本发明涉及一种凝集素-磁小体复合物的制备方法。
背景技术：
凝集素是一种能与某一类糖基特异性结合的蛋白质，将凝集素共价偶联于固相载体，利用凝集素与糖链的亲和性，可以达到对特异糖复合物的富集与分离，这使其在糖组学等研究领域中有着广泛的应用。磁小体是一种由趋磁细菌产生的磁性纳米颗粒，拥有天然形成的生物膜，具有很好的生物相容性。PE作为生物膜的重要组成部分，为磁小体表面提供了大量氨基，可以用于偶联抗体、酶、药物等功能分子。此外磁小体还具有大小均一、晶型稳定、超顺磁性等特点，这引起了人们对磁小体研究的极大热情。磁小体已在免疫检测、载药体系、固定化酶等多领域得到应用。
然而将磁小体与凝集素偶联用于糖蛋白分离的研究，还未见报道。因此本实验以麦胚凝集素(WGA)为例，探索凝集素-磁小体制备的方法及其在分离糖蛋白方面的作用。从趋磁细菌中提取的磁小体表面附着大量蛋白，因而在提取过程中需要反复超声清洗磁小体，以尽可能去除磁小体表面蛋白。为避免磁小体表面蛋白带来的影响，简化磁小体提取过程，同时增加磁小体表面氨基含量，实验首先对磁小体进行了修饰，利用十二烷基硫酸钠(SDS)去除磁小体表面蛋白;并使用磷脂酰乙醇胺(PE)与磁小体超声孵育，制备PE-磁小体;接着，以双(硫代琥珀酰亚胺基)辛二酸酯钠盐(BS3)为连接臂，与PE-磁小体及WGA的氨基反应，制备WGAPE-磁小体;最后，将合成的WGA-PE-磁小体用于鸡卵清蛋白(OVA)的分离与纯化，以验证凝集素-磁小体复合物在分离糖蛋白方面的作用。
技术实现要素：
本发明提出一种凝集素-磁小体复合物的制备方法。
一种凝集素-磁小体复合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）即将菌体以1∶10(M∶V)的比例悬浮于1PBS缓冲液中，用高压均质机(压力120~140MPa)破碎3~4次后，放入磁场中，磁性分离磁小体；
（2）将磁小体置于1×PBS缓冲液中，超声清洗5~8次，去离子水清洗3次后，真空冷冻干燥，于-80℃保存备用；
（3）取1mg磁小体于1mL1%SDS溶液中100℃加热5min；
（4）磁性分离器收集磁小体，并用4mmol/L磷酸盐(PB，pH值7．5)缓冲液清洗3次；
（5）磁小体重新悬浮于1mg/mLPE溶液，100W超声30min，避光孵育2h，磁性分离器收集反应后的磁小体经PB缓冲液清洗3次后备用；
（6）磁小体加入1．5mL氯仿/甲醇(V∶V，1∶2)，剧烈振荡后，加入0．5mL氯仿后继续振荡，再加入0．5mL水并剧烈振荡，3000r/min，离心5min，取有机层(下层)于离心管中，N2吹干备用；、分别取1mg磁小体和PE-磁小体悬浮于1mL1mmol/LBS3溶液中，超声混匀，于37℃，200r/min，反应0.5h，磁性分离器收集反应后产物，去上清，并用PB缓冲液清洗，将上述复合物悬浮于1mL1mg/mLWGA溶液，37℃，200r/min，反应1h，磁性分离器收集并用PB缓冲液清洗后，于5%BSA溶液37℃，200r/min，封闭0.5h后即得。
所述1PBS包括7mmol/LNaCl、2.7mmol/LKCl、10mmol/LNa2HPO4、2mmol/LKH2PO4。
蛋白质的分离包括以下步骤：取GA-磁小体/WGA-PE-磁小体各1mg，于500μL1%SDS溶液100℃加热5min，各取5μL上样取OVA及ConA各1mg，溶解于1mL结合缓冲液中[20mmol/LTris-HCl(pH值7.4)，0.15mol/LNaCl，1mmol/LCaCl2，1mmol/LMgCl2，1mmol/LMnCl2]，用结合缓冲液清洗WGA-PE-磁小体复合物3次后，加入1mL的OVA及ConA蛋白混合液中，于25℃，100r/min，反应1h，反应结束后收集未结合的蛋白，再用结合缓冲液清洗WGA-PE-磁小体复合物3~5次，加入500μL洗脱缓冲液[20mmol/LTris-HCl(pH值7.4)，0.15mol/LNaCl，1mmol/LCaCl2，1mmol/LMgCl2，1mmol/LMnCl2，100mmol/LN-乙酰葡萄糖胺，25℃，100r/min，反应1h后即得。
本发明所述方法制备凝集素-磁小体复合物，改造后的PE-磁小体较改造前的磁小体分散性更好，偶联凝集素更多，制备的WGAPE-磁小体，能很好地分离目的糖蛋白，同时避免了磁小体自身蛋白对糖蛋白分离特异性的影响。
具体实施方式
实施例1。
一种凝集素-磁小体复合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）即将菌体以1∶10(M∶V)的比例悬浮于1PBS缓冲液中，用高压均质机(压力120~140MPa)破碎3~4次后，放入磁场中，磁性分离磁小体；
（2）将磁小体置于1×PBS缓冲液中，超声清洗5~8次，去离子水清洗3次后，真空冷冻干燥，于-80℃保存备用；
（3）取1mg磁小体于1mL1%SDS溶液中100℃加热5min；
（4）磁性分离器收集磁小体，并用4mmol/L磷酸盐(PB，pH值7．5)缓冲液清洗3次；
（5）磁小体重新悬浮于1mg/mLPE溶液，100W超声30min，避光孵育2h，磁性分离器收集反应后的磁小体经PB缓冲液清洗3次后备用；
（6）磁小体加入1．5mL氯仿/甲醇(V∶V，1∶2)，剧烈振荡后，加入0．5mL氯仿后继续振荡，再加入0．5mL水并剧烈振荡，3000r/min，离心5min，取有机层(下层)于离心管中，N2吹干备用；、分别取1mg磁小体和PE-磁小体悬浮于1mL1mmol/LBS3溶液中，超声混匀，于37℃，200r/min，反应0.5h，磁性分离器收集反应后产物，去上清，并用PB缓冲液清洗，将上述复合物悬浮于1mL1mg/mLWGA溶液，37℃，200r/min，反应1h，磁性分离器收集并用PB缓冲液清洗后，于5%BSA溶液37℃，200r/min，封闭0.5h后即得。
（7）所述1PBS包括7mmol/LNaCl、2.7mmol/LKCl、10mmol/LNa2HPO4、2mmol/LKH2PO4。
实施例2。
利用如权利要求1所述一种凝集素-磁小体复合物的制备方法，其特征在于其蛋白质的分离包括以下步骤：取GA-磁小体/WGA-PE-磁小体各1mg，于500μL1%SDS溶液100℃加热5min，各取5μL上样取OVA及ConA各1mg，溶解于1mL结合缓冲液中[20mmol/LTris-HCl(pH值7.4)，0.15mol/LNaCl，1mmol/LCaCl2，1mmol/LMgCl2，1mmol/LMnCl2]，用结合缓冲液清洗WGA-PE-磁小体复合物3次后，加入1mL的OVA及ConA蛋白混合液中，于25℃，100r/min，反应1h，反应结束后收集未结合的蛋白，再用结合缓冲液清洗WGA-PE-磁小体复合物3~5次，加入500μL洗脱缓冲液20mmol/LTris-HCl(pH7.4)，0.15mol/LNaCl，1mmol/LCaCl2，
1mmol/LMgCl2，1mmol/LMnCl2，100mmol/LN-乙酰葡萄糖胺，25℃，100r/min，反应1h后即得。