微球。

经检测分析，本实施例得到的酯化修饰的松香基高分子微球，修饰后的高分子微球为球形多孔材料，其粒径为5～15μm，酸值5～50mgKOH/g，平均孔径为10～15nm，比表面积为80～150m²/g。

实施例5：

将称取松香基高分子微球10g和量取140g的庚烷置于反应容器中，二者质量比为1:14，在冰水浴、搅拌条件下，向反应中滴加酰化试剂7.0g草酰氯，松香基高分子与酰化试剂质量比为1:0.7，滴加完毕后，加热至65℃反应7小时，然后将酰化反应结束得到的反应体系采用减压蒸馏装置，蒸出多余的庚烷和酰化试剂，得到酰化的松香基高分子微球。

将前述得到酰化松香基高分子微球和溶剂庚烷130g加入反应器中，二者质量比为1:13，然后加入酯化试剂30g乙二醇，酰化松香基高分子微球和酯化试剂的质量比为1:3，搅拌75℃反应3小时，温水洗涤微球至PH＝6.5，乙醇抽提30h，加入蒸馏水搅拌加热沸腾除去乙醇等小分子物质，即可得到所述的酯化修饰的松香基高分子微球。

经检测分析，本实施例得到的酯化修饰的松香基高分子微球，修饰后的高分子微球为球形多孔材料，其粒径为5～15μm，酸值5～50mgKOH/g，平均孔径为10～15nm，比表面积为80～150m²/g。

实施例6：

将称取松香基高分子微球5g和量取55g辛烷置于反应容器中，二者质量比为1:11，在冰水浴、搅拌条件下，向反应中滴加酰化试剂3.0g氯化亚砜，松香基高分子与酰化试剂质量比为1:0.6，滴加完毕后，加热回流75℃反应8小时，然后将酰化反应结束得到的反应体系采用减压蒸馏装置，蒸出多余的辛烷和酰化试剂，得到酰化的松香基高分子微球。

将前述得到酰化松香基高分子微球和溶剂辛烷55.0g加入反应器中，二者质量比为1:11，然后加入酯化试剂1g甘油，酰化松香基高分子微球和酯化试剂的质量比为1:0.2，搅拌回流65℃反应4小时，温水洗涤微球至PH＝7.0，乙醇抽提40h，加入蒸馏水搅拌加热沸腾除去乙醇等小分子物质，即可得到所述的酯化修饰的松香基高分子微球。

经检测分析，本实施例得到的酯化修饰的松香基高分子微球，修饰后的高分子微球为球形多孔材料，其粒径为5～15μm，酸值5～50mgKOH/g，平均孔径为10～15nm，比表面积为80～150m²/g。

应用酯化修饰的松香基高分子色谱柱分离天麻素的方法

实施例7：

一种酯化修饰的松香基高分子色谱柱分离天麻素的方法，按照如下步骤进行：

(1)酯化修饰的松香基高分子色谱柱制备：将将实施例1酯化修饰的松香基高分子微球混于甲醇中，超声分散均匀，将均浆液填充于空色谱柱中，用装柱机恒压泵在3000psi压力下装填120min，待柱压平衡后，将色谱柱从装柱机上取下，装上柱头，制得酯化修饰的松香基高分子色谱柱。再将所得的酯化修饰的松香基高分子色谱柱用甲醇冲洗至基线平衡即可进样。

(2)制备样品溶液：取适量天麻素、4-甲氧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷，用甲醇溶解，配制成每1L含天麻素2.5×10^-4mol的天麻素与4-甲氧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷混合溶液，进样；

(3)设定参数：将酯化修饰的松香基高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为0.3mL/min，检测波长220nm，柱温箱25℃；

(4)分离：启动进样阀使甲醇将样品带入酯化修饰的松香基高分子色谱柱中，实现天麻素的分离，所得结果如图2所示，在保留时间11.06min时出现天麻素峰，在保留时间12.39min时出现4-甲氧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷峰，分离度为2.31。

实施例8：

一种酯化修饰的松香基高分子色谱柱分离天麻素的方法，按照如下步骤进行：

(1)酯化修饰的松香基高分子色谱柱制备：将将实施例2酯化修饰的松香基高分子微球混于乙腈中，超声分散均匀，将均浆液填充于空色谱柱中，用装柱机恒压泵在3300psi压力下装填160min，待柱压平衡后，将色谱柱从装柱机上取下，装上柱头，制得酯化修饰的松香基高分子色谱柱。再将所得的酯化修饰的松香基高分子色谱柱用甲醇冲洗至基线平衡即可进样。

(2)制备样品溶液：取适量天麻素、4-甲氧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷，用甲醇溶解，配制成每1L含天麻素2.5×10^-4mol的天麻素与4-甲氧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷混合溶液，进样；

(2)设定参数：将酯化修饰的松香基高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为0.6mL/min，检测波长250nm，柱温箱35℃；

(3)分离：启动进样阀使甲醇将样品带入酯化修饰的松香基高分子色谱柱中，实现天麻素的分离，所得结果如图3所示，在保留时间11.22min时出现天麻素峰，在保留时间12.57min时出现4-甲氧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷峰，分离度为1.97。

实施例9：

一种酯化修饰的松香基高分子色谱柱分离天麻素的方法，按照如下步骤进行：

(1)酯化修饰的松香基高分子色谱柱制备：将将实施例3酯化修饰的松香基高分子微球混于氯仿中，超声分散均匀，将均浆液填充于空色谱柱中，用装柱机恒压泵在3500psi压力下装填200min，待柱压平衡后，将色谱柱从装柱机上取下，装上柱头，制得酯化修饰的松香基高分子色谱柱。再将所得的酯化修饰的松香基高分子色谱柱用甲醇冲洗至基线平衡即可进样。

(2)制备样品溶液：取适量天麻素、4-甲氧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷，用甲醇溶解，配制成每1L含天麻素2.5×10^-4mol的天麻素与4-甲氧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷混合溶液，进样；

(3)设定参数：将酯化修饰的松香基高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为1.0mL/min，检测波长270nm，柱温箱30℃；

(4)分离：启动进样阀使甲醇将样品带入酯化修饰的松香基高分子色谱柱中，实现天麻素的分离，所得结果如图4所示，在保留时间11.18min时出现天麻素峰，在保留时间12.43min时出现4-甲氧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷峰，分离度为2.17。

同样的，申请人对实施4-6所制备得到的酯化修饰的松香基高分子微球进行天麻素和4-甲氧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷的分离，分离度均可以达到1.97以上。