本公开总体涉及控制分子穿过纳米孔的移动以便它们可以被检测、表征和/或测序的方法，所述分子例如dna(脱氧核糖核酸)、rna(核糖核酸)和蛋白质以及其他生物分子。
背景技术：
自从454lifesciences在2005年推出首个第二代dna测序系统以来，dna测序已成为市场迅速增长的最热门技术之一。第二代dna测序的主要特点是其具有超高通量和短读长的大规模并行测序能力。它比第一代技术、即sanger法更快更便宜。然而，第二代dna测序的短读长使得从头组装、全基因组定相和结构变异分析非常困难，限制了其用重复序列或杂合序列分辨复杂dna区域的能力。短读长也使得计算、例如整个rna转录物测序或宏基因组项目中的某些基因序列测序是困难的或不可能的。dna测序的重要的未来应用是临床诊断，这需要甚至更快、更便宜和更精确的测序技术。对于寻找具有长读长(>>1000个碱基)、快速运行时间(每个基因组<1小时)和低成本(每个基因组<300美元)能力的新dna测序技术存在极大的兴趣。基于纳米孔的dna测序技术是可以满足这些要求的最有前途的第三代技术。
纳米孔测序的概念基于1996年johnkasianowicz等人使用α-溶血素孔的工作开发。α-溶血素孔在其最窄点处具有1.5nm的直径，该直径足够大以允许单链dna(ssdna)穿过它，但对于双链dna(dsdna)太小。如果孔位于两个离子缓冲池之间的膜中，并且跨膜施加偏压，则将检测到通过孔的离子电流。当ssdna穿过孔时，离子电流将被部分阻断。不同dna碱基的阻断量级是不同的。通过当ssdna穿过孔时测量离子电流阻断，碱基可以被测序。可以应用相同的原理测定rna、多肽(氨基酸)或其他线性分子的序列。其他纳米孔dna碱基传感方法也正在开发中，例如识别隧穿(recognitiontunneling)(lindsay和zhang，2008，2016)和纳米线fet(han等人，2014)。
akeson等人在2001年公布了第一个描述使用纳米孔的dna测序的专利。此后，它引起了学术研究实验室和工业研发部门的巨大兴趣。可以用于dna测序的纳米孔包括保持在脂双层膜上的生物(蛋白质)孔，例如α-溶血素孔(kasianowicz等人，1996，akeson等人，2001，stoddart等人，2015)，mspa(耻垢分枝杆菌孔蛋白a)孔(derrington等人2010，pavlenok等人，2012)和csgg孔(大肠杆菌卷曲菌毛特异性基因g)(goyal等人，2014)，以及合成纳米孔，包括固态纳米孔和石墨烯纳米孔(wanunu，2012)。到目前为止，使用纳米孔的dna测序的最困难问题是dna分子非常快地穿过纳米孔，每个碱基大约1μs，这使得用单碱基分辨的可靠碱基传感是非常困难的或不可能的。为了成功地测序dna，dna易位速度必须减慢为至少一千分之一至每个碱基约1ms或更长。使用目前的碱基传感技术的可靠的单碱基分辨的优选速度范围是每个碱基3ms至10ms。
自1990年代出现纳米孔测序的概念以来，已经提出了用于控制或减慢dna易位速度的各种方法。这些方法可以分为以下六类：(1)生物学方法，例如分子马达(解旋酶、聚合酶等)(akeson等人，2011)和dsdna发夹或互补探针dna方法(sauer-budge等人，2003，derrington等人，2010，wanunu2012)；(2)缓冲液调节方法，例如降低缓冲液温度(yeh等人，2012，fologea等人2005)，使用氯化锂盐代替氯化钾(kowalczyk等人，2012)或增加缓冲液粘度(fologea等人，2005)；(3)化学方法(对于合成纳米孔)，例如纳米孔表面电荷修饰或纳米孔结合聚合物(wanunu和meller，2007，keyser，2011)；(4)电学方法，例如dna晶体管技术(polonsky等人，2007，2011)或横向电场拖曳(tsutsui等人，2012)；(5)机械方法，例如光学镊(keyser等人，2006，keyser2011)，磁性镊(peng和ling，2009)和原子力显微镜(afm)(king和golovchenko，2005)，以及(6)电学-机械方法，例如在合成纳米孔制造中集成压电层(peng等人，2011)。所有这些方法或在控制dna运动中存在问题，或在制造和仪器化中存在困难。分子马达方法以特异性酶的固有处理率的速度使dna运动，所述固有处理率不容易控制。它仅适用于生物孔，并且需要复杂的生物化学将酶附着于每个孔。dsdna发夹/互补探针方法在没有有效速度控制的情况下偶发地减慢dna运动，并且在样品处理上需要很多工作。缓冲液调节方法仅可以使dna易位减慢至五分之一到十分之一，远小于所需的一千分之一。化学方法和横向电场拖曳方法没有实现任何准确dna易位速度控制的机理。dna晶体管技术在计算上证实了如何控制合成纳米孔内的dna碱基运动的机理，但是由于它需要非常复杂的纳米孔结构，因此它是难以实现的，并且它很难与碱基传感一起制造和集成。光学镊和磁性镊以及afm方法可以控制穿过纳米孔的单个dna分子。这对于学术研究是有益的，但对于大规模便宜高通量dna测序和其他商业应用是远远不够的。peng等人(2011)提出的电学-机械方法在合成纳米孔制造中使用压电层以控制纳米孔内的纳米孔尺寸，从而可以减慢dna易位，然而，它没有提供如何精确控制dna运动的机理。
因此，需要用于控制dna以及其他聚合物穿过纳米孔的运动的改进的系统。
技术实现要素：
本公开涉及用于控制分子以足够的精度和适当的速度穿过纳米孔的易位速度以实现碱基单元测序的方法和系统。本公开广泛地适用于dna、rna、蛋白质和其他带电荷的生物分子或具有带电荷标签的不带电荷的生物分子的碱基单元测序和/或分子结构分析，所述带电荷标签是天然的和合成的。也可以分析合成的非生物分子。
在一个实施方式中，靶分子(例如待测序的ssdna片段)通过具有适当选择的长度和组成的相同类型的接头分子(例如单链λ-dna或合成的dna寡核苷酸)附着于磁珠。电力拉动带电荷的靶分子穿过纳米孔，直到其进程被磁珠阻碍，所述磁珠太大而不能穿过纳米孔。通过施加磁场，可以将磁珠和所附着的接头从纳米孔拉离并拉向放置在纳米孔附近并垂直于纳米孔轴的扫描板的表面。然后单独通过磁场强度或通过化学键或其他方式，将磁珠保持在扫描板上。dna和接头在作用于纳米孔内的dna碱基上的电力下被拉伸。产生分子内张力，并且在分子内张力和电力之间建立力平衡。
通过使用精密线性台移动扫描板或纳米孔基板，可以以碱基单元测序所需的速度将靶分子拉出纳米孔或插入纳米孔中。靶分子不会自由地移动通过纳米孔，而是随着其进程在相反的力产生的恒定张力下保持拉紧。当靶分子穿过纳米孔时，通过适当的碱基传感方法，传感并记录其碱基，所述碱基传感方法例如离子电流阻断法、识别隧穿法或其他方法。如果需要，接头分子的一部分可以用作测序的校准模板。多个靶分子可以用单个纳米孔或用多个纳米孔(纳米孔阵列)测序。
在本公开的一些实施方式中，接头分子可以具有位于接头附着于靶dna处的接头结。接头结是防止进入纳米孔的分子结构，并且通常大于纳米孔的入口，在某些实施方式中至少是纳米孔入口尺寸的两倍大。接头结可以是大的蛋白质(例如抗体、中性亲和素或链霉亲和素)，或大的聚合物复合体，或甚至是非磁性珠。接头分子不需要是与靶分子相同种类的分子。它可以是天然或合成的dsdna、ssdna或rna，或纤维素纤维或其他柔性线性聚合物。当靶dna在电场下被拉入纳米孔中时，接头结将起到dna易位的止动器或制动器的作用。利用该接头+接头结的构型，初始可以施加相对弱的磁场以提升附着于接头分子一端的磁珠，同时靶分子和接头结仍然通过电力在纳米孔处保持拉紧。通过在磁珠接触扫描板之前将其漂浮在纳米孔正上方，实现珠、接头分子和靶分子的精确对准，从而使得对靶分子精确测序。
在本公开的一些实施方式中，靶分子直接附着于扫描板或经由接头分子但在没有磁珠的情况下附着于扫描板。通过将扫描板置于距纳米孔基板少于一个接头分子长度，可以通过电场将靶分子拉入纳米孔。当分子运动被与扫描板的附着阻碍时，可以以可控的稳定速度将其移出或弹回到纳米孔中，所述速度对于精确的碱基单元传感是足够慢的。多个靶分子可以横向附着于扫描板。扫描板和纳米孔基板可以以区域扫描模式横向移动以使不同的分子与纳米孔接合并且使得它们可以被测序。
在本公开的一些实施方式中，扫描板表面可以用微点或微片图案化以用于靶分子附着，并且这些微图案与纳米孔阵列芯片上的纳米孔精确对准。每个点对应于纳米孔芯片上的一个纳米孔。每个点可以包含多个靶分子。在每次测序运行之后，将已测序的分子从纳米孔中拉出，并且扫描板或纳米孔芯片以扫描模式横向移动以对准另一个进入纳米孔待测序的靶分子。因此，最终，全部或大部分的靶分子可以被测序。
在本公开的一些实施方式中，具有尖端或平端的微柱体被附着或微制造到面向纳米孔基板的扫描板表面上。靶分子直接地附着于这些微柱体的末端或通过接头分子或通过磁珠附着于这些微柱体的末端。这些柱体与纳米孔芯片上的纳米孔对准。靶分子在扫描板或纳米孔芯片板的受控移动下被测序。
在另一个实施方式中，靶分子(例如ssdna片段)通过具有适当选择的长度和组成的相同类型的接头分子(例如天然或合成的ssdna)附着于磁珠。电力拉动带电荷的靶分子穿过纳米孔，直到其进程被磁珠停止，所述磁珠太大而不能穿过纳米孔。通过施加磁场，可以将磁珠和附着的dna分子从纳米孔拉离并拉向位于纳米孔附近的容器壁的表面，所述容器壁的表面与纳米孔的距离与接头分子和所结合的靶分子相比是足够大的。通过单独控制作用于珠和靶dna分子的力(即磁场强度和纳米孔的电力)的平衡，可以以对于碱基传感足够慢的速度拉出dna分子。
从dna运动的初始保持恒定的力平衡是至关重要的，以便dna可以以期望的、可预测的速度运动。这可以通过在dna接近或接触纳米孔入口时完全消除或最小化作用于磁珠的粘附力而完成。粘附力的主要来源来自于珠上的电荷。通过使磁珠不带电荷，粘附力可以大幅降低，并且可以保持dna分子穿过孔的相对平稳的运动。随着珠运动，靶分子将在力的作用下被拉伸，并且将产生分子内张力。当靶分子以受控的速度通过纳米孔时，建立并保持力平衡。因此，靶分子不会自由地运动通过纳米孔，而是随着其进程在相反的力产生的张力下保持拉紧。当靶分子穿过纳米孔时，其碱基被适当的碱基传感方法传感和记录。可以使用相同类型的接头分子作为靶分子测序的校准。接头分子的另一个功能是提供缓冲区，以便可以减少或减弱在开始时dna运动任何可能的抖动。多个靶分子可以用单个纳米孔或多个纳米孔测序。
在本公开的一些实施方式中，对于磁力控制的dna运动，引入接头结作为接头分子与靶分子之间的连接。接头结通常比纳米孔入口大，在一些实施方式中，是纳米孔入口的至少两倍大，以便当dna在偏压下通过纳米孔易位时，其将起到止动器或制动器的作用。由于目前接头节位于纳米孔处，因此它需要是不带电荷的，而磁珠不需要是不带电荷的。接头结可以是大的蛋白质，例如抗体、中性亲和素、链霉亲和素、或大于纳米孔入口的任何聚合物复合体、或甚至是非磁性珠。
在本公开的另一个实施方式中，对于机械控制运动或磁力控制运动方法，靶分子可以在不使用接头分子的情况下直接附着于磁珠或扫描板。
实施方式是用于控制带电荷的线性分子的移动的系统，所述系统包括位于顺式空间(cisspace)和反式空间(transspace)之间的基板；所述基板中的纳米孔，所述带电荷的线性分子的至少一部分可以从顺式空间穿过所述纳米孔到反式空间；位于顺式空间中的扫描板，所述带电荷的线性分子的第一端直接或间接附着于所述扫描板；用于控制基板和扫描板之间的距离使得它们可以以纳米精度移动的致动器；以及用于在顺式空间和反式空间之间施加偏压以引导所述带电荷的线性分子的第二端进入纳米孔的偏压源。在另一个实施方式中，所述系统包括附着体系，所述附着体系帮助带电荷的线性分子附着于扫描板，使得所述带电荷的线性分子可以随扫描板一起移动。在另一个实施方式中，基板是纳米孔芯片，其包括以平面排列定位的多个纳米孔，其中每个纳米孔与扫描板的表面基本等距。在另一个实施方式中，纳米孔包括生物孔、或合成孔、或其组合。在实施方式中，生物孔选自由α-溶血素孔、mspa孔、csgg孔、其经修饰的变体、及其组合构成的组。在实施方式中，合成孔由氮化硅(si3n4)、二氧化硅(sio2)、氧化铝(al2o3)、氮化硼(bn)、石墨烯、二硫化钼(mos2)或其聚合物或其混合物制得。在实施方式中，附着体系包括化学键，其是共价的或非共价的，可逆的或不可逆的。在实施方式中，化学键选自包括生物素-链霉亲和素键、酰胺键、磷酸二酯键、酯键、二硫键、亚胺键、醛键、氢键、疏水键、及其组合的列表。在实施方式中，附着体系包括附着于带电荷的线性分子的第一端的磁珠，并且磁珠由以下材料中的一种制得：(a)顺磁体，(b)超顺磁体，(c)铁磁体，或(d)反磁性体。在实施方式中，可控磁体包括电磁体、可调永磁体、磁体组、或其组合，其中可控磁体被配置为将磁珠吸向扫描板并将磁珠保持在扫描板上。在实施方式中，附着体系包括柔性接头分子，并且柔性接头分子一端附着于带电荷的线性分子的第一端并且另一端附着于扫描板。在实施方式中，柔性接头分子选自由天然的、经修饰的或合成的单链核酸，天然的、经修饰的或合成的双链核酸，天然的、经修饰的或合成的多肽链，天然的、经修饰的或合成的纤维素纤维或天然的、经修饰的或合成的任何柔性线性聚合物，及其组合构成的组。在实施方式中，柔性接头分子是与带电荷的线性分子相同种类的分子。在实施方式中，附着体系还包括设在柔性接头分子和带电荷的线性分子之间的接头结；并且其中所述接头结被配置为阻止接头分子进入纳米孔。在实施方式中，接头结是选自由抗体、酶、中性亲和素、链霉亲和素和亲和素构成的组的蛋白质，或聚合物复合体，或颗粒或珠，或其组合。在实施方式中，柔性接头分子被设在带电荷的线性分子和磁珠之间。在实施方式中，柔性接头分子是选自由天然的、经修饰的或合成的单链核酸，天然的、经修饰的或合成的双链核酸，天然的、经修饰的或合成的多肽链，天然的、经修饰的或合成的纤维素纤维或天然的、经修饰的或合成的任何柔性线性聚合物，及其组合构成的组。在实施方式中，柔性接头分子是与带电荷的线性分子相同种类的分子。在实施方式中，附着体系还包括设在柔性接头分子和带电荷的线性分子之间的接头结；并且其中所述接头结被配置为阻止接头分子进入纳米孔。在实施方式中，接头结是选自由抗体、酶、中性亲和素、链霉亲和素、亲和素构成的组的蛋白质，聚合物复合体，颗粒，非磁性珠，及其组合。在实施方式中，系统包括用于在带电荷的线性分子穿过纳米孔时测定其单个碱基单元的特性或特征的检测器，其中带电荷的线性分子的碱基单元可以通过它们对离子电流阻断、或识别隧穿、或场效应晶体管、或其他碱基传感方法、或其组合的作用来检测。在实施方式中，系统包括附着或微制造到扫描板上的、具有尖端或平底端的微柱体，其被配置为允许带电荷的线性分子的第一端的附着。在实施方式中，微柱体是扫描板上的微柱体阵列，其横向定位以与基板上的纳米孔阵列相匹配。在实施方式中，致动器包括精密线性移动台，其被配置为控制扫描板和基板之间的距离，使得带电荷的线性分子可以以稳定的速度被拉出或插入到纳米孔中，该稳定的速度使得精确的碱基单元测序成为可能。在实施方式中，所述速度是每个碱基单元约0.5ms或更慢。在实施方式中，所述速度是每个碱基单元约3ms至约20ms。在实施方式中，精密线性移动台包括具有纳米或亚纳米精度的、由压电效应驱动器驱动的线性台。在实施方式中，致动器包括通过机械减速装置联接到扫描板或基板的粗精度致动器，从而允许扫描板或基板的纳米或亚纳米精度移动。在实施方式中，粗精度致动器包括微米或亚微米伺服电机。在实施方式中，系统还包括联接到扫描板或基板的、具有微米精度的调整台，其被配置为横向地和/或竖向地移动对象以用于预测序位置调整。在实施方式中，多个带电荷的线性分子随机附着于扫描板。在实施方式中，多个带电荷的线性分子附着于扫描板上的图案化区域，其中图案化区域中的多个带电荷的线性分子与基板上的多个纳米孔横向对准。在实施方式中，系统还包括次可调磁体，其被配置为从扫描板移除磁珠。在实施方式中，带电荷的线性分子是核酸序列或多肽序列；其中核酸序列选自由单链dna、双链dna、单链rna、寡核苷酸、包含经修饰的核苷酸的序列、及其组合构成的列表。
实施方式是用于控制带电荷的线性分子移动的方法，包括：提供基本上平行放置并且彼此横向对准的扫描板和基板；直接或间接地将带电荷的线性分子的第一端附着于扫描板；通过可调机械装置使带电荷的线性分子与基板中的纳米孔对准；通过电力将带电荷的线性分子的第二端引导至基板中的纳米孔；通过调节扫描板和基板之间的距离使带电荷的线性分子移动穿过纳米孔；通过在测序过程中调节电力保持带电荷的线性分子中的分子内张力。在实施方式中，可调机械装置包括具有微米或亚微米精度的单轴或多轴线性台。在实施方式中，调节扫描板和基板之间的距离包括用致动器移动扫描板和/或基板。在实施方式中，致动器包括具有纳米或亚纳米精度的、由压电效应驱动器驱动的线性台。在实施方式中，致动器包括通过机械减速装置联接到扫描板或基板的粗精度致动器，其提供扫描板或基板的纳米或亚纳米精度移动。在实施方式中，粗精度致动器包括微米或亚微米精度伺服仪。在实施方式中，电力是通过电偏压装置得到的，所述电偏压装置被配置为跨基板施加偏压从而允许电流通过纳米孔，并且还被配置为将带电荷的线性分子拉过纳米孔。在实施方式中，柔性接头分子被设在带电荷的线性分子和扫描板之间；其中所述柔性接头分子选自由天然的、经修饰的或合成的单链核酸，天然的、经修饰的或合成的双链核酸，天然的、经修饰的或合成的多肽链，天然的、经修饰的或合成的纤维素纤维或天然的、经修饰的或合成的任何柔性线性聚合物，及其组合构成的列表。在实施方式中，接头结被设在接头分子和带电荷的线性分子之间，接头结被配置为阻止接头分子进入纳米孔，其中接头结是选自由抗体、酶、中性亲和素、链霉亲和素和亲和素构成的列表的蛋白质，或聚合物复合体或颗粒或珠，其一部分，及其组合。在实施方式中，方法还包括将带电荷的线性分子的第一端附着于磁珠，其中磁珠选自由超顺磁珠、顺磁珠、铁磁珠和反磁性珠构成的列表；通过施加磁场使带电荷的线性分子与纳米孔对准以朝向扫描板吸引磁珠，同时电力维持带电荷的线性分子与纳米孔的接合；其中磁场来自电磁体或可调永磁体，或磁体组，或其组合；其中磁珠接触与纳米孔上方基本正交对准的扫描板的表面，并且通过磁场紧紧保持在扫描板上，使得磁珠和带电荷的线性分子基本与扫描板一起移动。在实施方式中，柔性接头分子被设在带电荷的线性分子和磁珠之间；其中柔性接头分子选自由天然的、经修饰的或合成的单链核酸，天然的、经修饰的或合成的双链核酸，天然的、经修饰的或合成的多肽链，天然的、经修饰的或合成的纤维素纤维或天然的、经修饰的或合成的任何柔性线性聚合物，及其组合构成的列表。在实施方式中，接头结被设在接头分子和带电荷的线性分子之间，并且接头结被配置为阻止接头分子进入纳米孔；并且其中接头结是选自由抗体、酶、中性亲和素、链霉亲和素和亲和素构成的列表的蛋白质，或聚合物复合体或非磁性颗粒/珠，或其组合；并且其中使带电荷的线性分子与基板中的纳米孔对准还包括将扫描板与基板之间的距离设定为大于接头分子的长度；施加磁场，使得磁珠上的磁力足以提升磁珠，但不足以基本上提升接头节；其中接头结通过电力在纳米孔处接合，将扫描板和基板之间的距离缩小为小于接头分子的长度；其中磁珠接触扫描板并由在纳米孔上方基本正交对准的扫描板保持，导致珠、接头分子和带电荷的线性分子之间的基本正交对准。在实施方式中，带电荷的线性分子直接或间接附着地、随机分布在扫描板上。在实施方式中，多个带电荷的线性分子直接附着或间接附着地、分布在扫描板上的图案化区域中，其中扫描板上的图案化区域中的多个带电荷的线性分子与基板上的多个纳米孔基本上横向对准。在实施方式中，基板是纳米孔芯片，其包括以平面排列定位的多个纳米孔，使得每个纳米孔与扫描板的表面基本等距。在实施方式中，扫描板具有面向纳米孔的、具有尖端或平端的微柱体；其中带电荷的线性分子的第一端直接或间接附着于微柱体。在实施方式中，扫描板具有与基板上的纳米孔阵列相匹配的微柱体阵列。在实施方式中，带电荷的线性分子是核酸序列或多肽序列；其中核酸序列选自由单链dna、双链dna、单链rna、寡核苷酸、包含经修饰的核苷酸的序列、及其组合构成的列表。
附图说明
图1示出本公开的简化实施方案，其中dna片段附着于穿过纳米孔并跨越纳米孔芯片和扫描板之间的间隔的接头分子。
图2示出其中扫描板和纳米孔芯片被压缩元件分开的子组件。所述子组件显示在刚性框架内，其包括可以将扫描板和纳米孔芯片推近的精密分析致动器。
图3示出具有单独弹簧和密封件的替换动态腔子组件。
图4示出使用精密台将扫描板和纳米孔芯片刚性地连接在一起的选择，其包括粗调整台和单独的精密分析台以及刚性框架部件。
图5显示合成纳米孔和生物纳米孔的类型。
图6显示具有限制性开口和集成碱基传感电子元件的纳米孔设计。限制性开口只允许一个dna分子进入孔，防止两个或多个dna拷贝同时进入孔。限制性开口可以是尺寸限制结构，或者通过化学限制、或电限制或磁限制或它们的组合而形成。
图7显示不同的孔阵列或纳米孔芯片配置。
图8显示扫描板表面上的dna附着：(a)随机分布和(b)图案化附着区域。
图9示出dna附着于微柱体(a)尖微柱体，显示使用柔性接头分子补偿dna-孔未对准，和(b)平底微柱体，使用多个dna附着以最小化横向未对准。
图10显示不同的顺式和反式电极以及微柱体设置。
图11示出分段重复测序方案。
图12示出使用磁珠的自动dna对准。
图13显示用于自动对准的dna样品制备的示例。
图14显示使用接头分子和接头结珠的自动dna-纳米孔对准。
图15显示使用ssdna接头的自动dna-纳米孔对准。
图16显示使用平底微柱体的自动单个dna-纳米孔对准。
图17显示用作接头分子的经修饰的dsλ-dna。
图18显示用作接头分子的ssλ-dna的制备过程。
图19显示制备不带电荷的磁珠的反应。
图20显示通过限制连接中心上的结合位点，与单个接头分子连接的单拷贝dna(在有或没有珠的情况下)：(a)两个结合位点与单个连接接头；(b)三个结合位点与两个连接接头；和(c)四个结合位点与三个连接接头。
图21显示用作接头分子的双链和单链dna(dsdna和ssdna)，其通过以下将磁珠与单个测序dna连接：(a)具有两个结合位点的二价链霉亲和素或其他蛋白质，(b)具有三个结合位点的抗体或其他蛋白质，以及(c)具有四个结合位点的链霉亲和素或中性亲和素或其他蛋白质。
图22显示通过乳化液滴法附着于珠上的dna分子或接头分子。
图23显示dna穿过纳米孔运动的磁性控制。
图24显示使用不同接头分子的dna穿过纳米孔运动的磁性控制。
具体实施方式
第i部分：dna和其他生物分子穿过纳米孔的机械控制
本公开提供通过机械装置精确控制分子、例如dna穿过纳米孔运动的方法，或更具体地，通过纳米(nm)或亚纳米(亚nm)精度压电驱动器或驱动器的组合精确控制分子、例如dna穿过纳米孔运动的方法。结合电力，根据所选的碱基传感方法，其使dna以对于可靠的碱基传感充分的或足够慢的速度连续或逐步地移入和移出纳米孔。例如：使用蛋白质纳米孔的离子电流阻断碱基传感方法需要每个碱基至少1ms(毫秒)的传感时间。
基本原理-力的平衡
基本原理如图1所示，其使用单链dna(ssdna)作为示例。
纳米孔(500)是纳米孔芯片(501)的一部分。扫描板(510)平行于纳米孔芯片安装。纳米孔芯片和扫描板都联接到分析台(570)，分析台(570)可以控制它们的间距(571)。分析台是适当选择的自动精密线性移动台。纳米孔芯片机械地将缓冲液体积(buffervolume)分成纳米孔相对侧上的顺式缓冲液体积(650)和反式缓冲液体积(651)。顺式缓冲液体积和反式缓冲液体积被纳米孔基板流体地和电地隔离，仅通过纳米孔的通道连通。电偏压源(530)维持跨纳米孔的电压。
在测序期间，被分析的dna分子(600)通过穿过纳米孔而跨越顺式缓冲液体积和反式缓冲液体积。在纳米孔的顺式侧上，dna连接到柔性接头分子(602)，该柔性接头分子附着于扫描板(510)。在后面的部分中将进一步讨论接头与dna的附着物(即接头结)(601)以及接头与扫描板的附着物(610)。
由于dna带负电荷，因此纳米孔内的强电场将其拉过纳米孔至反式侧。当顺式侧的dna减少时，dna和柔性接头分子在扫描板和纳米孔之间都被拉紧。接头和dna在张力下稍微拉伸，dna碱基继续穿到纳米孔的反式侧，直到拉伸的dna的张力与作用在dna碱基上的电力相匹配。该平衡张力取决于偏压，并且对应于dna碱基的特定拉伸间距。如果纳米孔和扫描板彼此移近或移远，dna中的张力也将(略微)发生变化，使dna运动到恢复平衡状态。假如分开速度是适当且恒定的，dna将在其运动时保持在恒定张力下。dna可以被拉出纳米孔，或插入到纳米孔中。因此，在不改变纳米孔偏压极性或大小的情况下，dna可以在任一方向被测序。
维持一定水平的张力是精确测序所需要的：
●当dna在张力下被拉伸时－当其是拉紧时，dna通过纳米孔的速度是更好控制的。
●将dna保持在一定水平的张力下减少了由于布朗运动的运动抖动。根据lu等人(2011)，当dna自由穿过纳米孔时，布朗力大约是4kbt/a。这里kb是玻兹曼常数，t是以开尔文计的缓冲液温度，a是dna碱基对间距。对于ssdna，当充分拉伸时，a为约0.7nm。在室温下(约22℃)，布朗力可以达到约23pn。然而，当dna在纳米孔被夹住(在张力下拉伸)时(lu等人，2015)，布朗力是大约kbt/ls，其中ls是dna的库恩长度。对于ssdna，ls为约1.5nm。因此，当ssdna用纳米孔作为横向限制在张力下拉伸时，作用于碱基传感的布朗力是约3pn。为了得到准确的碱基传感，纳米孔电力(＝dna内部张力)应该远大于3pn，例如大10倍。越大越好，但小于dna附着的结合力。
运动控制选择和考虑
如上文所述，dna穿过纳米孔的受控运动由纳米孔和扫描板之间的间距(571)决定。间距的控制是通过最小化这些元件之间的振动和通过使用具有足够精密运动控制的分析台而实现的。
振动控制通过以下几种方式实现：
●纳米孔和扫描板之间的机械路径应该是尽可能短的。可以使用紧凑型组件。
●纳米孔和扫描板之间的机械连接应该是尽可能硬性的或刚性的。这意味着部件是由硬的和厚的材料制得的。
●该机构应该与外部振动和噪音隔离。可以采用类似于在原子力显微法和干涉法中使用的标准的无源和有源防振方法。
分析台(570)具有一些要求：
●致动必须是硬性的或刚性的-它不能折中上文列出的振动控制措施。
●它必须具有足够的精度-例如对于dna碱基传感具有从约0.1nm至约1nm的亚纳米(亚nm)分辨率，或对于具有较大碱基单元间距的分子具有从1nm至10nm的纳米分辨率。
满足这些技术规范的机构是压电驱动器(替换地称为压电台、压电堆、压电致动器或压电变换器)。压电装置是非常硬性的，具有必需的精度，并且在没有振动的情况下移动。
替换的机构也可以是合适的。一些可能的选择包括较不精密的致动器，其与机械减速装置(即杠杆)组合以实现必需的精度。可以想到地，如果振动可以被最小化，伺服驱动的致动器可以起作用。压电线性电机也可以起作用，如果它们被控制以消除振动。
在台移动中所需的精度当然是目前的技术可达到的。纳米精度压电驱动器的实例可以在扫描隧道显微镜(stm)和原子力显微镜(afm)中找到，其广泛用于生物微结构分析。king和golovchenko(2005)证明，他们可以使用afm针尖将长105nm直径5nm的纳米管穿过纳米孔。他们可以以约800nm/s的速度将纳米管移入和移出纳米孔，并且测量离子电流的变化。考虑到单链dna的单元长度是0.7nm，这等于每个碱基约1ms。
可商购的纳米精度压电驱动器的另一实例是physikinstrumentgmbh&co.的p-62x系列精密z台，其具有0.1nm至1nm的精度，定位准确度为0.02％，行程为50μm至400μm。在合适的负载和工作频率下，它可以容易地实现每个碱基1ms至10ms的速度，对于碱基传感是足够慢的，但对于快速dna测序是足够快的。例如，100kb的dna链可以在约8分钟内被测序，通量为每个碱基5ms。
动态腔-最小化机械路径长度
最小化振动的一种方法是将纳米孔和扫描板组装成紧凑型子组件(579)，例如在图2中示意性地绘出的。扫描板(510)和纳米孔芯片(501)通过将它们推开的压缩元件(576)的向外弹力(由大的垂直箭头表示)保持分开。压缩元件(576)还可以在腔周围提供液封或可以使用独立的内部密封件。如果包括独立的密封件，那么压缩元件(576)可以是非密封型，例如波形弹簧或挠性安装件。
在所示的布局中，纳米孔芯片结合到刚性框架(575)，该刚性框架(575)限制扫描板的移动并决定其松弛位置(即距纳米孔芯片的最大间距)。通过使用联接到刚性框架(590)的分析致动器(591)一起挤压子组件(579)，扫描板可以朝纳米孔移动，所述刚性框架(590)包围所述子组件(579)。
该设计通过缩小扫描板和纳米孔芯片之间的距离而缩短机械路径。虽然压缩元件(576)可以被垂直挤压，它可以被选择为需要相当大的力以使其作为强联接器。压缩元件也可以是强非各向同性的，意思是虽然它可以被垂直挤压，但它可以强烈地抵抗横向剪切变形(即它可以在横向上是非常硬性的)。压缩元件还可以具有阻尼特性或被安装为平行于进一步减小振动的阻尼元件。
图2还示出将扫描板和纳米孔合并在紧凑型子组件的主要原理。该概念可以通过多种方式实施：
一个实施方式公开了子组件，其中扫描板和纳米孔在子组件是静止时被压在一起或彼此接近，并且当子组件被外部分析致动器启动时被拉开。该实施可以是有利的，因为它允许所制造的子组件具有基本平行的扫描板和纳米孔芯片，并且当子组件处于其静止状态时(即没有外部地启动)通过预定的最小距离被分开(例如使用微米垫片或贴片)。程序上这是便于测序的。这在后面的部分中讨论。
当制作该子组件时，考虑“压缩形变”或更通常的“非弹性变形”是重要的。在一些实施方式中，可变形材料、例如具有恢复力(即弹力)的橡胶可以缩小，如果它们被压缩或拉伸较长时间。为了管理“形变”的作用，最好将子组件设计成使得与在储存期间相比，在操作条件期间的移动元件远没有平衡。替换地，可以选择不退化的材料，例如弹簧钢。
在图2中，压缩元件表现既作为弹簧，又作为将顺式缓冲液限制在纳米孔上的密封件。这些功能可以是分开的，例如使用在纳米孔芯片(501)和扫描板(510)之间形成腔的周边壁的独立的柔性密封件和单独的腔外的压缩弹簧，其提供向外的力(见图3)。可以使用当从静止位置向外延伸时提供恢复力的元件，例如拉伸弹簧。可以使用当从静止位置弯曲时提供恢复力的元件，例如片簧。在张力下或弯曲时拉伸的密封件也可以提供恢复力。图3提供了替换选择中的一种。在图3所示的动态腔子组件具有单独的密封元件(578)和弹簧元件(577)。通过拆分这些功能，弹簧力可以大幅增加而不会冒险失去压缩元件的弹性，即非弹性变形/压缩形变。扫描板(510)的底表面(515)相对于扫描板安装件(516)的分离垫片(517)的底表面是凹入的。这防止了与纳米孔芯片(501)接触。在一些实施方式中，每个纳米孔(500)在反式侧具有隔离阱(509)。
在图2和图3中，未示出用于与外部流体贮液器流体连通或缓冲液交换的入口和出口，但它们通过在纳米孔芯片子组件或扫描板子组件上添加通道或开口可以容易地实现。
用于对准和扫描的附加台
除了dna测序所需的分析台/分析致动器运动，扫描板和纳米孔芯片可能需要调整它们的相对位置。这些调整可以是样品装载所需的，或是扩展分析台移动所需的。它们也可以是实施在后面的部分中描述的某些测序方案所需的。
图4示出除了控制间距(571)的精密分析台(572)包括调整台(573)的基本思路。这些台刚性地联接到扫描板(510)和纳米孔芯片(501)。它们每个都联接到共同的刚性框架(574)。应当注意的是，该图仅示出台和框架的安装选择。替代性的实施方式包括会避免扫描板和纳米孔芯片的悬臂式安装设置的功能性设计，这将最小化振动。
用于调整等的附加台不一定需要如分析台的相同精度。具有较粗精度移动(即μm精度)的台可以是足够的，并且可以提供较长范围的移动。这些台不需要如图中所示的一起实施。例如，x轴和y轴可以以相对于刚性框架(574)移动纳米孔芯片(501)而实施，z轴可以以相对于刚性框架(574)移动分析台(以及因此的扫描板)而实施。另外，由于只有扫描板和纳米孔芯片的相对分离是必要的，分析台也可以在纳米孔芯片上实施。
还应该注意的是，虽然示图显示水平方向的纳米孔芯片表面，但该常规是用于容易理解而不是要求。一些实施方式可以垂直地、以中间斜角地、或甚至反转地定位纳米孔芯片表面和扫描板，并且相应地定位台的移动。
以上段落解释了调整扫描板和纳米孔芯片的相对位置的灵活性。重要的是要记住，不应该妥协组件的机械硬性/刚性。可以去除不必要的调整台，其否则将机械路径从纳米孔芯片延伸到扫描板。
位置校准
在对准过程期间，扫描板必须非常靠近纳米孔芯片。在进行测序过程之前，校准分析台或致动器的位置会是有必要的，使得最小间距和坐标是已知的，即在定位系统驱动器中的数值位置，其对应于扫描板和纳米孔芯片表面之间的最近接触。位置应该是已知的，其具有几微米的精确度。
校准可以通过几种方法进行：
光学-这种类型的校准需要窗口或光程，其允许观察和测量扫描板和纳米孔之间的间隔。
电接触-这种类型的校准需要扫描板和纳米孔芯片充满流体，并且需要扫描板和纳米孔芯片中的每个的一些部分由导电材料制得。这些导体可以干扰测序测量。如果制造是足够精密的，一个或多个电接触点可以在密封隔离缓冲液的位置制得。
力-分析台缓慢地将扫描板和纳米孔芯片彼此靠近。灵敏的力传感器测定它们何时接触。替代地，扫描板或纳米孔芯片或两者上的已知高度的凸起件进行第一次接触以避免对dna板或纳米孔芯片的可能损害。这是实际的解决方案，因为力传感器可以被添加到机械致动器，不需要进一步改变板或纳米孔或接入要求。力传感器布局可以被设计成使得最小的力被施加到纳米孔芯片和扫描板。
分离反馈-假定纳米孔芯片和扫描板在子组件中在没有表面接触(例如上文描述的“凸起件”)的情况下被推近。这可以通过在组件中的被动弹性元件而实现，例如在图2和图3中。分析台可以被配置为拉开子组件，其中纳米孔芯片和扫描板在松弛状态下被压在一起。位置反馈可以在测序过程的某些步骤由碱基传感而产生。因为它表明开始将dna拉出纳米孔所需的分析台位置，因此这将被认为是“功能性反馈”。电接触或力测量也可以用作分析台如何接触子组件的反馈。
传感器几何结构和阵列
本公开中描述的用于精确机械控制dna易位穿过纳米孔的方法没有限制地适用于任何类型的纳米孔、合成纳米孔(图5a，例如si3n4孔、石墨烯孔、mos2(二硫化钼)孔和任何其他固态纳米孔)、或生物纳米孔(图5，b和c，例如α-溶血素孔和mspa孔)、或者甚至合成孔和生物孔的组合。纳米孔可以具有与合成孔(图6a和图b)或生物孔(图6c)的集成碱基传感装置。碱基传感装置在纳米孔处的基板中(图6a)或在纳米孔周边的基板中(图6b)。
本公开中提及的纳米孔芯片可以包含单个孔或多个孔或孔阵列。芯片上的纳米孔的图案可以是任何形状，例如正方形、矩形、线性、拉长的矩形、分割的矩形、圆形、椭圆形或环形，参见图7(i)至图7(iii)。适当的图案将取决于实际考虑，例如制造方法、流体流动和来自周边的电连接。
某些碱基传感方法、例如离子电流传感需要跨越纳米孔的电测量(即一个电极位于纳米孔的反式侧，一个电极位于纳米孔的顺式侧)。为了对多个纳米孔进行这些测量，可能有必要将每个纳米孔的至少一侧上的电触点周围的缓冲液与所有其他纳米孔电隔离。图7示出纳米孔任一侧上的共同阱和隔离阱的这些各种排列。如果电隔离是碱基传感方法的要求，那么可能的排列是具有共同的顺式阱和包含隔离的缓冲液和传感电极的隔离反式阱(图7c)。这可以用充满缓冲液的隔离反式阱和从共同顺式阱引入的样品dna而制造。
图案化的dna附着
在实施方式中，在有或没有接头分子的情况下，可以将dna分子附着于扫描板。最简单的方法是将dna随机附着于扫描板表面上(图8a)，然后以用于重复测序的区域扫描模式横向移动扫描板或纳米孔基板。由于缓冲阱制造和电测量的分离要求，纳米孔芯片上的纳米孔不能排列得太近。纳米孔应该相对于彼此充分间隔，使得它们彼此不干扰。在实施方式中，纳米孔间距为超过100μm或甚至超过1mm，每个测序循环的扫描间距为几μm或更小，为了使所有靶dna分子被测序，可能花费太多时间以扫描纳米孔之间的空间。作为该问题的解决方案，对应于纳米孔阵列芯片上的每个纳米孔，dna分子可以仅附着于非常小的图案化区域(511)，例如几μm或更小，参见图8b。这样，扫描区域减少，所有或大部分dna分子的测序可以在更短的时间内完成。图案化附着会需要图案化区域和纳米孔之间的精确对准(精确度μm)。这可以用目前的制造和仪器容易地完成。
微柱体-如果有必要
尽管使用平扫描板是示例性实施方式，但是阱和dna附着物的一些配置需要在扫描板上包括微柱体(图9和图10)。微柱体(512，513)是从扫描板突出并且与纳米孔的间隔和横向排列(图案)相匹配的延伸部。它们可以通过附着物或形成为扫描板的连续部分或通过各种微制造手段而制成。微柱体将dna的附着(或接触)位置从扫描板向外延伸。这样做是由于几个原因：
●微柱体可以通过在dna附着位点上方增加空隙而提供更大的流体流动路径。当扫描板和纳米孔芯片靠近并且dna附着位点和纳米孔芯片之间的空间受限时，这会是重要的。增加流体路径降低流体流速并且减少在近间距运动期间产生的压力。
●微柱体提供与dna附着位点更好的流体接触。如果微柱体的尖端相对较窄，则dna附着位点将经历更多流动。微柱体还增加了横向流动的障碍，这有助于促进混合。
●将dna附着置于微柱体的尖端使得更集中的dna附着。这可以使测序过程更有效率，因为它可以使得dna更容易地与纳米孔接合。
●如果隔离阱包含在纳米孔的顺式侧，则微柱体可以将dna附着延伸到充满缓冲液的单个阱中，同时保持电隔离(图10b和图10d)。这要求每个微柱体与另一个微柱体电隔离。这可以与置于微柱体内的电探针结合以传感运动穿过相应纳米孔的dna，如图10d所示(514，535)。在这些排列中，纳米孔阵列的顺式侧被分成电隔离阱(653)。
根据所需的功能，微柱体可以是矮的或高的。根据附着方法，附着物表面可以是圆的或平的。在后面的部分中讨论用于附着dna的不同方法。
微柱体需要精确对准于相应的纳米孔。这可以通过精确制造的子组件或通过使用与来自纳米孔传感器的反馈结合的机动化横向调整驱动器而实现。
附着于微柱体的dna链的数量很大程度上取决于决定dna附着区域的制造方法。根据所期望的测序方法，该区域的大小可以为单链至数百或更多的任何数量的dna链。在进行附着时，dna的密度还受溶液中dna浓度的影响。
制备和测序过程
概述
出于讨论的目的，测序过程可以分为两个阶段：
接合dna：使dna的自由端足够接近纳米孔，使得它可以在纳米孔中接合或插入(例如通过电场力被吸入到纳米孔中)。
测序：将dna缓慢拉过纳米孔，同时从传感器记录。如有必要，反转方向并重复。
取决于扫描板的几何结构、dna在扫描板上的空间分布、在dna及其与扫描板或微柱体的附着物之间存在或不存在柔性接头分子，接合dna阶段具有几个显著变化。
接合dna-使用柔性接头
通过在一端添加柔性接头分子并将接头分子附着于扫描板或附着于微柱体可以使dna伸长。该实施方式允许在对dna的整个长度测序时，在扫描板上的附着位置与纳米孔位置之间存在一定程度的未对准。它还允许当扫描板和纳米孔芯片不接触时dna与纳米孔接合。
图1示出接头分子与扫描板和纳米孔芯片的关系。接头分子(602)可以是任何线性分子或分子复合体，例如纤维素纤维、长的多肽链或寡核苷酸或细菌/病毒dna/rna、或线性聚合物链。实施方式具有约10微米(μm)至约50微米的长度。另一个示例性的长度是约5μm至约100μm。另一个示例性的长度是约5μm至约1000μm。λ-dna(从λ噬菌体分离的)是接头分子的实例。它有48.5千碱基。当充分伸长(笔直拉而不拉伸)时，它是约34μm长(单链)或16μm长(双链)，是用作接头分子的完美长度。
扫描附着物(610)是dna或接头分子直接与扫描板(510)或微柱体的附着物。
接头结(601)是dna链(600)和柔性接头分子(602)之间连接的位置。它可以是蛋白质，例如链霉亲和素或中性亲和素或抗体，或非磁性珠，或当靶dna连接到接头λ-dna时，它仅仅是化学键，例如磷酸二酯键。
尽管永久附着是可接受的，但dna/接头附着于扫描板(610)也可以是可逆的非共价键，例如生物素-链霉亲和素耦合，或在某些缓冲液条件或催化剂下是可断裂的共价键，使得测序可以通过使测序的dna脱离并且重新附着新的dna而重复。生物素-链霉亲和素键非常强，具有足够的强度以在测序期间将dna保持在扫描板上，然而，通过在70℃以上的温度下在非离子水溶液中温育短的时间，其是可逆的(holmberg等人，2005)。共价键通常远强于非共价键。可逆共价键的实例是在羧酸和胺之间形成的酰胺键。对于dna的附着，可以用羧酸官能化扫描板表面，并通过酰胺键将胺修饰的dna或接头分子附着于表面。当后期需要去除测序的dna时，通过在强酸(例如hcl)或强碱(例如naoh)下水解可以破坏酰胺键。在羧基和羟基之间形成的酯键表现相同，其可以被强酸和碱以及温度破坏。在singh等人(2011)和sassolas等人(2008)的综述文章，liu和rauch(2003)和fixe等人(2004)的文章，以及一些生物技术公司、例如thermofisherscientific和integrateddnatechnologies的网站中，可以找到关于dna或蛋白质附着于固体表面的其他方法，所述固体表面是金属、玻璃或塑料。
接合dna-横向对准以与dna沉积图案相匹配
扫描板和纳米孔芯片表面基本上彼此平行。这些dna附着表面(即扫描板、平微柱体的表面、或尖微柱体的尖端)必须靠近，通常在几微米以内，以使dna具有足够的距离以在纳米孔中接合。为了优化等原因，dna可以以各种图案附着于扫描板。这些布局指定了扫描板相对于纳米孔芯片所需的横向定位(图8和图9示出这些布局中的一些)：
1)如果使用尖微柱体(512)，微柱体的尖端必须横向定位以在合理误差容忍度内与纳米孔阵列位置相匹配，在一些实施方式中，所述误差容忍度通常为从几纳米至几微米。所需的容忍度取决于可以补偿任何横向未对准的柔性接头(602)的长度。如果dna在没有接头的情况下直接附着于扫描板，则横向未对准取决于从测序中省略的样品dna的长度有多长是可接受的(图9a)。对于长dna片段，可接受的是省略数千个碱基。
2)dna附着可以被限制在扫描板上的位置图案上，其与纳米孔芯片上的纳米孔图案相匹配(图8b)。对于该“匹配图案”方法，在纳米孔可以通过柔性接头到达的限度内，横向位置必须将该dna图案与对应的纳米孔图案e对准。
如图9b中，如果使用平底微柱体(513)将dna附着于扫描板，则必须发生类似的接近对准。
3)dna附着可以均匀地跨扫描板完成(图8a)。对于扫描所有dna并最小化重复扫描，这可以是有用的方法。在与纳米孔直接对准的位置处的dna总是具有在纳米孔中接合的最大概率，因为它是最接近的。如果在记录每个dna序列之后，扫描板与纳米孔芯片的对准可以移动到新位置，则新位置处的dna有利于进入纳米孔。通过使用x和y横向调整系统地重新定位，可以覆盖x和y偏移的小区域。通过对具有对应于纳米孔阵列横向间距的尺寸的区域取样，扫描板上的所有dna可以以相等的概率被测序。
测序-缓冲液条件，偏压
在实施方式中，顺式贮液器和反式贮液器(650和651)通常充满导电盐缓冲液(例如1mkcl10mmhepes缓冲液，ph8)，见图1。实际使用的缓冲液的类型取决于待分析的分子、孔表面化学和碱基传感要求。在一些实施方式中，反式贮液器可能需要充满具有不同条件或组成的不同缓冲液，例如不同的ph或盐浓度，加入edta或矿物质、表面活性剂等。在一些实施方式中，反式贮液器可能需要充满凝胶或使得靶分子在不经化学修饰的情况下穿过的其他物质。纳米孔偏压(530)通过两个ag/agcl电极施加，所述电极放置在跨纳米孔芯片(501)的顺式贮液器和反式贮液器中。如果纳米孔芯片具有多个纳米孔，则一些碱基传感方法要求这些电极中的至少一个电极对每个纳米孔是特定的。缓冲液具有足够的离子含量以导电，但在某种程度上，来自纳米孔偏压的电场在纳米孔外部延伸以拉动附近的带电荷的dna。
一旦靶dna片段被接合在纳米孔中，则其可以如前文描述的移入和移出。当dna(600)易位穿过纳米孔并用适当的碱基传感方法记录时，dna(600)可以被测序，所述碱基传感方法例如离子电流阻断、识别隧穿或纳米线fet。
测序-分段重复测序方案
在一些实施方式中，为了达到所需的精确度，dna可能需要被多次测序。一般方案是通过几次将dna完全拉出纳米孔、然后将其插回纳米孔，记录整个dna的碱基传感。对于纳米孔阵列，不同长度的许多dna片段需要同时被测序。在每次测序运行期间，一些dna片段将比其他dna片段更快地完成。有时，在插入过程期间，一些dna可能不能进入孔中，错过测序的重复。
在此，我们引入分段重复测序方案，其保证每个dna片段将接收相同数量的重复记录，这在图11中示出。过程是：
1.从接合的并完全插入到纳米孔中的dna开始；
2.将待重复的dna的第一部分、例如1000个碱基拉出纳米孔；
3.将1000个碱基完全插回纳米孔中；
4.将dna的2000个碱基拉出。第一个1000个碱基已经穿过孔传感点三次，而第二个1000个碱基是待重复的新部分。
5.将新的1000个碱基部分插回孔中，然后将其与另外的1000个碱基一起拉出。
继续重复步骤5。如图11所示，将dna逐渐拉出至碱基位置1000、碱基位置2000、碱基位置3000、碱基位置4000等。过程继续，直至整个dna从纳米孔拉出，从而成为脱离的。在实施例(图11)中，dna样品为4600个碱基长，当dna被拉到位置5000时，过程终止。
当dna被拉出孔时和当其被插入到孔中时的两种方式都可以记录碱基传感。仅在拉出dna时记录对于数据分析可以是更方便的。在两个方向上可以使用相同的碱基传感方法，或者在插入期间可以使用不同的方法。在插入期间可以使用更快或更慢的速度，如果这导致碱基传感对比的有用变化，或者在没有碱基传感的情况下仅仅更快速地进行插入。
在实施例中，dna的每个部分被测序三次。当dna片段被完全拉出孔时，只有最后的部分被测序单次。dna片段的大多数被测序三次。如果需要更多重复，可以调整拉出长度和插入长度以记录每个部分更多次。可以有利的是插入几个额外的碱基，使得相邻的部分重叠以确保在边界处的碱基的充分重复记录。
第ii部分：dna和其他分子与纳米孔的自动对准
本公开还提供了通过使用可调磁体和磁珠使dna和纳米孔自动对准的方法。对准dna是指以基本上直线的方式将dna拉离纳米孔，垂直于纳米孔芯片的表面，并与分析台的移动方向一致。这将dna的末端置于(或将所附着的接头的末端置于)扫描板在分析台移动的方向与纳米孔直接一致的地方上，使得其从纳米孔笔直地拉出。dna的该对准保证了穿过纳米孔的经拉伸的dna的长度正好等于台移入或移出的距离。如果附着位置未对准，如在随机附着的dna的情况下，速度根据间距而变化，并且将dna结合或保持在扫描板上所需的力更大。
磁体
磁体的目的是将位于纳米孔顺式侧的dna或接头的末端拉向扫描板。因此，磁场必须在纳米孔芯片和扫描板之间的空间中起作用。如下面的公式给出的，作用在一定体积的磁性材料、例如磁珠上的磁体的力
对于强磁场，磁珠的磁化强度接近其饱和极限，不再与驱动磁场成正比。力公式可以简化为：
其中：
m饱和是饱和时的珠的磁化强度。
在实际应用中，这意味着磁场必须在扫描板和纳米孔芯片之间的间隙中是强的，以使磁珠磁化强度饱和，场必须具有朝向扫描板增加的强梯度。
该场条件可以通过将磁体直接放置在扫描板后面而实现，所述磁体具有朝向纳米孔芯片的磁极，如图12所示。磁体可以是电磁铁或永磁铁。通过改变驱动电流，可以容易地控制电磁体。间隙中的永磁体的场也可以通过使永磁体接近或远离扫描板而简单地增大或减小。永磁体可以具有非常强的磁场，特别是钕磁体(ndfeb磁体)。通过排列多个永磁体可以增强磁场强度和磁场梯度以形成和增强磁场，例如以halbach阵列。
磁珠
尽管对于对准过程有几种变化，但它们都使用了磁珠的一些变化。珠可以是超顺磁性的，即它们可以在磁场的存在下被磁化，但是当磁场被去除时，它们将失去它们的磁性。它们应该尽可能小且轻，以避免阻碍dna朝纳米孔运动，但足够大以防止珠进入纳米孔，并且具有足够的磁含量以产生足够的磁力以保持和移动靶dna分子。在一个实施方式中，尺寸范围是约200nm至3μm。在另一个实施方式中，尺寸范围是约50nm至约10μm。在一些实施方式中，尺寸范围是约10nm至50μm。所需的珠尺寸由所需的力的量决定。柔性接头分子可以通过共价键或非共价键附着于磁珠，类似于第i部分中描述的dna/接头分子附着于扫描板。
变化
对准可以用dna和磁珠的几种不同制备来进行：这些制备在图13中示出。在该图中，我们假定λ-dna(单链或双链)或类似的线性聚合物用作接头分子。
方法1：使用被停止的接头的对准
柔性接头分子(605)一端附着于磁珠(620)，并且通过增大的接头结(601)与样品dna(600)连接，所述接头结大于纳米孔入口，并且当dna易位穿过纳米孔时起到制动器或止动器的作用(图13a)。接头结指的是蛋白质或其它物质(603)，柔性接头分子通过其可以附着于样品dna。接头结可以是非磁性珠或大蛋白质复合体(例如抗体、中性亲和素、链霉亲和素、或亲和素)、或大的聚合物球、或其他分子，优选在测序缓冲液中是不带电荷的或带弱电荷的。在一些实施方式中，其应该至少为纳米孔入口的两倍大。
如下用磁珠标记dna：
[磁珠]+[柔性接头分子]+[接头结]+[可选的校准dna寡核苷酸]+[ssdna样品]
这样的具体实例是以下磁珠标记的dna组件，其使用双链λ-dna作为柔性接头。双链λ-dna是约50千碱基，并且具有约16μm的未拉伸长度。
[1μm
在一个实施方式中，胺和生物素修饰的dsλ-dna示于图17中。dsλ-dna的一端在两条链上都加入胺接头，促进与羧酸修饰的磁珠表面形成酰胺键。两个胺接头各自具有不同长度的碳链(c6和c3)(a)或具有相同长度的碳链(c6和c6)(b)，在两个λ-dna链上都提供用于形成酰胺键的柔性自由端。dsλ-dna的另一端是用两个相同的柔性自由尾(也可以做成不相同的)生物素化的，以被附着于中性亲和素，其具有4个生物素结合位点。为了使两条链都附着，增加接头分子的强度。
或者，胺官能化的珠可以与交联剂、例如bs3交联剂一起使用，以结合胺修饰的dsλ-dna以替代羧酸官能化的珠用于中性电荷珠表面。
图14示出显示纳米孔芯片(501)、扫描板(510)、磁体(520)和悬浮在缓冲液中的经标记的dna的简化的物理布局。
对准过程如下：
1.在纳米孔阵列的顺式侧上的腔充满含有磁珠标记的dna的缓冲液(如上所述)。
2.纳米孔偏压设为将带负电荷的dna引入到纳米孔中(图14a)。dna(600)的自由端进入纳米孔(500)。这可以通过监测纳米孔开孔电流而检测。dna分子进入纳米孔的进程被接头结停止，其不能穿过纳米孔。适当选择的接头结也可以阻断其它dna进入纳米孔。
3.一些经标记的dna样品不会占用纳米孔并且保持分散在纳米孔芯片表面上或在顺式缓冲液贮液器中。我们把纳米孔中的经标记的dna称为“接合的”，而孔外的经标记的dna称为“未接合的”。在接合的dna测序期间，如果担心干扰，可取的是从顺式贮液器除去未接合的dna。这可以通过在磁场接合之前进行的洗涤步骤而完成。未使用的dna可以被隔离在贮液器中，并可以由可切换磁体保留或释放用于下一轮测序过程。
4.将扫描板(510)和纳米孔表面相对靠近，但间隙与最长接头分子长度相比是足够大的。假设fm是作用在磁珠上的磁力，fes是作用在未接合的dna上的电力，fel是作用在接合的dna上的电力。由于fel比fes大几个数量级，通过启动可调磁体(520)，从零或非常弱的磁场开始，并逐渐增加磁场强度，使得fes<<fm<<fel(<<是指远小于)(图14b)。磁力足以将任何剩余的未接合的dna拉到扫描板，但不足以将接合的dna从纳米孔中拉出，其中它们被非常强的电力保持。与接合的dna连接的磁珠(620)将在接头结珠(603)正上方漂浮，与dna完全对准，并且因此与相应的纳米孔完全对准(见图14b)。5.然后进一步降低扫描板以允许与接合的dna相对应的所有磁珠与它们正上方的扫描板直接接触。在所有磁珠(620)接触后，将磁场增大，使接合的dna上的磁力fm远大于电力fel(fm>>fel)。将磁珠(620)紧贴扫描板(510)拉动，使得它们精确跟踪扫描板(510)的移动(图14c)。通过以精确控制的速度移动扫描板(或纳米孔基板)，随着dna根据需要多次进出孔，可以将dna测序。在dna测序之后，磁力可以关闭和打开以释放和重新混合或流通经标记的dna，并在不需要改变缓冲液或额外的样品处理的情况下，在短时间内开始另一轮测序。注意，在某些情况下，一些磁珠可具有剩磁强度并且在磁场关闭之后保持附着于扫描板表面，可以将次可调磁体置于纳米孔的反式侧以将磁珠拉出。次磁体可以远弱于主磁体。或者，其它方法可以用于除去松散附着的磁珠，例如介电力、流体剪切力等。
6.或者，磁珠可以在初始接触时与扫描板化学结合，以保证珠和扫描板表面之间的牢固接触，以便因此珠、接头分子和附着的dna可以随着扫描板移动精确地移动。在某些特殊情况下可能需要这样，其中所需的最大磁力被折中，例如如果必须使用较小的磁珠。
方法2：使用单链dna作为接头的对准
磁珠(620)通过柔性接头分子(606)附着，柔性接头分子(606)通过连接或其他方法与样品dna(600)连接(图13b)。柔性接头分子与样品dna是相同类型的，附着使得结果是单一连续的单链分子。因此，在不中断接头和样品dna之间的转变的情况下，整个连续分子可以穿过纳米孔。
如下构建经标记的dna：
[磁珠]+[柔性接头分子][连接][dna样品]
这个的具体实例是以下磁珠标记的dna组装体，其使用单链λ-dna(ssλ-dna)作为柔性接头。ssλ-dna为约50千碱基，并且在完全拉伸时具有约34μm的长度。
[1μm
简单地说，在图18中显示了在样品处理中涉及的步骤。将样品以dsλ-dna的形式储存，以避免不同dna片段之间可能的发夹形成或交联。在使用之前，使dsλ-dna的不需要的链变性和除去。
对准过程如下：
1.在纳米孔阵列的顺式侧上的腔充满含有磁珠标记的dna的缓冲液(如上所述)。
2.纳米孔偏压设为将样品dna(600)引入到纳米孔中(图15a)。dna的自由端进入纳米孔。这可以通过监测纳米孔开孔电流而检测。dna分子进入纳米孔的进程只在磁珠(620)处停止，所述磁珠不能穿过纳米孔。ssdna样品(600)和几乎整个柔性接头(606)穿过纳米孔到反式侧(图15b)。
3.一些标记的dna样品不会占用纳米孔并且保持分散在纳米孔芯片表面上或在顺式缓冲液贮液器中。我们把纳米孔内的经标记的dna称为“接合的”，而孔外的经标记的dna称为“未接合的”。在接合的dna测序期间，如果担心干扰，可取的是从顺式贮液器除去未接合的dna。这可以通过在磁场接合之前进行的洗涤步骤而完成。未使用的dna可以被隔离在贮液器中，并可以由可切换磁体保留或释放以供后期使用。
4.将扫描板(510)和纳米孔芯片(501)彼此相对靠近，间距小于柔性接头的长度。对于λ-dna，约10μm至15μm的柔性接头是合适的。将间隔保持在该位置。
5.将磁体接合，缓慢上升至全力。在某些点，缓慢上升的磁力将匹配然后超过纳米孔电力(fm≧fel)，磁珠开始将ssdna拉出。ssdna将继续被拉出，直到磁珠接触纳米孔正上方的扫描板(即ssdna与纳米孔正确地对准)(图15c)。
6.这时，ssdna中的一些可能稍微弹回并将额外的碱基拉出纳米孔。发生这种情况是因为磁力(fm)在ssdna首次离开纳米孔时和其接触扫描板时之间会有所上升。为了穿过缓冲液，磁珠力必须与阻碍运动的一些流体拖曳力相匹配。这会稍微过度拉伸ssdna。在弹回之后，ssdna达到平衡，其中从其碱基到碱基拉伸产生的张力正好与纳米孔电力相匹配。(tssdna＝fel)
7.现在，将磁力增加到最大以使珠紧紧地保持在扫描板上。通过以碱基识别所需的速度移动扫描板而进行测序。将ssdna预拉紧，并且在测序进行期间保持在张力下。
8.纳米孔反式侧上的剩余长度的λ-dna(或供选择的接头)在读取样品片段之前必须被测序。这是必要的低效率。λ-dna可以起到校准的作用，或定制的ssdna序列可以用于接头和传感器校准。如果纳米孔芯片和扫描板是正好平行的，读取的λ-dna长度可以是最小化的，使得初始间隔仅稍短于拉伸的柔性接头长度。
9.在测序完成之后，纳米孔偏压可以关闭或反向，脱离磁体以使得标记的dna与缓冲液重新混合，重复循环。此外，次磁体或其他方法可以用于帮助使磁珠脱离，如方法#1对准过程步骤5中所描述的。
该方法有一些显著的优点。接头到样品dna的转变完全平滑是特别有用的。因此，可以末端到末端地分析样品dna。如果使用定制的接头分子，可以包括一些校准序列，所述校准序列允许表征的每个纳米孔用于数据分析中。这种校准可以用于记录传感器对于碱基到碱基的各种转变的应答，以及对于重复碱基的应答等。定制的接头分子的实例是添加的具有校准序列的λ-dna。该添加应该在末端附近进行，样品dna附着于所述末端以确保它们被记录。
方法3：使用直接dna附着的对准
该方法与“使用单链dna接头的对准”方法具有相同的过程。dna组装如图13c所示。区别是：
●dna和磁珠之间没有长的“柔性接头分子”。相反，样品dna直接附着于磁珠：
[磁珠]+[ssdna样品]
更具体的实例是：
[1μm
另一个实例是：
[1μm
●dna的某些部分不能被读取。由于样品dna的某些部分必须在对准过程期间从纳米孔跨越到扫描板，因此那些碱基不能被正确记录。
由于缺乏接头分子，该方法比单链接头方法更简单并且稍微更便宜。对于具有足够大的dna样品的长dna片段的测序，不能对片段完成测序不会是重大问题。对于长度较短的dna片段或具有有限材料的样品，这会严重阻碍该过程。
讨论
本公开的自动对准方法适用于没有微柱体的扫描板(图14和图15)和具有共同的顺式肼或单独顺式肼的平底微柱体的扫描板(图16)。平端是必需的，使得磁场可以将磁珠(620)直接向上拉至微柱体，而不导致表面上的横向珠运动。61]这种磁珠辅助的dna与扫描板的附着使得装置中的dna脱离和重新附着更容易，无需复杂的附着和脱离化学成分或试剂。磁性自动的dna纳米孔对准使得不需要复杂的高精度装置对准，极大地简化了装置设计。另外，完美的对准使得所有dna分子以恒定且可预测的每秒碱基速度穿过孔，极大地简化了碱基传感算法。
磁性对准方法的要求是，磁体在扫描方向上施加到磁珠上的力大于作用在纳米孔内的dna碱基上的电力。这可能需要大的电磁体、大的且可移动的永磁体或甚至是永磁体阵列。该要求可以指出磁珠的最小尺寸。
磁性对准可以与珠和扫描板的化学附着和脱离相结合。这可以用于最小化磁珠的尺寸，这使得它们更长时间地保持悬浮。这样的过程可以需要在dna接合之后降低纳米孔偏压，使得可以用较小珠的减小的力将dna拉出纳米孔。在化学附着于扫描板之后，可以增加纳米孔偏压以增加张力。在测序完成之后，dna可以被脱离或破坏。
允许使用较小磁珠或较弱磁体的另一种方法是使磁珠不带电荷或带弱电荷，以便使作用在磁珠上的非必要电力最小化，特别是当磁珠与纳米孔接合时(图13b和图13c和图15)。一种解决方案是使用中性亲和素(或其他中性复合体)耦合的磁珠。由于中性亲和素的等电点是6.3，在正常缓冲液ph下它表现为几乎中性。另一种解决方案是使用羧酸官能化的磁珠。在耦合经胺修饰的dna或接头分子的反应后，用过量的乙胺而不是tris-hcl缓冲液或乙醇胺猝灭反应，这是珠制造商的通常建议。所产生的珠不带电荷，但是亲水的。参见图19。
应该注意，在图14和图15中，可调磁体(520)和扫描板(510)显示为一起移动，但这不是必需的特征。扫描板可以独立移动，或纳米孔芯片可以移动以改变间隔。如果有必要，可调磁体可以独立移动。
第iii部分：防止dna、接头分子和珠的交联
对于上文描述的磁珠辅助的dna-纳米孔对准和测序方法，实施方式是附着单个接头分子的单个磁珠，所述单个接头分子附着单个样品dna。但是，由于磁珠上的多个结合位点以及接头结，实际上这是难以实现的。如果使用多重结合位点的接头结，尤其是当接头结是珠时，可能形成复杂的珠/dna交联网络，这是务必需要避免的。以下是最小化复杂接头网络的产生所建议的方法：
(1)控制混合物中dna/珠的比例：
根据泊松分布定律，如果dna分子/片段与珠以1:1的比例混合，最终会有大约36.8％的珠没有dna，在剩余的有dna的63.2％的珠中，87.3％会有1个或2个拷贝，97％有1个、2个或3个拷贝。如果比例降低到1:2，我们将只有大约39.3％的珠有dna，但它们的96.3％将有1个或2个拷贝，99.6％将有1个、2个或3个拷贝。基本没有有4个或更多个dna拷贝的珠(<0.5％)。
可以通过富集(通过自由溶液电泳或其他方法)除去没有dna的珠(空珠)。
(2)使用连接蛋白而不是接头珠：
一些大的蛋白质、例如中性亲和素和抗体用于替代接头结珠在纳米孔处作为dna制动器是足够大的。这些蛋白质具有非常有限的结合位点，例如，中性亲和素只有四个生物素结合位点，抗体具有三个用于结合的支链。链霉亲和素和亲和素与中性亲和素相同。有仅具有两个结合位点的二价链霉亲和素蛋白，所述两个结合位点彼此相邻(顺式-二价)或在相反侧上(反式-二价)。
对于只有两个结合位点的蛋白质，我们可以首先附着一个单结合接头分子，只留下一个用于测序dna结合的位点，这保证了单个dna附着，参见图20。
对于具有三个结合位点的蛋白质，我们可以首先附着一个双结合接头分子，再次只留下一个结合位点用于测序dna。对于具有四个结合位点的蛋白质、例如链霉亲和素，我们可以首先附着一个三结合接头分子，这留下一个空结合位点，或附着一个双结合接头分子，留下两个空结合位点。得到两个测序dna分子的机会非常小，此外，对于自动对准方案，两拷贝dna连接到一个磁珠(通过接头分子)比一个dna连接到两个磁珠更好。图21显示使用单链dna(ssdna)和双链dna(dsdna)作为接头分子，其提供单结合位点(ssdna或仅有一条生物素化链的dsdna)或双结合位点(dsdna或末端有杂交引物的ssdna)。与二价链霉亲和素或常规链霉亲和素或抗体一起，它只能将单个测序dna分子连接到磁珠上。
(3)乳化液滴法：使用微流体技术或主体振动或其他混合技术以产生尺寸大于珠尺寸并且与珠尺寸相当的油包水液滴，使得一个液滴可以包含仅一个珠或至多两个珠，以及随机分布的dna分子。最后，将反应猝灭，并将有dna的珠与游离dna和空珠分离。由于相同的泊松分布规律，结果将类似于方法(1)，参见图22，但珠之间的交联可以被有效地避免。
(4)将ssdna柔性接头分子直接连接至单链样品dna：
如图13b和图15所示，将样品ssdna连接到ssdna接头上，形成新的连续单分子。该方法固有地避免了多重连接的问题，因为ssdna只可以直接连接到另一个ssdna的末端。用该方法没有复杂的珠/dna网络问题。
第iv部分：dna运动的磁性控制
如图23和图24所示，本公开还提供了用于使用可控磁体来控制dna、rna和其它生物分子穿过纳米孔的方法。不需要受控的扫描板移动，这大大简化了装置设计，降低了装置成本。这里，扫描板被替换为容器壁(521)，其以与扫描板相同的方式放置、但固定在等于或大于扫描板和纳米孔基板在其移动时之间的最大动态间隙的距离。
图23a显示靶dna(600)直接附着于磁珠(621)。通过偏压(530)将dna驱至纳米孔芯片(501)上的纳米孔(500)中，并且被磁珠停止。从几乎为零的磁场强度开始，将可调磁体(520)开启或重新定位，所述可调磁体是电磁铁或永磁体。如图23b所示，有许多力作用于磁珠(621)上：
●磁力(fm)
●浮力(fb)，由于缓冲液体积的排水量
●电力(fe)，其作用在带电荷的dna上
●电力(fbe)，其由于珠表面电荷而直接作用在珠上
●dna所附着的磁珠的重力(fw)
●摩擦力(ff)(在磁珠移动前存在于珠和孔入口之间)或拖曳力(fd)(当磁珠移动时由周围缓冲液施加在珠上)。
假设彼此平行的扫描板和纳米孔芯片在水平位置，珠从纳米孔垂直地移向扫描板，拉力是fm和fb的总和，相反的力是fe、fbe、fw、ff和fd的总和。通过逐渐增大磁力，拉力最终将超过相反的力，见下文，使得dna可以被拉出纳米孔。
fm+fb>＝fe+fbe+fw+ff+fd
对于成功的碱基测序，dna的运动需要是缓慢的和可控的。这意味着所产生的力平衡应该是接近平衡和稳定的。在所有的力中，fw和fb是不变的；fe取决于偏压、缓冲液条件、纳米孔条件和纳米孔中的dna碱基数，通常是不变的；fd是只在珠运动时存在的被动力，其稳定并减弱dna抖动运动；fm是由可控磁场的大小决定的。
剩下的两个力fbe和ff是位置特异性的，因此对于实现缓慢且可控的dna运动的目标是有问题的。在孔附近和在孔处的电场是非常强的，但离孔较远后是非常弱的，fbe在dna运动之前可以是强的，但当珠从孔移开之后下降到几乎为零。此外，如果有的话，摩擦力ff在孔处不是零，但当珠离开孔时立即下降到零。当磁珠离开纳米孔的紧邻区域时，力的突然失衡将导致突然加速的dna运动。
为了以缓慢且平稳的可预测速度使dna运动，粘附力(fbe+ff)必须完全消除或大幅减小。这可以通过选择非粘性磁珠并使珠不带电荷而完成。通过将粘附力减小到零或几乎为零，可以精确地控制力平衡，dna运动也可以如此。
有几种方法使珠不带电荷。一种是使用中性亲和素(或其他中性复合体)耦合的磁珠。由于中性亲和素的等电点是6.3，在正常缓冲液ph下它表现为几乎中性。另一种解决方案是使用羧酸官能化的磁珠。在耦合经胺修饰的dna的反应后，用过量的乙胺而不是tris-hcl缓冲液或乙醇胺淬灭反应，这是珠制造商的通常建议。所产生的珠不带电荷，但是亲水的。参见图19。
总是会有力的轻微失衡，这导致dna加速。这对于大量珠和纳米孔阵列上的多个孔尤其如此，其中磁力fm可以在整个阵列上变化。保持dna运动缓慢且可预测的关键是通过分析碱基传感信号而估算dna的速度，并且相应地调整磁场或偏压的大小。因此，dna测序可以通过适当的碱基传感方法、精心设计的计算机程序和校准机制而完成。
布朗运动可以导致dna运动的不稳定。为了解决该问题，一种选择是降低缓冲液温度，并且增加缓冲液粘度以减小布朗运动的幅度。另一种选择是只要电力保持在可以达到的最大磁力以下，就通过使用较高的偏压来增加电力fe。当珠移动时，靶dna分子将在力的作用下被拉伸，并且将产生分子内张力，因此靶分子不会自由地运动穿过纳米孔，而是随着其进展在相反的力产生的张力下保持拉紧，与机械控制方法类似。
此外，可以使用与靶分子相同种类的接头分子将靶分子连接至珠。例如，如图13b和图24a所示，单链λ-dna可以用作接头并连接到样品ssdna上，其形成长的连续ssdna。接头分子可以用作校准工具，同时它可以提供缓冲区，以便在实际dna样品测序之前，在开始时的dna运动的任何快速加速可以被减弱。
作为替代，将接头结(633)作为接头分子(632)和靶分子(600)之间的连接引入(图24b)。接头结是纳米孔入口的至少两倍大，以便当dna在偏压下易位穿过纳米孔时，它将起到止动器或制动器的作用。由于现在接头结在纳米孔处，所以它需要在测序缓冲液中是不带电荷的，而磁珠(620)不需要是不带电荷的。接头结可以是大的蛋白质(例如抗体、中性亲和素、或链霉亲和素等)、或大于纳米孔入口的任何聚合物复合体、或甚至非磁性的珠。
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