一种基于多孔介质乳化的液滴制备装置及方法

1.本发明涉及生化检测领域，尤其涉及一种基于多孔介质乳化的液滴制备装置及方法。


背景技术：

2.微液滴具有体积小、通量高、大小均一、内部稳定、可操控等优点被广泛应用于生物、化学检测分析、医疗诊断、理论计算、材料合成等领域。特别是高通量超快速的液滴生成技术在数字化pcr和单分子无扩增等绝对定量检测中已经成为poct的关键限制因数。传统的液滴生成是基于微流控芯片，这种液滴生成需要精密注射泵对通道中油相和水相流体流速进行严格的控制生成液滴，其操作需要精确控制。现有液滴方法仍然需要复杂的芯片结构设计，制作加工复杂，同样的，该装置也需要离心装置，难以微型化，不便于poct检测。值得注意的是，液滴生成都需要对芯片材料或者毛细管进行复杂的亲疏水处理，才能够让液滴摆脱一定的表面张力来完成液滴的制备。总之，基于现有液滴生成方式不可避免的结构复杂或操控难的缺点，不管是基于微振荡还是离心力方式的驱动力都严重制约了液滴poct检测中简单和便携式的需要。
3.现有技术也存在一些能够简单的就能够形成液滴的方法，例如振荡法，超声喷雾法等等。然而，这些方法产生的液滴存在变异系数(cv》60％)过大的特点，难以用在一些用液滴检测技术来进行数字定量的领域。
4.总而言之，现在的液滴生成技术难以满足简单、高效、快速而均一的特点。需设计一种结构简单，操作容易的基于疏水多孔介质乳化的超快大规模液滴制备和观察新装置及方法。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本技术提供一种基于多孔介质乳化的液滴制备装置及方法，有效解决了超高通量的液滴快速制备的微型化、便携化问题。
6.为达到上述技术目的，本技术采用以下技术方案：
7.第一方面，本技术提供一种基于多孔介质乳化的液滴制备装置，包括油包水液滴生成部及液滴分级部，油包水液滴生成部包括通道件、装载于通道件内的压缩海绵体、用以固定所述压缩海绵体于所述通道件内的固定件，液滴分级部为设有阶梯式狭缝通道的梯度夹层板组件，所述阶梯式狭缝通道设有若干喉部，所述梯度夹层板组件的两侧密封，油包水液滴生成部生成的液滴经移液器转移至液滴分级部进行分级排列。
8.优选地，梯度夹层板组件包括平板片、钝角弯折片、第一限位件、第二限位件，平板片的底部与钝角弯折片的底部贴合，第一限位件用于固定平板片顶部与钝角弯折片顶部，第二限位件用于固定平板片中部与钝角弯折片中部，梯度夹层板组件由顶部到底部形成的狭缝通道宽度梯度减小。
9.优选地，第一限位件及第二限位件为具有不同厚度的粘合件，第一限位件对应粘
合平板片顶部侧边与钝角弯折片顶部侧边，第二限位件对应粘合于平板片中部侧边与钝角弯折片中部侧边，第一限位件的厚度为50-500mm，第二限位件的厚度小于等于0.02mm。
10.优选地，第一限位件为粘合件，第二限位件为弹性紧固件，第一限位件对应粘合平板片顶部侧边与钝角弯折片顶部侧边，第一限位件的厚度为50-500mm，第二限位件缠绕平板片中部及钝角弯折片中部并按压固定以使得平板片中部与钝角弯折片中部之间形成小于等于0.01mm的狭缝。
11.优选地，压缩海绵体由聚酯海绵、pdms海绵、天然海绵中的一种或几种压缩而成，压缩海绵体的密度为5-100kg/m3。
12.优选地，通道件为漏斗状移液枪枪头、头部有梨形通道的移液枪枪头中的一种，通道件用以连接单通道移液器或多通道移液器。。
13.优选地，平板片及钝角弯折片的中部至底部均通过粗糙度改性或疏水性改性或所述平板片及钝角弯折片设有用于控制油相流动速度和路径的流道，所述流道的端部对接有油相的流动和容纳体积的储液槽；
14.优选的，由第二限位件中下部至底部限位所形成的毛细夹层的面积增大，可裁剪成任意形状。
15.第二方面，本技术提一种制备基于多孔介质乳化的液滴的方法，包括以下步骤：
16.s1.依次将油相、水相吸入油包水液滴生成部中，得到油包水液滴；
17.s2.将油包水液滴利用移液器转移至垂直放置的液滴分级部中，在重力和毛细管力作用下，进行自动分级排布；
18.油相为含有表面活性剂的矿物油、氟化油或者是脂肪烃类聚酯油相中的一种或几种。
19.优选地，油相中包括稳定剂。
20.优选地，在步骤s1之前，还包括向压缩海绵体浇灌正十六烷稀释的pdms，而后吹气、烘干。
21.本技术的有益效果如下：
22.1、操作极其简单，无需要传统的微流控的特殊的培训和经验，即可操作，生成便捷，无需高精密度进样泵的严格控制；
23.2、液滴生成速度超快，能满足ul-ml级别的液滴制作，完全拜托了溶液体积的限制，在30s即可完成50微升的超高通量液滴制备，而传统的液滴微流控需要至少五分钟以上，其仅能每秒约3000个液滴的制备速度；
24.3、液滴尺寸可调性，通过采用不同硬度的海绵能够有效的控制液滴的分布范围，操作简单，材料成本极低，制作方便，通量高，较为均一；
25.4、样品无死体积、节约样品，几乎所有的水相溶液都可以生成均一尺寸的液滴；
26.5、在本发明中，不仅可以使用大于水相密度的油相，还可以使用小于水相密度的油相，扩大了应用范围；
27.6、稳定性高，一旦确定所用多孔海绵介质和挤压程度，液滴大小将不会再变化；
28.7、可批量生产、结构简单、造价低；相比之下，微流芯片需要mems工艺生产、键合、封装、工艺复杂成本高；
29.8、该方法能够完全摆脱离心机或者注射泵的限制，结构小巧，造价低廉，非常适合
于poct检测应用；
30.9、更为重要的是，通过梯度夹层板，能够将高通量的液滴进行快速大规模的分级组装，极大的克服了产生的液滴大小相对变异大的问题，能够将液滴单层排布，相对均匀，能够满足单分子生化检测等数字化绝对定量等要求。
31.说明书附图
32.图1为基于多孔介质乳化的液滴制备装置的结构示意图；
33.图2为油包水液滴生成部的主视图(通道件为漏斗状移液枪枪头)；
34.图3为油包水液滴生成部的俯视图(通道件为漏斗状移液枪枪头)；
35.图4为油包水液滴生成部的主视图(通道件为头部有梨形通道的移液枪枪头)；
36.图5为液滴分级部的侧视图；
37.图6为海绵体未压缩的结构示意图(a)及压缩后的结构示意图(b)。
38.图中：1、油包水液滴生成部；2、液滴分级部；11、通道件；12、压缩海绵体；21、平板片；22、钝角弯折片；23、第一限位件；24、第二限位件。
具体实施方式
39.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
40.本发明针对现有的基于微流控芯片的液滴方法结构复杂，需要通过繁琐加工步骤实现微流体通道结构，芯片生产制作成本高昂，往往需要一些特殊的表面材料的疏水性处理、难以量产等问题，以及流体控制复杂、需要精密注射泵对通道内流体流速进行严格控制的缺点；以及现有公开或发表的离心式液滴生成微流控芯片，不能摆脱复杂的芯片设计和制造的问题，而且这些设备往往只能用于少量的液滴(～20微升)生成无法满足大量的液滴生成的过程，需要离心设备难以便携化等问题导致现有的液滴生成系统还难以实现简单的便携式应用，很难在poct检测中发挥作用，也难以用于大规模量产。
41.本技术通过在通道件11中填充挤压的多孔海绵状介质形成压缩海绵体12，然后依次吸取油相和水相，水相在多微孔介质中被高效切割成液滴，更为重要是，进一步构建了具有梯度狭缝的夹层板即梯度夹层板组件，能够将上述液滴在夹缝中进行分级排布，实现了结构简单无需额外复杂器件的液滴生产系统；该装置无需进行芯片的复杂设计，完全摆脱了传统微流控液滴系统中注射泵或者离心力和复杂加工制造设备的液滴制备限制，有效解决了超高通量的液滴快速制备的微型化、便携化问题；更进一步地，通过多通道的移液器排枪或者是自动化的高通量移液器能够实现超快的多样本液滴化处理，在高通量的数字化检测中具有关键作用。
42.基于以上，创立了本发明，具体内容如下：
43.如图1所示，本技术提供一种基于多孔介质乳化的液滴制备装置，包括油包水液滴生成部1及液滴分级部2，油包水液滴生成部1包括通道件11、装载于通道件11内的压缩海绵体12、用以固定所述压缩海绵体于所述通道件内的固定件，压缩海绵体12为多孔海绵装载在通道件11前端，通过挤压，将数十微米的多孔介质压缩成数微米的多孔介质后固定而形成，图6(a)压缩海绵体未压缩的结构示意图，图6(b)为海绵压缩后的结构示意图，固定件可
以为硅胶垫圈，为了防止压缩海绵移动，用硅胶圈进一步填充在海绵体后面，摩擦力对压缩海绵体进行固定，通过先抽吸油相，占据海绵介质后，再吸取水相，当水相穿过海绵孔隙时被高效分散成高通量油包水液滴，该过程重复两次即可完成液滴的高效制备；如图5所示，液滴分级部2为设有阶梯式狭缝通道的梯度夹层板组件，所述阶梯式狭缝通道设有若干喉部，所述梯度夹层板组件的两侧密封，两侧密封的方式可以为粘合或一体成型密封，便于检测观察，油包水液滴生成部1生成的将高通量液滴转移到梯度夹层板组件顶端开口处，通道件11中的油相和液滴在夹缝毛细管力和重力作用下迅速转移到梯度夹层板组件中，并在梯度夹层板组件毛细力作用下继续迁移，不同大小液滴在梯度夹层板组件中自主完成分级排布，能用于观察和检测。
44.综合现有的液滴形成方法可以知道，液滴形成需要一定的驱动力克服水的表面张力液体被流动的油相切割，并需要控制液滴的大小。而本发明通过多孔海绵介质的挤压，控制其出孔直径，进而很好的控制液滴形成的速度和粒径大小；通过通道件11的抽吸过程提供液滴生成的驱动力，完成液滴在含油相的多孔介质中高效快速分割，完成液滴的制备；通道件11抽吸过程可以用常用的专业移液器，也可以是推杆上有弹簧回弹的注射器等简易装置轻松制取；另外，梯度夹层板组件能够让形成的不同大小的液滴在毛细管力作用下自动分级，实现液滴生成过程超快速高通量和均一性的高效平衡。
45.本技术中的梯度夹层板组件包括平板片21、钝角弯折片22、第一限位件23、第二限位件24，平板片21的底部与钝角弯折片22的底部贴合，第一限位件23用于固定平板片21顶部与钝角弯折片22顶部，第二限位件24用于固定平板片21中部与钝角弯折片22中部，梯度夹层板组件由顶部到底部形成的狭缝通道宽度梯度减小，平板片21、钝角弯折片22的长宽比均约1:4，为有一定硬度的塑料或者玻璃片或为3d打印技术制成的封闭模具；第一限位件及第二限位件与平板片、钝角弯折片可以通过一体注塑成型的方式制备得到梯度夹层板组件；第一限位件及第二限位件与平板片、钝角弯折片也可以为分立结构，并通过粘合、压合、压制等方式组成梯度夹层板组件。优选地，梯度夹层板组件根据限位件的不同本方案提供包括结构：
46.1.第一限位件23及第二限位件24为具有不同厚度的粘合件，此时粘合件具有限位、粘合及支撑的作用，第一限位件23对应粘合平板片21顶部侧边与钝角弯折片22顶部侧边，第二限位件24对应粘合于平板片21中部侧边与钝角弯折片22中部侧边，粘合件可以为厚薄不同的双面胶，双面胶厚度和位置直接决定液滴在狭缝中的分离和分布位置，而底部紧密贴合，形成阶梯式的狭缝通道用于液滴的分级排列，将高通量液滴转移到具有高度梯度的夹层板中，不同大小液滴在夹层板中分级排布，用于均一性要求高的数字化绝对定量观察和检测，在本方案中，平板片21、钝角弯折片22均为玻片，第一限位件23的厚度为50-500mm，第二限位件24的厚度为0.01mm，双面胶面积大约1cm分布在玻片两侧，中间为毛细力通道，油相液体在重力和毛细管力的牵引下，油相和液滴都朝下迁移，经过不同高度的狭缝时，不同大小液滴在特定位置固定，从而实现液滴的快速排布；
47.2.夹板的中下段由于狭缝小，能够为液体流动提供额外的毛细泵吸力，能够快速让液滴完成梯度化的组装，该结构中，第一限位件23为粘合件，第二限位件24为弹性紧固件，第一限位件23对应粘合平板片21顶部侧边与钝角弯折片22顶部侧边，第一限位件23的厚度为50-500mm，第二限位件24缠绕平板片21中部及钝角弯折片22中部并按压固定以使得
平板片21中部与钝角弯折片22中部之间形成0.01mm的狭缝，例如，可以采用弹性橡皮带在夹板中间进行固定，橡皮经的弹力能够按压夹板在中间形成类似的分段阶梯夹缝。
48.压缩海绵体12由疏水性的聚酯海绵、pdms海绵、天然海绵中的一种或几种压缩而成，压缩海绵体12的密度为18-45kg/m3，压缩海绵体12通过其软硬和孔隙度的选择调节所生成液滴的大小，优选地，将海绵原料切割为3毫米的立方体，在通道内挤压约1mm大小的压缩海绵体12，并用橡皮圈抵住压缩的海绵体，固定在通道前端。
49.通道件11为漏斗状移液枪枪头、头部有微型的梨形通道的移液枪枪头中的一种，图2为通道件为漏斗状移液枪枪头时，油包水液滴生成部的主视图；图3为通道件为漏斗状移液枪枪头时油包水液滴生成部的俯视图；图4为通道件为头部有梨形通道的移液枪枪头时油包水液滴生成部的主视图；其中，更为具体的，头部有微型的梨形通道的移液枪枪头为尖端收口延伸约2mm，在离顶端1mm处含有3微型个0.5mm凸起或者是梨形肚，压缩海绵体12能被很好的固定在通道尖部，防止在抽吸过程中海绵的松动，通道件11用以连接单通道移液器或多通道移液器，过滤抽吸通过常规的多通道移液器或含有回弹弹簧的注射器连接，连接器能够连接多个过滤枪头，实现多个或者高通量的不同样品的快速样本液滴化生成，能够快速实现样本的高通量绝对定量检测，进一步实现自动化的液滴制备和检测；
50.平板片21及钝角弯折片22的中部至底部均通过粗糙度改性或疏水性改性，或平板片及钝角弯折片设有用于控制油相流动速度和路径的流道，该方案能够加快油相的毛细速度，能够强化油相液滴中液滴的分级排列速度，梯度夹层板组件底部设有储液槽，用以调整油相的容纳体积。
51.第二方面，本技术提一种制备基于多孔介质乳化的液滴的方法，包括以下步骤：
52.s1.依次将油相、水相吸入油包水液滴生成部1中，得到油包水液滴；
53.s2.将油包水液滴利用移液器转移至垂直放置的液滴分级部2中，进行自动分级排布；
54.油相为含有表面活性剂的矿物油、氟化油或者是脂肪烃类聚酯油相中的一种或几种；
55.在一些实施例中，油相中包括稳定剂。
56.在一些实施例中，在步骤s1之前，还包括向压缩海绵体12浇灌正十六烷稀释的pdms，而后吹气、烘干，固化可以进一步减少微小孔径的数量，增加液滴的均一性。
57.以下通过具体实施例对本技术进行进一步说明。
58.实施例1
59.一种基于多孔介质乳化的液滴制备装置，包括油包水液滴生成部1及液滴分级部2，油包水液滴生成部1包括通道件11、装载于通道件11内的压缩海绵体12，液滴分级部2为设有阶梯式狭缝通道的梯度夹层板组件，油包水液滴生成部1生成的液滴经移液器转移至液滴分级部2进行分级排列。
60.压缩海绵体12制作：压缩海绵体12由聚酯海绵、pdms海绵、天然海绵中的一种或几种压缩而成，压缩海绵体12的密度为5-100kg/m3，海绵具有的多孔结构能够在适当的挤压下，变成致密的特定孔隙分布的微型通道，当其充满油相液体后，引入水相时，能够将水高效的切割成特定的油包水的液滴，通过不同软硬条件的海绵，可以控制压缩的松紧程度，构建不同大小孔隙的介质，进而调控生成的液滴的大小，用于压缩的海绵原料的大小优选的
为3mm的球形或者立方形；
61.油包水液滴生成部1组装：通道件11用于固定压缩海绵、抽吸和储存油相和/或水相液体的管道，通道件11为漏斗状移液枪枪头、头部有梨形通道的移液枪枪头中的一种，头部有梨形通道的移液枪枪头尖端收口延伸约2mm，在离尖端1mm处含有3微型个0.5mm凸起，3mm立方形海绵在通道内挤压成1mm的海绵，能被三个凸起点很好的固定在通道尖部，防止在注射器抽吸过程中海绵的松动；
62.油包水液滴生成部1组装完成后，用单通道或多通道的注射器或者是移液枪，固定装载有海绵的枪头，优先抽吸油相充满多孔介质，然后将枪头移至油水界面或者水溶液中，继续缓慢抽吸，水溶液在油相的保护下，穿透孔隙介质而被分散为高通量的液滴，为了进一步均一化液滴，可以重复抽推两次即可。
63.梯度夹层板组件的制作：为了消除液滴的在观察时候的不均一性，利用梯度夹层板组件对产生的液滴进行分选，梯度夹层板组件包括平板片21、钝角弯折片22、第一限位件23、第二限位件24，平板片21的底部与钝角弯折片22的底部贴合，第一限位件23用于固定平板片21顶部与钝角弯折片22顶部，第二限位件24用于固定平板片21中部与钝角弯折片22中部，梯度夹层板组件由顶部到底部形成的狭缝通道宽度梯度减小，平板片21、钝角弯折片22的长宽比均约1:4，为有一定硬度的塑料或者玻璃片或为3d打印技术制成的封闭模具；第一限位件23及第二限位件24为具有不同厚度的粘合件，此时粘合件具有限位、粘合及支撑的作用，第一限位件23对应粘合平板片21顶部侧边与钝角弯折片22顶部侧边，第二限位件24对应粘合于平板片21中部侧边与钝角弯折片22中部侧边，粘合件可以为厚薄不同的双面胶，双面胶厚度和位置直接决定液滴在狭缝中的分离和分布位置，而底部紧密贴合，将夹层板支撑形成梯度夹层形成一定的毛细力梯度用于液滴的分级排列，将高通量液滴转移到具有高度梯度的夹层板中，不同大小液滴在夹层板中分级排布，用于均一性要求高的数字化绝对定量观察和检测，在本方案中，第一限位件23的厚度为50-500mm，第二限位件24的厚度为0.01mm，双面胶面积大约1cm分布在玻片两侧，双面胶之间间隔约2mm，可以设置1个或者多个喉舌通道，油相液体在重力和毛细管力的牵引下，油相和液滴都朝下迁移，经过夹板的中下段毛细管通道后，油相继续向下迁移，不同大小液滴经过不同高度的狭缝时，在特定位置固定，从而实现液滴的分选。
64.一种制备基于多孔介质乳化的液滴的方法，包括以下步骤：
65.s1.采用高/中/低密度(45kg/m3，30kg/m3，18kg/m3)的海绵未填充材料，制作液滴；通道件11选择为0.25ml点胶枪头，将海绵切割成3mm的立方体，填充进入枪头顶部，不宜过度挤压，以到底即可，因为底部为漏斗状界截面直径约为1mm，此时海绵挤压约为1mm大小，得到油包水液滴生成部1；
66.利用油包水液滴生成部1制作油包水液滴过程如下：取30微升液体，在pcr管中，然后取80微升氟化油相进行覆盖，用枪头先吸取油相，然后吸取水相，水相经过油相填充的孔隙介质，完成液滴的制备，为了克服抽吸手法的差异，可以重复两～3次抽吸过程，一分钟内完成液滴的制备；
67.s2.将多个过滤通道件11安装在能够多个抽吸通道的移液器上，包括8、16、32、96通过移液器，将油包水液滴利用移液器转移至垂直放置的液滴分级部2中，进行自动分级排布，以在96孔板中进行8、16、32、96个样本的液滴化的处理，实现了样本的超快速大规模的
处理。
68.实施例2
69.其他内容与实施例1相同，所不同的是，第一限位件23为粘合件，第二限位件24为弹性紧固件，第一限位件23对应粘合平板片21顶部侧边与钝角弯折片22顶部侧边，第一限位件23的厚度为50-500mm，第二限位件24缠绕平板片21中部及钝角弯折片22中部并按压固定以使得平板片21中部与钝角弯折片22中部之间形成0.01mm的狭缝，例如，可以采用弹性橡皮带在夹板中间进行固定，橡皮经的弹力能够按压夹板在中间形成类似的分段阶梯夹缝。
70.实施例3
71.其他内容与实施例1相同，所不同的是，还包括将平板片21及钝角弯折片22的中部至底部均通过流道和储液槽的设计，进一步通过粗糙度改性或疏水性改性，可以增加液滴组装的速度和更大的液滴体积的组装。
72.实施例4
73.其他内容与实施例1相同，所不同的是，油相采用月桂酸乙酯代替，并添加7％的em180作为液滴稳定剂，将形成的油包水液滴铺展在梯度夹层板组件中，可明显改善液滴大小的变异系数，形成均一的粒径分布梯度变化的液滴阵列。
74.实施例5
75.其他内容与实施例1相同，所不同的是，步骤s1中，还包括将海绵加载在通道件11中，然后通过正十六烷稀释的pdms和固化剂混合试剂浇灌海绵介质，让海绵中的极细孔隙填充pdms，除大孔隙中的pdms，然后在65℃烘干，获得粒径更加均匀的孔隙介质，并且固化的pdms能够对海绵在通道件11中起固定作用，简化了海绵固定的控制。
76.实施例6
77.其他内容与实施例1相同，所不同的是，将液滴形成部和分级部通过一体成型制作方式整合在一块平板上，分级部底端包含抽吸嘴。同样的，通过抽吸过程产生液滴，然后将抽吸嘴密封，将在通道件中形成的液滴倒置，在重力作用下液滴灌满分级部并组装，完成液滴生成和一体化组装观察。
78.以往的液滴制备往往只能够满足少量液滴的制备，其进样量受到芯片上进样体积限制，而即使是通过注射泵也不能满足液滴灵活大规模制备的需求。本发明无需进行注射泵精确导入，而是通过抽吸过程，水相在挤压的毛细管中流动剪切形成液滴，其抽吸速度对液滴形成的影响较小，极大的克服了液滴生成过程的专业性，操作简便；通过简单的手动或者自动化电机控制注射抽吸过程能够灵活地控制液滴制备的速度、数量和溶液的体积和溶液类型，适合于更大规模的液滴制备。制备过程中，液滴存在明显的大小不均一问题，影响了液滴的观察和定量，我们通过梯度夹板实现了液滴的分级组装，可以通过油相的流动进行有效地不同液滴大小的分级收集和观察。
79.以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。