本发明涉及一种分离纯化新方法，尤其涉及甘露糖赤癣糖醇脂(mannosylerythritollipids,mels)的分离纯化新方法。
背景技术：
：表面活性剂被称作“工业味精”，在工业和我们日常生活中均有广泛的应用。但目前大多数使用的是石油基化学表面活性剂，大量的化学表面活性剂会对土壤、水体和生物体带来不利的影响，对环境和人体健康造成极大的危害。生物表面活性剂是由微生物发酵生产的表面活性剂，具有低毒、可降解、生态安全和高表面活性等优点，在多领域内可替代化学表面活性剂。甘露糖赤藓糖醇脂(mels)是一类由蚜虫拟酵母(pseudozymaaphidis)或黑粉菌酵母(ustilagoaphidis)利用油脂和糖作为碳源发酵生产的生物表面活性剂，也是目前被认为是最具应用潜力的生物表面活性剂之一。mels具有高效的表/界面活性，还兼有保湿、抗氧化等功能，此外mels还具有特殊的生理活性，如抑制微生物生长、诱导细胞分化、提高基因转染率等，因此在众多领域具有广泛的应用前景，可用于替代化学表面活性剂。但是受限于高昂的生产成本，mels至今未见广泛的工业化应用。究其根本，低水平、低效率的分离工艺是导致其成本高居不下的主要原因。目前对于mels的分离纯化手段主要有树脂吸附，泡沫分馏和溶剂萃取等。其中树脂吸附回收率和产品纯度低且操作繁琐；泡沫分馏仅限用于分离低浓度的产品，且设备投资和运行费用较高。溶剂萃取是基于mels在有机溶剂-水相体系中不同亲和性开发的分离纯化手段，也是目前研究较为广泛的分离手段。一般而言，用于mels分离回收的萃取剂包括有：氯仿，乙酸乙酯，甲基叔丁基醚，环己烷等，但大多溶剂不能除去发酵液中的游离脂肪酸和未消耗完的油脂，导致产品纯度不高和回收率严重偏低等问题。技术实现要素：本发明针对现有mels分离纯化方法的不足和缺陷，提出一种mels的分离纯化方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种甘露糖赤癣糖醇脂的分离纯化方法，包括以下步骤：(1)将甘露糖赤癣糖醇脂粗品溶解在甲醇中，加入水和正己烷，充分混合，甲醇、水、正己烷的体积比为2-5:1:0.5-2.5；(2)通过静置或离心，使两相分离，回收富含甘露糖赤癣糖醇脂的下层甲醇相；(3)步骤2中分离的上层正己烷相，加入甲醇和水，混合均匀，甲醇、水、正己烷的体积比为2-5:1:0.5-2.5，通过静置或离心使两相分离，回收下层甲醇相；(4)合并步骤2和步骤3中的甲醇相，再加入正己烷，正己烷的体积为甲醇相的0.2-1倍，混合均匀；通过静置或离心使两相分离，得到下层高纯度的mels甲醇相；(5)步骤4中的mels甲醇相再通过旋转蒸发干燥去除甲醇，得到甘露糖赤癣糖醇脂纯品。进一步地，所述步骤1中，甘露糖赤癣糖醇脂粗品可以是发酵过程中的发酵液；也可以是发酵液液中析出的固态或半固态膏体；也可以是发酵液经有机溶剂萃取的萃取液。进一步地，所述步骤1中，加入的水的ph优选为2-5。进一步地，所述步骤3中，加入的水的ph优选为2-5。进一步地，所述步骤5中，旋转蒸发干燥去除甲醇的工艺参数为：真空度100-500pa，转速60-150rpm，干燥温度70-80℃。本发明的有益效果是，1、本发明采用的是溶剂萃取的方法，根据mels粗品中各组分的极性差别，通过调节甲醇-水-正己烷比例而改变萃取体系的极性，从粗产物中去除脂肪酸和油脂等杂质，实现高效分离纯化mels的目的。2、本发明操作简单，所用溶剂毒性小，且产品回收率和纯度均较高。附图说明图1为mels的分离纯化流程示意图；图2为萃取过程中各步骤的上下相tlc图。具体实施方式mels是一类由蚜虫拟酵母(pseudozymaaphidis)或黑粉菌酵母(ustilagoaphidis)利用油脂和糖作为碳源发酵生产的生物表面活性剂。一般而言，发酵液中的mels主要以四种结构(mela、melb、melc、meld)存在，各自的结构式如下所示：本发明中mels粗品可以是发酵液；也可以是发酵液中析出的半固态膏体，也可以是发酵液经有机溶剂萃取的萃取液。本发明基于mels粗产品中mels、油脂和游离脂肪酸等组分的极性差别，开发了新型的甲醇-水-正己烷的三元萃取体系用于高效分离纯化mels。本发明提出的mels分离纯化工艺，可通过调节三元萃取体系的比例，满足mels不同回收率和纯度的要求，且操作过程简单高效。下面结合附图和实施例对本发明予以进一步详细说明。如图1和图2所示，本发明mels的分离纯化方法，包括以下步骤：(1)将mels粗品溶解在甲醇，加入水和正己烷，充分混合；(2)通过静置或离心，使两相分离，回收富含mels的下层甲醇相；(3)步骤2中分离的上层正己烷相，加入甲醇和水，混合均匀，通过静置或离心使两相分离，回收下层甲醇相；(4)合并步骤2和步骤3中的甲醇相，再加入正己烷，混合均匀；通过静置或离心使两相分离，得到下层高纯度的mels甲醇相；(5)步骤4中的甲醇相再通过旋转蒸发或真空干燥，得到mels纯品。下面根据实施例详细描述本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。实施例1取富含mels的发酵液，用滤纸过滤，半固态滤渣用足够多的甲醇溶解，得到mels的甲醇溶液。然后按照甲醇：水：正己烷＝4:1:1的比例，向其中加入相应体积的水和正己烷，控制水相的ph为2、5、7、9、11，在悬混仪上充分混匀2min，然后4000rpm下离心2min，取出下层甲醇相。结果如下表1所示，采用此方法均可以达到分离纯化mels的目的，且水相以酸性ph更佳。表1水相phmels的回收率272±3％560±4％744±2％922±5％1115±5％实施例2取富含mels的发酵液，用滤纸过滤，半固态滤渣用足够多的甲醇溶解，得到mels的甲醇溶液。按照甲醇：水：正己烷＝2:1:1，3:1:1，4:1:1，5:1:1的比例，向其中加入相应体积的水和正己烷，水相调节ph为2，在悬混仪上充分混匀2min，然后4000rpm下离心2min，取出下层甲醇相。结果如下表2所示，采用此方法均可以达到分离mels的目的。表2实施例3取富含mels的发酵液，用滤纸过滤，半固态滤渣用足够多的甲醇溶解，得到mels的甲醇溶液。按照甲醇：水：正己烷＝2:1:0.5，2:1:1.5，2:1:2，2:1:2.5的比例，向其中加入相应体积的水和正己烷，水相调节ph为2，在悬混仪上充分混匀2min，然后4000rpm下离心2min，取出下层甲醇相。结果如下表3所示，采用此方法均可以达到分离mels的目的。表3实施例4取富含mels的发酵液，用滤纸过滤，半固态滤渣用足够多的甲醇溶解，得到mels的甲醇溶液。按照甲醇：水：正己烷＝3:1:0.5，3:1:1.5，4:1:2，5:1:2.5的比例，向其中加入相应体积的水和正己烷，水相调节ph为2，在悬混仪上充分混匀2min，然后4000rpm下离心2min，取出下层甲醇相。结果如下表4所示，采用此方法均可以达到分离mels的目的。表4实施例5取富含mels的发酵液，用滤纸过滤，半固态滤渣用足够多的甲醇溶解，得到mels的甲醇溶液。按照甲醇：水：正己烷＝2:1:1的比例，向其中加入水和正己烷，水相调节ph为2。在悬混仪上充分混匀2min，然后4000rpm下离心2min。取出萃取之后的甲醇相，加入总体积的0.2，0.4，0.6，0.8，1倍体积的正己烷，悬混仪混匀2min，然后4000rpm下离心2min，取出下层甲醇相，结果如下表5所示，均可以达到除杂的目的。表5正己烷加入体积比例杂质含量0.26±2％0.45±1％0.65±1％0.87±2％16±1％实施例6取富含mels的发酵液，用滤纸过滤，半固态滤渣用足够多的甲醇溶解，得到mels的甲醇溶液。按照甲醇：水：正己烷＝2:1:1的比例，向其中加入水和正己烷，水相调节ph为2。在悬混仪上充分混匀2min，然后4000rpm下离心2min，甲醇相取出待用。取出萃取之后正己烷相，然后按照3:1:1的甲醇：水：正己烷比例添加甲醇和水，在悬混仪上充分混匀2min，然后4000rpm下离心2min，回收下层的甲醇相。合并上述两分离步骤中的甲醇相，加入0.5倍体积的正己烷后摇匀，然后再次离心分层，回收底部甲醇相。甲醇相再利用旋转蒸发器干燥浓缩，条件为：真空度100pa，120rpm，在70度旋蒸30min以去除甲醇，得到mels的纯品。通过上述分离步骤，mels的回收率可达到92％以上，且纯度高于90％。以上所述，仅为本发明专利的较佳示例而已，并非用于限定本发明专利的保护范围。除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变化形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。当前第1页12