本发明涉及一种层析介质，具体涉及一种以谷胱甘肽为特异配体的亲和层析介质。
背景技术：
：蛋白质的分离纯化在生物化学、生物医药、生物保健食品等领域研究中应用广泛。亲和层析介质作为蛋白质分离纯化的重要手段之一，通过在层析介质上共价连接特异配体，用以分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目标蛋白或其他大分子物质。谷胱甘肽(gsh)是常用的特异配体之一，是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成的含γ-酰胺键和巯基的三肽。谷胱甘肽能够特异性结合谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、谷胱甘肽依赖性蛋白和谷胱甘肽-s-转移酶重组物。同时，由于谷胱甘肽-s-转移酶可溶性好、表达水平高，易与目标蛋白融合并表达得到含有gst标签的目标蛋白，可以通过谷胱甘肽-s-转移酶与谷胱甘肽的特异性结合，将含有gst标签的目标蛋白分离纯化，随后切除gst标签就能得到目标蛋白。现有的用于gst标签蛋白分离纯化的亲和层析介质通常采用琼脂糖凝胶微球作为基体，在其表面交联活化基团，再偶联谷胱甘肽得到亲和层析介质。其中活化基团来自环氧氯丙烷或者烯丙基缩水甘油醚中的一种，基体表面的活性环氧基团密度小，偶联谷胱甘肽量少，分离效率较低，同时此种以谷胱甘肽为配体的亲和层析介质制备过程复杂、价格昂贵、对填柱技术要求高，并且技术被少数公司所垄断。技术实现要素：针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种以谷胱甘肽为配体的亲和层析介质。本发明的技术方案概述如下：以表面分散有氮化硼的琼脂糖凝胶微球为内核，所述琼脂糖凝胶微球表面被第一交联剂和第二交联剂活化，所述第一交联剂和第二交联剂均偶联配体谷胱甘肽；其中，所述第一交联剂为环氧氯丙烷；第二交联剂为间苯二酚二缩水甘油醚或者新戊二醇二缩水甘油醚。优选的是，所述氮化硼的粒径小于1μm。优选的是，所述氮化硼与琼脂糖凝胶微球的质量比为4～5∶100。优选的是，所述琼脂糖凝胶微球的粒径为30～100μm。优选的是，所述第一交联剂与第二交联剂的物质的量比为5∶1～4。优选的是，所述第一交联剂与第二交联剂的物质的量比为5∶2～3。优选的是，所述谷胱甘肽的偶联在乙腈或者二甲基亚砜溶液中进行。本发明的有益效果是：本案通过对亲和层析介质表面所交联活化基团进行设计改进，同时采用连接臂长度相差较大的两种交联剂，并且利用第二交联剂中的苯环或者新戊二醇等大位阻基团间隔，在微球内核表面形成由第一交联剂和第二交联剂构成的双活化层，使环氧基密度增大、偶联位点增多；在常用的琼脂糖凝胶微球内核表面嵌入纳米级尺寸的氮化硼，增大了层析介质的机械性能、耐受压力，能够保证内核在多次重复实验后保持其形态和空间结构；现有技术中用于谷胱甘肽偶联的溶剂为二甲基亚砜，其能够消除琼脂糖凝胶与交联剂的相界面，提高交联剂的溶解程度，使琼脂糖凝胶微球活化充分，本发明发现当使用乙腈代替二甲基亚砜时能够达到相同或者更好的交联活化效果，而乙腈相比二甲基亚砜更加环保和廉价；本发明所涉及的改进步骤简单，生产成本更低，有利于大规模推广应用。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。本案提供了一种以谷胱甘肽为配体的亲和层析介质，通过下述实施例以及对比例具体阐述。实施例1制备过程如下：1)将20g粒径在30～100μm的琼脂糖凝胶微球浸泡在0.5l去离子水中，在45～50℃下磁力搅拌15分钟，随后向其中加入1.5g纳米级氮化硼，在50～55℃下磁力搅拌1.5～2小时，冷却至室温，过滤并洗涤干燥；2)向步骤1)所得微球中加入0.8g氢氧化钠、30ml乙腈、40ml(0.5mol)环氧氯丙烷、55ml(0.3mol)间苯二酚二缩水甘油醚，将该悬浮液置于40～45℃恒温振荡器中，在240r/min的转速下反应10小时，反应结束后过滤，分别用20wt％的乙醇溶液和去离子水反复洗涤微球，并用真空泵抽干；3)向步骤2)所得活化微球中加入30ml由0.1mol/l谷胱甘肽、0.1mol/l磷酸钠、1mmol/l二水合乙二胺四乙酸四钠的偶联反应液，在密封避光条件下，于35～40℃恒温振荡器中，在200r/min的转速下反应24小时，反应结束后过滤，用去离子水洗涤并用真空泵抽干；4)向步骤3)所得活化微球中加入30ml由0.2mol/l碳酸氢钠、0.5mol/l氯化钠、1mmol/l二水合乙二胺四乙酸四钠、2mol/l乙醇胺的偶联反应中止液，在20℃恒温振荡器中，在200r/min的转速下反应24小时，过滤、用去离子水洗涤并用真空泵抽干，即得到最终产品。实施例2制备过程如下：将实施例1的步骤2)中间苯二酚二缩水甘油醚的添加量分别改为36ml(0.2mol)，其余制备过程与实施例1相同。实施例3制备过程如下：将实施例1的步骤2)中间苯二酚二缩水甘油醚的添加量分别改为73ml(0.4mol)，其余制备过程与实施例1相同。实施例4制备过程如下：将实施例1的步骤2)中间苯二酚二缩水甘油醚的添加量分别改为18ml(0.1mol)，其余制备过程与实施例1相同。实施例5制备过程如下：将实施例1的步骤2)中55ml(0.3mol)间苯二酚二缩水甘油醚用62ml(0.3mol)新戊二醇二缩水甘油醚代替，其余制备过程与实施例1相同。实施例6制备过程如下：将实施例1的步骤2)中乙腈替换为二甲基亚砜，其余制备过程与实施例1相同。对比例1制备过程如下：将实施例1的步骤2)中环氧氯乙烷的添加量改为64ml(0.8mol),不添加间苯二酚二缩水甘油醚，其余制备过程与实施例1相同。对比例2制备过程如下：将实施例1的步骤2)中间苯二酚二缩水甘油醚的添加量改为147ml(0.8mol),不添加环氧氯乙烷，其余制备过程与实施例1相同。对比例3制备过程如下：将实施例1的步骤2)中间苯二酚二缩水甘油醚的添加量分别改为92ml(0.5mol)，其余制备过程与实施例1相同。对比例4制备过程如下：将实施例1的步骤2)中间苯二酚二缩水甘油醚替换为36ml(0.3mol)烯丙基缩水甘油醚，其余制备过程与实施例1相同。对比例5制备过程如下：实施例1的步骤2)中的乙腈不再添加，其余制备过程与实施例1相同。对比例6市售的以谷胱甘肽为配体的亲和层析介质。为了进一步阐释实施例1～6和对比例1～6所制备的亲和层析介质性能，分别对经过步骤2)交联剂活化后的琼脂糖凝胶微球进行环氧基密度测试，对各最终产品进行静态最大载量测试。环氧基修饰密度(mol/l)测试：在步骤2)操作结束后称取0.5g干燥的活化琼脂糖凝胶微球，向其中加入3ml1.3mol/l硫代硫酸钠和2滴酚酞指示液，密闭条件下在40℃恒温振荡器中，以200r/min转速震荡30分钟；随后用0.01mol/l盐酸标准溶液滴定，直至溶液由红色变为无色，并在半分钟内保持不变为止，记录所用盐酸标准溶液体积vhcl，根据公式可得出环氧基密度，其中s为环氧基修饰密度(mol/l)、chcl为盐酸标准溶液的浓度(mol)、m为琼脂糖凝胶微球的质量(g)、ρ为琼脂糖凝胶微球的密度去1.02g/ml。每个样品进行三次平行测试取平均值。gst标签蛋白静态最大载量(mg/ml)测试：将0.1ml以谷胱甘肽为配体的亲和层析介质置于1.5ml的离心管中，用1mlpbs(140mm氯化钠、2.7mm氯化钾、10mm磷酸氢二钠、1.8mm磷酸二氢钾)润洗5次，充分平衡后离心去除缓冲液；依次加入0.5ml前述pbs，0.5ml浓度c0一定(为保证测量准确，c0大于2.5mg/ml)的含有谷胱甘肽-s-转移酶(gst)标签的蛋白，在37℃下结合30分钟，以4000r/min离心5min，去除上清液，再以12000r/min转速离心5min，测定上清液中gst标签蛋白浓度为c1，根据公式，载量可求得亲和层析介质对gst标签蛋白的静态最大载量，其中gst标签蛋白选用融合有gst标签的b淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)。每个样品进行三次平行测试取平均值。表1记录了测试所得数据，分析实施例1和对比例1～2的环氧基修饰密度和gst标签蛋白静态最大载量可知，环氧氯丙烷和间苯二酚二缩水甘油醚同时作为交联剂用于活化琼脂糖凝胶微球时，环氧基修饰密度大大提高，为仅使用单一交联剂时环氧基修饰密度的1.5倍以上，同时对gst标签蛋白的载量也提高将近0.7倍，显著提升了亲和层析介质的分离性能；根据实施例1～4以及对比例3能够优化出第一交联剂和第二交联剂的最佳添加比例。通过实施例1与对比例4可以分析出，当第二交联剂采用常规的具有较长连接臂的烯丙基缩水甘油醚时，环氧基修饰密度以及gst蛋白载量没有提高，推测对比例中没有形成有效的双层环氧基活化结构，从而证明只有选用间苯二酚二缩水甘油醚和新戊二醇二缩水甘油醚作为第二交联剂时才能够形成有效的双层环氧基活化结构，以提高层析介质对gst标签蛋白的分离性能；由实施例1、实施例6以及对比例5能够看出，在对琼脂糖凝胶微球进行交联活化时添加乙腈或者二甲基亚砜能够使琼脂糖凝胶微球活化充分，环氧基修饰密度更高，蛋白载量增大，当使用乙腈代替二甲基亚砜时能够达到相同或者更好的交联活化效果，而乙腈相比二甲基亚砜更加环保和廉价；当采用相同的静态载量测试方法对市售的以谷胱甘肽为配体的亲和层析介质进行测试，根据对比例6的测试结果可以发现，本发明所涉及的亲和层析介质的静态蛋白载量提高了30％以上，对目标蛋白具有更好的分离效果。表1层析介质环氧基修饰密度(μmol/ml)静态最大载量(mg/ml)实施例169.8919.32实施例268.8118.65实施例367.0617.03实施例467.6317.84实施例569.2219.17实施例668.7518.53对比例142.6911.20对比例244.7010.02对比例354.2514.77对比例447.1611.62对比例550.3813.15对比例6-14.48尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。当前第1页12