一种亚微米流道微流控芯片及其制作方法与流程

本发明涉及生命科学与医学领域，并且特别地，涉及一种亚微米流道微流控芯片及其制作方法。

背景技术：

质粒和蛋白等生物大分子的检测定量在医学、遗传学、基因工程和生物计量研究等领域有广泛的应用。尤其在生物计量研究领域，建立溯源途径清晰的生物物质溯源体系和研制相关的计量标准，使得生物物质检测结果能够溯源到si单位，是当前国际计量研究最活跃的领域之一。本项目的主要目的是建立基于单分子计数技术的生物大分子精确定量方法，建立与si单位直接溯源的计数方法，实现生物大分子的数量浓度检测，并建立可溯源至si单位的生物大分子计量装置。

当前dna的定量方法主要包括紫外吸光度法、定磷法、实时荧光定量pcr(polymerasechainreaction)法和凝胶电泳法。下文对紫外吸光度法和实时荧光定量pcr法进行介绍。紫外吸光度法的检测原理为组成dna和rna的碱基具有吸收一定波长紫外光的特性，通过检测核酸在260nm的吸收峰，可以定量出待测溶液的浓度值。而极易污染dna溶液的蛋白的吸收峰在280nm，通过计算待测样品260nm的吸收峰和280nm的吸收峰的比值(a260/280)，可以定量dna溶液的纯度。实时荧光定量pcr是指在dna聚合酶链式反应扩增溶液中加入荧光标记物，当dna进行扩增时，荧光标记物会和dna结合导致荧光增强或者淬灭，实时监控待测dna溶液和标准参照物的荧光变化，由于在pcr扩增时期，待测dna溶液的扩增值和参照物的扩增值具有线性关系，所以通过检测的荧光变化值可以定量dna溶液的浓度值。上述方法只能检测dna的质量浓度，为了提高检测结果的可比性，提出使用基于电阻脉冲传感(resistancepulsesensing，rps)原理(亦称“库尔特计数器原理”)的生物单分子计量定量方法，用于生物大分子的数量浓度检测定量。

rps检测原理已经应用于单细胞水平和单分子水平的检测，如基于rps原理的库尔特粒子计数器应用于无标记的细胞计数与种群区分，基于rps原理的纳米孔用于不同链长的dna分辨和dna测序。这两种检测方法是通过检测电压或电流脉冲值的数量和幅值大小确定待测物的浓度和种类。由于稀有生物样本制备繁琐、体积微少，故引入微流控芯片进行样本检测和分析。微流控检测芯片具有检测消耗样本和试剂少、检测灵敏度高、检测速度快、体积小和便于携带等优点。基于rps原理的库尔特计数器由于检测原理简单、制造方法与微流控芯片制造工艺兼容，现已与微流控芯片结合制造微流控芯片细胞计数器，用于细胞检测、区分。

基于rps原理的传统库尔特计数器具有检测原理简单、实现方便的优势；微流控芯片具有样本消耗少、体积小的优势；纳米孔具有检测分辨率高、单分子检测能力的优势。但是传统库尔特计数器只能检测尺寸与细胞相仿的粒子，而纳米孔检测方法因使用电泳力驱动dna等分子通过纳米孔，无法确定通过纳米孔的液体体积，故无法精确检测出待测样本浓度。

因此，目前亟需一种亚微米流道微流控芯片及其制作方法，通过该亚微米流道微流控芯片以实现具有接近纳米孔的检测灵敏度，又可以实现对待测物的体积检测，同时还可以实现对质粒和细胞外泌体等生物大分子检测定量。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供了一种亚微米流道微流控芯片及其制作方法，通过该亚微米流道微流控芯片以实现具有接近纳米孔的检测灵敏度，又可以实现对待测物的体积检测，同时还可以实现对质粒和细胞外泌体等生物大分子检测定量。

本发明提供一种亚微米流道微流控芯片，包括：

基底层，其上表面设置有激励电极和第一检测电极；

上层基片，其下表面设置有微纳米通道，所述微纳米通道中间一段通道宽度小于1微米且为凸起设置；所述上层基片的下表面与所述基底层的上表面键合，其中，凸起设置的结构与所述基底层之间的间隙形成亚微米流道；

其中，所述激励电极和所述第一检测电极分别位于所述亚微米流道的两端且与所述微纳米通道接触设置；

其中，所述上层基片还设置有与所述微流道相通的试剂注入口及出口。

优选地，所述基底层上还设置有第二检测电极；

其中，所述第二检测电极与微纳米通道之间间隔一指定距离；

其中，所述第一检测电极和所述第二检测电极分别设置于所述激励电极两侧。

优选地，所述基底层为玻璃材质制成基底层。

优选地，所述上层基片为由pdms材质制成的上层基片。

优选地，所述芯片，还包括检测系统，包括：

进样装置，用于将待测样本通过试剂注入口注入并使样本流至亚微米流道中；

前置电流放大器，其信号输入端与所述基底层上设置的所述第一检测电极、第二检测电极分别连接；

阻抗频谱仪，其包括，激励信号输出端、信号接收端和信号数据输出端；其中，所述激励信号输出端与所述激励电极连接；所述信号接收端与所述前置电流放大器的电流放大后的信号输出端连接；

控制装置，其与所述阻抗频谱仪的所述信号数据输出端连接；

其中，所述激励电极与所述微纳米通道接触的一端通过电解液与所述第一检测电极连接。

由上，通过进样装置将亚微米粒子溶液从样本入口注入微流控芯片的亚微米流道中，通过检测区域。激励电极连接由阻抗频谱仪提供的激励信号；第一检测电极、第二检测电极将信号引入前置电流放大器，经过放大的信号引入阻抗频谱仪，通过阻抗频谱仪进行信号解调，并获得差分信号；阻抗频谱仪解调的信号传输给控制装置，同过该控制装置进行信号分析处理、显示和存储。

优选地，所述芯片，还包括：

微流控芯片pcb转接结构，其设置于所述亚微米流道微流控芯片检测电极和所述前置电流放大器两者之间，并分别与两者连接。

优选地，所述微流控芯片的pcb转接结构，包括：

pcb转接板和ipx转sma转接线；

其中，所述ipx转sma转接线包括ipx接口和与其电学连接的sma接口；

其中，所述pcb转接板的一端分别与所述亚微米流道微流控芯片的第一检测电极和第二检测电极的远离所述微纳米通道的一端通过金线焊接；

所述pcb板卡的另一端与所述ipx接口连接；

其中，所述sma接口与所述前置电流放大器连接；

其中，所述pcb板的尺寸为5cm宽、6cm长；其中，所述pcb转接板上设置有光学窗口。

本申请还提供一种亚微米流道微流控芯片的制作方法，基于上述的芯片，包括：

a、制作下表面设置有微纳米通道的上层基片；其中，所述微纳米通道中间一段流道为宽度小于1微米且为凸起设置；

b、制作上表面设置有激励电极和第一检测电极和第二检测电极的基底层；

c、将所述上层基片的下表面与所述基底层的上表面键合；其中，所述凸起设置的结构与所述基底层之间的间隙形成亚微米流道；其中，所述激励电极和所述第一检测电极分别位于所述微纳米通道的两端且与所述微纳米通道接触设置；

其中，所述上层基片还设置有与所述微纳米通道相通的试剂注入口及出口。

优选地，所述步骤a，包括：

a1、制作亚微米流道模板；

a2、根据所述亚微米流道模板制作下表面设置有微纳米通道的上层基片。

优选地，所述步骤a1，包括：

a11、利用食人鱼和氢氟酸溶液清洗上表面抛光一低阻硅片，以去除所述硅片表面的沾污和杂质；其中，所述食人鱼为：浓硫酸和双氧水的混合溶液，其中所述浓硫酸:双氧水的体积比为3:1；其中，所述低阻硅片置于器皿的底部且覆盖所述器皿的底部；

a12、在所述硅片上沉积指定厚度的psg薄膜，并利用光刻工艺将掩膜版上的流道图形转移到psg薄膜上，并根据所述流道图形将所述psg薄膜上与所述微纳米通道的侧壁相对应位置处的psg刻蚀掉，以形成侧壁对应位置区域，剩余的psg图形为凸起设置，中间一段设置为宽度小于1微米；

a13、在所述psg薄膜上旋涂指定厚度的su-8光刻胶，然后利用光刻机将掩模版上的通液流道图形转移到su-8光刻胶上，显影后得到中间一段设置为距离小于10微米且为凹陷设置，且与所述微纳米通道的侧壁相对应位置处的su-8光刻胶被去除的模板，再将其在150℃下烘烤30min，以得到各层紧密结合的符合预设结构的亚微米流道模板。

优选地，所述步骤a13之后，还包括：

a14、利用硅烷化试剂，对所述模板表面进行氟化处理。以降低模板表面和pdms的粘连，使后期固化的pdms更容易从模板上取下。

优选地，所述步骤a2，包括：

a21、利用去离子水冲洗硅烷化处理的亚微米流道模板以去除其表面灰尘，且冲洗后利用氮气枪吹干；

a22、将体积比为3:1的a胶和b胶混合均匀之后倾倒在亚微米流道模板上，之后将其放入真空皿中，利用真空去除气泡，然后整体放入120℃烘箱中烘烤10h；

a23、将体积比为10:1的a胶和b胶混合均匀之后倾倒在所述a22中所述烘烤10h之后的模板之上，并在80℃烘箱中烘烤2h；

a24、将固化好的pdms从模板上取下，以得到下表面设置有微纳米通道的上层基片。

优选地，所述步骤b，包括：

b1、利用超纯水清洗一玻璃片，并利用氮气枪吹干；

b1、利用光刻工艺将电极形状转移到所述玻璃片上的指定位置，然后在所述指定位置依次沉积指定厚度的铬层和指定厚度的金层；其中，所述铬层作为粘附层，然后利用lift-off工艺去除不需要的铬和金层，得到带有金电极的玻璃片，最后利用划片机切割玻璃晶元，获得金电极玻璃基底。

优选地，所述步骤c，包括：

c1、将所述上层基片进行打孔设置试剂注入口及出口。

c2、将所述上层基片进行清洗：用50％的乙醇水溶液超声清洗10min，然后利用去离子水超声清洗10min，并利用氮气枪吹干；

c3、利用超纯水冲洗金电极玻璃基底，并利用氮气枪吹干；

c4、利用等离子体处理金电极玻璃基底和pdms亚微米流道进行对准键合，并且在键合之后，在90℃烘箱中烘烤30min增强键合质量，使其完全结合成整体，获取得到亚微米流道微流控芯片。

优选地，步骤a12所述在所述硅片上沉积指定厚度的psg薄膜之前，还包括：沉积指定厚度的氮化铝薄膜。以保护硅片。

优选地，所述低阻硅片为直径为10cm的圆形硅片；所述psg薄膜的厚度为300nm；所述su-8光刻胶的厚度为20μm。

优选地，所述体积比为3:1的a胶和b胶中的a胶体积为4.5ml，所述b胶为1.5ml；

所述体积比为10:1的a胶和b胶

中的a胶体积为30ml，所述b胶为3ml。

优选地，所述铬层的厚度为20nm，所述金层的厚度为120nm。

优选地，所述氮化铝薄膜的厚度为30nm。

优选地，步骤a13所述在所述psg薄膜上旋涂指定厚度的su-8光刻胶之前还包括：

利用食人鱼将a12处理后的沉积有氮化铝薄膜以及psg薄膜的硅基底浸泡5分钟；或者是利用氧气等离子体将a12处理后的沉积有氮化铝薄膜以及psg薄膜的硅基底进行处理。

综上所述，本申请提供的亚微米流道微流控芯片及其制作方法制作的亚微米流道微流控芯片可以实现具有接近纳米孔的检测灵敏度，同时还可以实现对质粒和细胞外泌体等生物大分子检测定量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为亚微米流道微流控芯片的设计图(俯视图)，放大区域为检测区域亚微米流道图形；

图2(a)-(h)为本申请实施例提供的pdms-玻璃亚微米流道微流控芯片加工流程示意图,(i)为本申请实施例提供的pdms-玻璃亚微米流道微流控芯片的结构示意图(剖视图)；

图3为本申请实施例提供的连接有电学检测装置的亚微米流道微流控芯片的示意图；

图4为本申请实施例提供的多个pdms-玻璃亚微米流道模板的示意图；

图5为本申请实施例提供的亚微米流道稳流控芯片制作方法的流程示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的区间。

实施例一

如图2中的(i),本申请提供一种亚微米流道微流控芯片，包括：

基底层21，其上表面设置有激励电极和第一检测电极；

上层基片22，其下表面设置有微纳米通道221，所述微纳米通道221中间一段通道宽度小于1微米且为凸起设置222；所述上层基片21的下表面与所述基底层22的上表面键合，其中，凸起设置的结构与所述基底层之间的间隙形成亚微米流道223；

其中，所述激励电极211和所述第一检测电极212分别位于所述亚微米流道223的两端且与所述微纳米通道221接触设置；

其中，所述上层基片还设置有与所述微流道相通的试剂注入口224及出口225。

其中，所述基底层上还设置有第二检测电极213(如图3所示)；

其中，所述第二检测电极213与微纳米通道212之间间隔一指定距离；

其中，所述第一检测电极212和所述第二检测电极213分别设置于所述激励电极211两侧。

本课题使用了不完全差分的3电极结构，具体形式如图1所示，中间电极为激励电极，最左边电极为检测电极一，最右边电极为检测电极二，在激励电极和检测电极一之间有亚微米尺寸的通道，而检测电极二并未与微纳米通道接触，检测电极二只用于消除外界的噪声干扰。读取检测电极一和检测电极二的差分信号，只测量亚微米通道处的信号，滤除噪声干扰，增加信噪比。

其中，所述基底层为玻璃材质制成基底层。所述上层基片为由pdms材质制成的上层基片。pdms是一种有机高分子聚合物，具有良好的光学透明性，在一般状态下被认为是无毒、惰性材料，其属于热固型材料，加工成型非常简单，其与玻璃或硅经过简单的等离子处理就可永久键和，现已经在微流控芯片制造中大规模应用。而玻璃具有良好的光学通透性，且为无毒性惰性材料，并具有良好的mems工艺加工兼容性，在微流控芯片制造中已有大量使用。本实验使用的pdms型号为道康宁184，玻璃材质为bf33浮法玻璃，玻璃厚度为400μm。

如图3所示本申请的芯片还包括检测系统，包括：

进样装置(图中未示出)，例如压力进样泵，用于利用气压将待测样本通入微流控芯片31，其可以快速、精确的控制气体压力，且本课题使用的压力进样泵型号为flugentmfcs-ez，其最大可以施加高达7000mbar的气体压力，该压力进样泵系统由三部分构成：气源、精密压力控制器和气液交换装置。气液交换装置是指在密闭的离心管中，出液管路在液面下方，气体在液面上方施加比较大且稳定的压力，驱动液体从出液管路中流出，气体压力可以达到7000mbar。在测试敏感区域为300nm高、1μm宽的亚微米通道微流控芯片时发现，待测溶液开始进入亚微米通道时需要的压力最大，可以达到1500mbar，当待测样本完全充满亚微米流道时，流道阻力下降，使用800mbar压力就可使待测液体持续通过。因此实验过程中需要通过光学辅助检测设备实时监控待测液体流动状态，当待测溶液充满流道时，调节气体压力，保证可以顺利进行。

前置电流放大器32，其信号输入端与所述基底层上设置的所述第一检测电极、第二检测电极分别连接；

阻抗频谱仪33，其包括，激励信号输出端、信号接收端和信号数据输出端；其中，所述激励信号输出端与所述激励电极连接；所述信号接收端与所述前置电流放大器的电流放大后的信号输出端连接；

控制装置34，其与所述阻抗频谱仪的所述信号数据输出端连接；

其中，所述激励电极与所述微纳米通道接触的一端通过电解液与所述第一检测电极连接，另一端接激励信号；

具体地，所述检测系统的工作原理为：通过进样装置将亚微米粒子溶液从样本入口212注入微流控芯片31的微纳米通道221中，通过检测区域时。激励电极连接由阻抗频谱仪33提供的激励信号；第一检测电极、第二检测电极将信号引入前置电流放大器32，经过放大的信号引入阻抗频谱仪33，通过阻抗频谱仪33进行信号解调，并获得差分信号；阻抗频谱仪33解调的信号传输给控制装置，同过该控制装置34进行信号分析处理、显示和存储。其中，所述控制装置，还用于控制阻抗频谱仪33的激励信号的发出。

其中，阻抗频谱仪选用苏黎世的hf2is阻抗频谱仪，其每个通道可以同时施加4个频率的激励信号，并可以同时读取解调，该阻抗频谱仪内置锁相放大器(lock-in)解调模块，其解调的检测信号具有较高的信噪比，可以读取纳安级的微弱信号。前置放大器采用苏黎世的hf2ta电流放大器，其将电流信号转换成电压信号并输出，在本课题中的放大倍率为10000倍。

为了将激励信号引入微流控芯片的激励电极，将微流控芯片的检测电极信号引入前置电流放大器，本课题制造了微流控芯片pcb转接板，将制造的微流控芯片电极使用定制的pcb转接板转出sma标准接口，以便于后期信号检测使用。

其中，微流控芯片pcb转接结构，其设置于所述亚微米流道微流控芯片检测电极和所述前置电流放大器两者之间，并分别与两者连接。具体提供了微流控芯片pcb转接结构：

所述微流控芯片的pcb转接结构，包括：pcb转接板和ipx转sma转接线；其中，所述ipx转sma转接线包括ipx接口和与其电学连接的sma接口；其中，所述pcb转接板的一端分别与所述亚微米流道微流控芯片的第一检测电极和第二检测电极的远离所述微纳米通道的一端通过金线焊接；所述pcb板卡的另一端与所述ipx接口连接；其中，所述sma接口与所述前置电流放大器连接；其中，所述pcb板的尺寸为5cm宽、6cm长；其中，所述pcb转接板上设置有光学窗口。该方案使用pcb转接板和ipx转sma转接线进行微流控芯片电极和前置电流放大器的电学连接。pcb板的整体尺寸为5cm宽、6cm长，非常便于携带，并且该pcb转接板带有光学窗口，可以适用于正置或者倒置显微镜，且显微镜不用进行任何改造。并且使用ipx接头将微流控芯片的信号引出，pcb板设计了7路信号引出接口，可以根据实验需要灵活安排，本课题使用了3路信号接口。ipx转sma转接线可以购买现有标准尺寸的转接线，无需自己制作，且质量有保证。为了减小外界噪声的干扰，pcb转接板进行了铺铜屏蔽，并将屏蔽层引出且与地线相连。因为本课题微流控芯片的电极需要使用金丝球焊机将电极和pcb转接板的焊盘进行连接，所以本课题尝试了不同材质的焊盘，分别为镀锡焊盘、裸铜焊盘和表面沉金焊盘。通过实验发现镀锡焊盘和裸铜焊盘在与金线连接时极不稳定，很难使用金丝球焊机将金线与焊盘连接，且与焊盘连接的金线极易脱落。表面沉金焊盘与金线连接稳定，可以很容易通过金丝球焊机将沉金焊盘和微流控芯片的金电极用金线连接。并且使用该方案进行电学测试时发现，噪音明显减弱，信噪比有所增加。

本实施例还提供光学辅助检测部分：由于亚微米流道检测区域尺寸非常小，最小的流道尺寸在亚微米级，需要借助光学显微镜才能观测到待测液体通过检测区域。在使用该微流控芯片的pcb转接结构进行实验时，因pdms-玻璃微流控芯片为透明材质，正置显微镜及倒置显微镜都可使用，但搭配倒置显微镜时检测区域图像更清晰。故实验搭配了倒置透射显微镜，物镜放大倍率为20倍时，明场下可以观测到待测液体通过微米通液通道，对电学检测进行辅助检测。

实施例二

如图5所示，基于实施例一的亚微米流道微流控芯片，本实施例中还提供一种亚微米流道微流控芯片的制作方法，包括步骤：

s501，制作下表面设置有微纳米通道的上层基片；其中，所述微纳米通道中间一段流道为宽度小于1微米且为凸起设置；具体地，包括：

s501.1，制作亚微米流道模板，包括：

s501.1.1、利用食人鱼和氢氟酸溶液清洗上表面抛光一低阻硅片，以去除所述硅片表面的沾污和杂质；其中，所述食人鱼为：浓硫酸和双氧水的混合溶液，其中所述浓硫酸:双氧水的体积比为3:1；其中，所述低阻硅片置于器皿的底部且覆盖所述器皿的底部；其中，所述低阻硅片为直径为10cm的圆形硅片。对应图2中的(a)

s501.1.2、在所述硅片上沉积指定厚度(例如300nm)的psg薄膜，并利用光刻工艺将掩膜版上的流道图形转移到psg薄膜上，并根据所述流道图形将所述psg薄膜上与所述微纳米通道的侧壁相对应位置处的psg刻蚀掉，以形成侧壁对应位置区域，剩余的psg材料构成的凸起，即为亚微米流道的模板，流道最小宽度小于1微米；其中，所述psg薄膜的厚度为亚微米流道的高度。对应图2中的(b)(形成侧壁对应位置区域的刻蚀见图4)。

s501.1.3、在所述psg薄膜上旋涂指定厚度(例如20μm)的su-8光刻胶，然后利用光刻机将掩模版上的通液流道图形转移到su-8光刻胶上，显影后得到中间一段设置为距离小于10微米且为凹陷设置，且所述微纳米通道的侧壁相对应位置处的su-8光刻胶被去除的模板，再将其在150℃下烘烤30min，以得到各层紧密结合的符合预设结构的亚微米流道模板。其中，所述su-8光刻胶的厚度加上psg薄膜的厚度之和为微纳米通道的高度。对应图2中的(c)(形成侧壁对应位置区域的刻蚀见图4)。

s501.1.4、利用硅烷化试剂(十七氟癸基三甲氧基硅烷)，对所述模板表面进行氟化处理。以降低模板表面和pdms的粘连，使后期固化的pdms更容易从模板上取下。

其中，s501.1.2的所述在所述硅片上沉积指定厚度的psg薄膜之前，还包括：沉积指定厚度的氮化铝薄膜。以保护硅基底在刻蚀psg时不被破坏。所述氮化铝薄膜的厚度为30nm。进一步地，s101.1.3所述在所述psg薄膜上旋涂指定厚度的su-8光刻胶之前还包括：利用食人鱼将a12处理后的沉积有氮化铝薄膜以及psg薄膜的硅基底浸泡5分钟，以增强其与su-8光刻胶的粘附性；或者是利用氧气等离子体将a12处理后的沉积有氮化铝薄膜以及psg薄膜的硅基底进行处理，以增强其与su-8光刻胶的粘附性。两个方法的作用机理是通过处理a12处理后的硅基底表面形成金属羟基，利用羟基和光刻胶的良好接触使光刻胶不脱落，但是在完成表面处理后，需要在1h内完成涂胶步骤，在2h内完成显影步骤，且在显影完成后冲洗时需要注意，不要用水枪直接冲洗，因为刚完成显影的su-8光刻胶比较脆弱，很容易受到外力损坏，冲洗时只需要放入水中浸泡10min即可，模板从水中取出后利用微弱氮气枪吹干。su-8光刻胶是热固型光刻胶，其坚膜步骤对增加光刻胶的稳定性、与硅基底的粘附性很重要，坚膜流程为150℃烘烤30min，坚膜后su-8光刻胶会和硅基底粘附在一起，且具有一定的机械强度。

s501.2，根据所述亚微米流道模板制作下表面设置有微纳米通道的上层基片。对应图2中的(d)包括：

s501.2.1、利用去离子水冲洗硅烷化处理的亚微米流道模板以去除其表面灰尘，且冲洗后利用氮气枪吹干；

s501.2.2、将体积比为3:1的a胶和b胶(其中，a胶和b胶为pdms胶的a胶和b胶)混合均匀之后倾倒在亚微米流道模板上，之后将其放入真空皿中，利用真空去除气泡，然后整体放入120℃烘箱中烘烤10h；其中，a胶为4.5ml，所述b胶为1.5ml；

s501.2.3、将体积比为10:1的a胶和b胶混合均匀之后倾倒在所述a22中所述烘烤10h之后的模板之上，并在80℃烘箱中烘烤2h；其中，a胶为30ml，b胶为3ml。

s501.2.4、将固化好的pdms从模板上取下，(若具有多用于制作亚微米流道的模板(如图4所示)则裁切下所需的固化好的pdms)以得到下表面设置有微纳米通道的上层基片。

s502，制作上表面设置有激励电极和第一检测电极的基底层；包括：

s502.1，利用超纯水清洗一玻璃片，并利用氮气枪吹干；对应图2中的(e)。

s502.2，利用光刻工艺将电极形状转移到所述玻璃片上的指定位置，然后在所述指定位置依次沉积指定厚度(例如20nm)的铬层和指定厚度(例如120nm)的金层。对应图2中的(f)。其中，所述铬层作为粘附层，然后利用lift-off工艺去除不需要的铬和金层，得到带有金电极的玻璃片，最后利用划片机切割玻璃晶元，获得金电极玻璃基底。

s503，将所述上层基片的下表面与所述基底层的上表面键合。对应图2中的(g)(h)。其中，所述凸起设置的结构与所述基底层之间的间隙形成亚微米流道；其中，所述激励电极和所述第一检测电极分别位于所述微纳米通道的两端且与所述微纳米通道接触设置；

其中，所述上层基片还设置有与所述微纳米通道相通的试剂注入口及出口；

其中，所述基底层上还设置有第二检测电极；

其中，所述第二检测电极与微纳米通道之间间隔一指定距离；

其中，所述第一检测电极和所述第二检测电极分别设置于所述激励电极两侧。

具体地，所述步骤s503，包括：

s503.1、使用打孔机将所述上层基片进行打孔设置试剂注入口及出口。

s503.2、将所述上层基片进行清洗：用50％的乙醇水溶液超声清洗10min，然后利用去离子水超声清洗10min，并利用氮气枪吹干；

s503.3、利用超纯水冲洗金电极玻璃基底，并利用氮气枪吹干；

s503.4、利用等离子体处理金电极玻璃基底和pdms亚微米流道进行对准键合，并且在键合之后，在90℃烘箱中烘烤30min增强键合质量，使其完全结合成整体，获取得到亚微米流道微流控芯片。

综上所述，本申请提供的一种亚微米流道微流控芯片及其制作方法，通过该亚微米流道微流控芯片以实现具有接近纳米孔的检测灵敏度，又可以实现对待测物的体积检测，同时还可以实现对质粒和细胞外泌体等生物大分子检测定量。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。