一种用于核酸纯化的纳米磁珠的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及材料科学领域，特别设及一种用于核酸纯化的纳米磁珠。
【背景技术】
[0002] 近年来，纳米磁珠(简称磁珠)越来越受到人们的青睐，现已广泛用于细胞分离、酶 的固定、核酸纯化等多个领域。磁珠是指通过物理学、化学或生物学等方法将磁性无机粒子 与有机高分子特异性结合形成的具有一定磁性及特殊结构的复合高分子微球。磁珠法是先 通过裂解细胞，将游离出来的核酸分子特异性吸附到磁性颗粒表面，同时使蛋白质等杂质 留在溶液中。而后在磁场作用下，磁性颗粒与液体分开，弃除液体后再经洗脱即可得到纯净 的核酸。相较于其他传统提取核酸的方法，使用磁珠提取核酸具有无法比拟的独特优势。主 要表现在磁珠提取核酸的高效性、高特异性、高稳定性。此外，磁珠简便通用，可直接从血 液、组织等多种样本中快速提取核酸，且成本低廉，便于广泛应用。使用磁珠法提取核酸，步 骤简单，无需离屯、，且能有效去除大多数干扰PCR等后续反应的抑制因子，如蛋白质、多糖类 物质，降低假阴性率，提高核酸提取的纯度与精度，保证检测结果的真实可靠。
[0003] 目前用于核酸提取的磁珠多种多样，较常采用的有金属合金如铁、儀等、氧化铁、 铁氧体等。它们通过在磁珠表面包裹不同的活性功能基团，使其具有吸附核酸的功能。用于 核酸提取的磁珠主要分为簇基磁性微球、氨基磁性微球、二氧化娃磁性微球等。二氧化娃磁 性微球吸附核酸的原理与传统固相娃类介质相同，可W在特定的pH及盐离子浓度下有效吸 附核酸，所得到的核酸完整性好，纯度高。
[0004] W上充分说明了磁珠在提取核酸方法中将占有越来越重要的地位。但是在现有技 术中，核酸纯化试剂市场操作复杂，工艺落后，市场上销售的磁珠存在不稳定，表面基团修 饰不完全，需要有机溶剂分散，颗粒不规则，吸附率量小，自动化程度低的缺点。因此如何保 证磁珠可W充分发挥性能，有效完全的吸附核酸成为亟待解决的重要问题。
【发明内容】
[000引本发明要解决的技术问题是针对现有的磁珠存在不稳定，表面基团修饰不完全， 需要有机溶剂分散，颗粒不规则，吸附率量小，自动化程度低的缺点，提供了一种分散性好， 成本低，颗粒均一性好，磁珠大小可控性强的用于核酸纯化的纳米磁珠。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明的一个方面所提供的技术方案为：
[0007] -种用于核酸纯化的纳米磁珠，所述纳米磁珠由W下步骤制备而成：
[000引步骤A)纳米微球的制备：
[0009]在氣气保护下，在含有13~17g硫酸亚铁屯水合物和8~12g^氯化铁六水合物的 水溶液中，每间隔10分钟滴加1ml 0.4M~0.6M氨氧化钢溶液；当反应溶液变为胶状乳浊液 时，每间隔20分钟滴加1ml 0.2M~0.3M氨氧化钢溶液，摇床持续摇匀，摇床速度100转/分 钟，待出现磁性后，继续在氣气保护下反应4~10小时;随后在所得溶液中加入氯化钢，使氯 化钢终浓度为0.5M~1M;室溫静置18~36小时后使用去离子水漂洗至溶液pH为7;再使用 ο. 2M~ο. 3M的氨氧化钢溶液配成磁珠体积百分比为20 %~40 %的磁珠悬液，即得；
[0010] 步骤B)通过表面修饰制备纳米磁珠：
[0011] 将步骤A)所得磁珠悬液在50°C~60°C条件下通入氣气并均匀揽拌;加入60g九水 娃酸钢揽拌至完全溶解，每3min滴加0.5ml冰乙酸，摇床持续摇匀，摇床速度100转/分钟，揽 拌化；当pH值为6~別寸，使用3倍于所述磁珠悬液体积的0.3M氯化钢溶液漂洗5次，再使用 0.3M氯化钢溶液配制成磁珠体积百分比为20 %~40 %的磁珠悬液;在得到的磁珠悬液中加 入30g PEG-1750，摇床持续摇匀，摇床速度100转/分钟，揽拌24h;使用3倍于所述磁珠悬液 体积的0.3M的氯化钢溶液漂洗5次;再使用0.3M氯化钢溶液和叠氮钢配制成磁珠体积百分 比为40 % -60 %的磁珠悬液，即得所述纳米磁珠。
[0012] 本发明提供的一种用于核酸纯化的纳米磁珠是在水相反应中修饰制备而成，其不 仅适应性广，能用于多种核酸纯化样本的纯化，而且分散性好，成本低，颗粒均一性好，磁珠 大小可控性强。
[0013] 本发明用于核酸纯化的纳米磁珠是根据W下式I制得：
[0014]
[0015] 在本发明的步骤A)中，当含有13~17g硫酸亚铁屯水合物和8~12g^氯化铁六水 合物的水溶液中溶液变为胶状乳浊液时，应改变滴定的间隔时间，并且每间隔20min滴加 1ml的0.2M~0.3M氨氧化钢溶液，直至颗粒出现，从而通过不同的滴定量可W得到不同大小 的纳米微球。
[0016] 作为优选，步骤A)所述含有硫酸亚铁屯水合物和Ξ氯化铁六水合物的水溶液的溶 剂为脱氧去离子水，运样能够有效防止二价铁离子被氧化。
[0017] 作为优选，，步骤A)所述含有硫酸亚铁屯水合物和Ξ氯化铁六水合物的水溶液中 硫酸亚铁屯水合物的质量为15g，^氯化铁六水合物的质量为lOg。
[0018] 作为优选，步骤A)所述使用0.2M~0.3M氨氧化钢溶液配成的磁珠悬液中磁珠体积 百分比为30%。
[0019] 在本发明中，发明人通过直接使用去离子水溶解硫酸亚铁屯水合物及Ξ氯化铁六 水合物，在不改变离子环境的前提下，为后续操作提供液体的反应环境，并且通过控制碱性 溶液的滴定量可W得到不同大小的纳米微球。同时，氯化钢的使用可W增加液体中的离子 浓度，使磁珠获得良好的悬浮性及分散性。同时防止细菌的滋生及有效去除磁珠悬液中的 蛋白。
[0020] 在本发明的步骤B)中，发明人同样在水相条件下对步骤A)得到的纳米微球进行表 面修饰。首先，在50°C~60°C条件下进行反应，可加快反应速度，缩短磁珠表面修饰时间。
[0021] 作为优选，步骤B)所述通入氣气并均匀揽拌是在55Γ条件下进行的。
[0022] 作为优选，步骤B)中所述滴加酸性溶液过程中可W通过控制所述酸性溶液的加入 量，得到不同修饰程度的表面修饰颗粒。
[0023] 作为优选，步骤B)中使用0.3M化C1及叠氮钢配制成50%磁珠悬液，运样可W增加 液体中的离子浓度，使磁珠获得良好的悬浮性及分散性。同时防止细菌的滋生及有效去除 磁珠悬液中的蛋白。
[0024] 本发明的另一个方面是提供了一种核酸纯化试剂盒，该试剂盒包含上述过程制备 的纳米磁珠。
[0025] 本发明的有益效果为：
[0026] 本发明通过水相反应得到一定大小的生物磁性微球，在其表面引入能吸附核酸的 基团，利用二氧化娃带电性吸核酸的性质，能高效纯化多种复杂样品，从而实现核酸纯化的 自动化，大大减少工作人员的工作量。并且本发明纳米磁珠具有分散性好，成本低，颗粒均 一性好，磁珠大小可控性强的特点，能有效用于诊断试剂前期纯化W及临床核酸检测，在测 序领域、生物磁性微球祀向治疗、生物医药开发领域有着广泛的应用前景和社会经济效益。
【附图说明】
[0027] 图1为本发明实施例1制备的纳米磁珠的电镜图；
[0028] 图2为利用实施例1制备的纳米磁珠进行核酸纯化后进行皿V DNA的实时巧光定量 PCR检测结果图；
[0029] 图3为分别利用本发明和市售纳米磁珠进行核酸纯化后进行皿V DNA的实时巧光 定量PCR检测结果对比图。
【具体实施方式】
[0030] 本发明公开了一种用于核酸纯化的纳米磁珠，本领域技术人员可W借鉴本文内 容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员 来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内 容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发 明技术。
[0031] 在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术 人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
[0032] 本发明中使用的术语"磁珠"，是指磁性微球(简称磁珠），现已广泛用于细胞分离、 酶的固定、核酸纯化等多个领域。
[0033] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对 本发明作进一步的详细说明。
[0034] 实验材料与仪器
[0035] W下实施例中所使用的化学试剂均为市售分析纯试剂。
[0036] W下实施例中所用的PCR扩增仪器为上海宏石医疗科技有限公司生产的实时巧光 定量PCR仪。
[0037] 实施例1:用于核酸纯化的纳米磁珠的制备 [003引步骤A)纳米微球的制备：
[0039]在氣气的保护下，在含有15g硫酸亚铁屯水合物和lOg^氯化铁六水合物的水溶液 中每间隔10分钟滴加1ml 0.5M的氨氧化钢溶液。当反应溶液变为胶状乳浊液时，每间隔20 分钟滴加1ml的0.25M的氨氧化钢，摇床持续摇匀，摇床速度100