一种原位固定漆酶超滤膜的制备方法、一种含酚废水的处理方法与流程

本发明属于废水处理领域，具体涉及一种原位固定漆酶超滤膜的制备方法、一种含酚废水的处理方法。

背景技术

酚类化合物是主要的污染物之一，也被视为要优先控制的污染物，即使在低浓度时，饮用水中存在的酚类污染物亦会对人体健康造成伤害。

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，研究表明其对染料和酚类有较强的催化氧化能力，在废水处理方面显示出很大的潜力。由于游离漆酶对环境条件十分敏感，且游离漆酶参与反应后不能回收，难以实现重复利用，限制其在实际中的应用。因此常采用固定化技术提高漆酶的稳定性和重复使用性。漆酶的固定化不仅使其整体结构完整，催化活性得以较好保留，而且可提高它在处理污水过程中的酸碱稳定性、温度稳定性和重复使用性，所以漆酶固定化材料的寻找显得尤为重要。

根据最新报道，在无机材料方面，国内外学者使用了比表面积大、孔径可调和无生理毒性的多壁纳米碳管、磁性纳米硅颗粒、介孔分子筛和金属氧化物等作为载体固定化漆酶对工业废水中双酚a和硫化染料等污染物的降解进行了深入探讨。在有机无机材料杂混方面有使用多巴胺包埋磁性sio2、sio2/壳聚糖和凝胶小球等。

而膜作为一种优良的酶固定化基质，当前有将漆酶固定于聚氨酯纳米纤维酶、聚醚矾膜、静电纺丝纤维膜等上，膜具有孔隙率高、比表面积大、均一性好且制备简单等优点，不仅有利于酶与底物充分接触，能有效提高酶的催化效率，容易从反应体系中分离回收，而且基于膜材料的膜生物反应器对酚类污染物有良好的降解效果，也逐渐成为当前的研究热点。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种原位固定漆酶超滤膜的制备方法，将制备得到阶梯状化合物base(以下简称tb)，与n-甲基吡咯烷酮(nmp)和漆酶固定化产品lac/nac按照一定的比例配成铸膜液，在恒温恒湿条件下刮膜得到原位包埋固定化漆酶的超滤膜。

本发明另一目的在于提供一种含酚废水的处理方法，利用上述制备的原位固定漆酶超滤膜处理降解含酚废水。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供的一种原位固定漆酶超滤膜的制备方法，包括以下步骤：

1)将纳米活性炭nac与漆酶溶液混合搅拌，离心分离，用缓冲溶液洗涤沉淀至上清液中检测不到酶活性，收集沉淀，即得到固定漆酶产品lac/nac；

2)将tb、nmp和lac/nac混合，密封搅拌溶解，然后脱泡，即得铸膜液；

3)步骤2)制备的铸膜液在刮膜机中刮膜，然后，在空气中静置进行预蒸发后，然后，25℃±2℃条件下，浸入凝固浴中相转化成膜，膜自行剥离，完全固化后，即原位固定漆酶超滤膜lac/nac@tb。

进一步的，步骤1)具体为：将5-10mg直径30nm的纳米活性炭nac与3-6ml1052u/ml的漆酶溶液于25℃条件下混合搅拌10-12h，离心分离，用缓冲溶液洗涤沉淀至上清液中检测不到酶活性，即得到固定漆酶产品lac/nac。

所用的缓冲溶液是指ph＝7的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲溶液。

所用nac为市售，购自阿拉丁试剂。

步骤2)具体为：将tb、nmp和lac/nac混合后，密封条件下进行磁力搅拌12-24h，然后，放入真空干燥箱在60℃下脱泡1h，即得铸膜液。

步骤2)所述tb、nmp和lac/nac质量比的1.5：8.5：0.8。

所述tb的制备方法参照m.carta,r.malpass-evans,m.croad,etal.,thesynthesisofmicroporouspolymersusingtroger'sbaseformation,polym.chem.5(2014)5267–5272公开的方法制备

步骤3)中刮膜条件为：温度为25±2℃，相对湿度为30±2％。

步骤3)刮膜过程中，控制刮刀与玻璃板之间的距离10-20μm。

进一步的，步骤3)中所述凝固浴是指水。

进一步的，步骤3)中制得的膜用去离子水清洗或浸泡后，置于纯水中保存，先每1小时更换1次纯水，换水3次，然后每隔8小时更换1次，换水3次；进一步彻底去除有机溶剂。

本发明提供的一种含酚废水的处理方法，利用上述制备的原位固定漆酶超滤膜处理处理含酚废水，具体方法为：

取lac/nac@tb置于含酚废水中，搅拌反应，即可。

本发明利用原位固定漆酶超滤膜处理处理含酚废水，降解率达78.4～81.5％。

与现有技术相比，本发明提供一种新型的漆酶原位固定化方法，向有机基体base中引入均匀分散的固定化漆酶的纳米碳粉(lac/nac)制备有机无机杂化超滤膜。结构方面，电子显微镜显示lac/nac@tb膜相比tb膜，整个宏观结构看起来更为疏松，表面变得粗糙呈趋向于海绵多孔结构，致密层与支撑层的界限变得模糊，内部具有丰富纳米级孔道结构，，膜内lac/nac颗粒清晰可见，荧光显微镜显示漆酶被成功包埋固定于纳米活性炭内部；酶活及酚类污染物降解性能方面，lac/nac@tb具有良好的酸碱稳定性和热稳定性，这归因于纳米活性炭比表面积大，对漆酶直接物理吸附，克服了交联等酶固定化方法导致的酶活损失问题，漆酶在纳米活性炭内部构成的“微反应器”固定于“自具微孔结构、高通量”tb膜内部，保证了固定化漆酶的酶活力，也为酚类污染物的吸附接触和降解产物的扩散提供了有效通道。结果显示在ph在3～6的条件下，lac/nac@tb仍保持70.2％以上的相对酶活，当温度在20℃～60℃时，lac/nac@tb相对酶活仍保持64.7％以上，lac/nac@tb对酚类污染物的降解率达78.4～81.5％；此外lac/nac@tb在含酚、染料废水的处理方面，亦可同时发挥膜过滤和漆酶催化降解的双重特性。

附图说明

图1为tb表面结构sem表征图；

图2为tb断面结构sem表征图；

图3为lac/nac@tb表面结构sem表征图；

图4为lac/nac@tb断面结构sem表征图；

图5为lac/nac@tb荧光成像；

图6为lac/nac@tb的热稳定性；

图7为lac/nac@tb的ph稳定性；

图8为tb制备过程示意图。

具体实施方式

实施例1

一种原位固定漆酶超滤膜的制备方法，包括以下步骤：

1)取5mg直径30nm的纳米活性炭nac与3ml1052u/ml的漆酶溶液于25℃搅拌12h，离心分离，用ph＝7的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲溶液洗涤沉淀至上清液中检测不到酶活性，即得到固定漆酶产品lac/nac，此条件下获得的固定化漆酶催化能力为168.4u/g载体。

2)称取tb1.5g、nmp8.5g和lac/nac0.8g置于锥形瓶中，加入转子，塞紧瓶盖，瓶口用保鲜膜包裹后进行磁力搅拌24h，待溶解完全后，放入真空干燥箱在60℃下脱泡1h，得铸膜液。

3)将配制的铸膜液在刮膜机中刮膜，条件为：温度为25±2℃，相对湿度为30±2％，控制刮刀与玻璃板之间的距离10μm匀速滑动刮刀使铸膜液在玻璃板上铺展，在空气中静置10s进行预蒸发后，迅速浸入一定温度的去离子水凝固浴中相转化成膜，膜自行从玻璃板上剥离，完全固化后得到原位固定漆酶超滤膜lac/nac@tb；制得的膜用去离子水清洗或浸泡后，置于纯水中保存，先每1小时更换1次纯水，换水3次，然后每隔8小时更换1次，换水3次，使溶剂、添加剂从膜中完全被清除，即可。

步骤1)制备的固定漆酶产品lac/nac活性的测定，以愈创木酚为底物，将一定质量的lac/nac加入到缓冲溶液(ph＝4.5)和1.0mmol/l底物中，于25℃反应5min后，冰浴终止反应，离心分离，以事先灭活酶液的反应混合液为对照，测定上清液在465nm处吸光度的变化值(愈创木酚消光系数为ε＝12000mol^-1·l·cm^-1)，以此计算相应酶活：每分钟使1.0μmol的愈创木酚氧化所需的酶量为一个酶活单位。固定化酶活性用每克载体的酶活单位(u/g)表示，试验重复三次，取平均值。

将tb和lac/nac@tb样品剪裁至细长条状的放入液氮中脆断后固定在样品台侧面，真空干燥，测试前进行喷金处理，再将tb和lac/nac@tb样品放置进sem后调整镜头位置选择不同的倍数对其表面及断面进行电镜拍摄；将膜样品直接用荧光显微镜观察，电脑拍摄成像，结果见图1至图4。sem照片显示tb为传统的指状孔，而lac/nac@tb膜表面变得粗糙，呈趋向于海绵多孔结构，致密层与支撑层的界限变得模糊，整个宏观结构看起来更为疏松，膜内lac/nac颗粒痕迹清晰可见；用荧光显微镜观察fitc标记的lac/nac@tb在纯荧光下的形态，从图5中可以看出，lac/nac@tb发出绿色荧光，证明漆酶被成功包埋于nac@tb内部。具体荧光标记方法见实施例2。

热稳定性测定：用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(ph＝4)配制以愈创木酚(浓度为1.0mmol/l)为底物的溶液，取8份每份4ml，加入500mg实施例1制备的lac/nac@tb，分别于10、20、30、40、50、60、70、80℃水浴搅拌反应30min，离心取上清液，测定其在波长465nm下吸光度(od465)值，测定lac/nac@tb的相对酶活，结果如图6所示。可以看出lac/nac@tb有良好的热稳定性，当温度在20℃～60℃时，lac/nac@tb相对酶活仍保持64.7％以上，这说明在高温条件下，漆酶分子被原位固定在nac@tb孔道中，与外界环境有一定温度差，避免高温度导致的酶分子失活。

ph稳定性测定：用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液配制11份体积为4ml的不同ph(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11)的愈创木酚溶液，加入500mg实施例1制备的lac/nac@tb，于50℃水浴搅拌反应30min，离心取上清液，测定其在波长465nm下吸光度(od465)值，测定lac/nac@tb的相对酶活，结果如图7所示。可以看出lac/nac@tb在ph值为3.0～6.0间均能保持较高相对活性，大于70.2％，说明lac/nac@tb的ph适应性较强，推测膜孔道内部的微环境对孔道内的ph起到了缓冲作用。

一种含酚废水的处理方法，利用实施例1制备的原位固定漆酶超滤膜处理处理含酚废水，用间苯二酚用作模拟污染物：取缓冲溶液配制的ph为4.0，初始浓度为5-10mg/l的间苯二酚废水，在反应温度50℃下，向其中加入4片尺寸1cm×1cmlac/nac@tb膜，然后置于转速为50r/min的摇床中反应一定时间。作为对照，本实验采用等量的灭活的lac/nac@tb于相同条件下反应。将lac/nac@tb取出后，通过hplc检测间苯二酚浓度，反应5.0h后，间苯二酚的最终去除率达到78.4～81.5％。

实施例2

一种原位固定漆酶超滤膜的制备方法，包括以下步骤：

重复实施例1，区别在于，漆酶使用前荧光标记，标记方法为：将待交联漆酶对交联反应液透析三次,4℃条件下进行，透析至ph＝9.0。交联反应液配制方法：7.56gnahco3，1.06gna2co3，7.36gnacl，加水定容至1l。将fitc溶于dmso中，浓度为1mg/ml。每次交联使用的fitc均应新鲜配制，避光。按p：f(蛋白质：fitc)＝1mg：150μg的比例将fitc缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4℃反应8h。加入5mol/l的nh4cl至终浓度50mmol/l，4℃终止反应2h。将交联物在pbs中透析四次以上，至透析液清亮。交联物的鉴定：蛋白浓度(mg/ml)＝[a280–0.31×a495]/1.4；f/p比例：3.1×a495/[a280–0.31×a495]，该值介于2.5～6.5之间。其他操作同实施例1。