一种交联红松籽源抗氧化肽磁性微球及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农产品精深加工及其副产物综合应用技术领域，具体涉及一种交联红松籽源抗氧化肽磁性微球及其制备方法。
【背景技术】
[0002]磁性高分子微球简称为磁性微球。它是通过物理或化学方法将磁性物质与高分子物质复合而形成的具有一定磁性或特殊结构的材料。常用的磁性物质主要有铁酸盐、纯铁粉、Fe3O4等，其中Fe3O4得到最广泛的应用。磁性微球不仅可以通过表面改性等化学反应在其表面引入多种反应性功能基团，也可以通过共价键等方式结合酶、抗体等生物活性物质，在外加磁场作用下进行快速运动及分离，因此其能够在精细化工、食品、细胞学等领域表现出较好的前景。近年来研究适用于各个领域的磁性微球已经成为各专家、学者研究的一个热点。
[0003]自70年代中期以来，磁性高分子微球作为新型功能高分子材料，不但在细胞分离、亲和色谱、核酸研究、固定化酶等领域得到了广泛研究，而且在有机和生化合成、环境、食品微生物检测等方面的应用研究也日益增多。目前，磁性微球的合成方法主要有:包埋法、单体共聚法、化学转化法、共沉淀法和硅烷化法等。这些方法大都条件严苛，步骤繁琐，能耗大且成本高。
[0004]目前，磁性微球作为靶向给药广泛应用于各个领域，大多是结合抗癌药物，而其结合抗氧化活性肽的关键技术亟待攻克。通过将磁性微球与抗氧化肽进行交联，在外加磁场的作用下，在体内进行定向移动靶向给药，实现磁性微球与肽的分离，操作简便，分离方法远高于其他常规方式，并且具有控制可持续释放等多种作用。因此，一种结合抗氧化肽的的磁性微球技术亟待攻克。
[0005]红松籽为红松的种子，含人体必需的8种氨基酸，含有的氨基酸种类较齐全，其中谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸含量较高，对人体机能调节具有重要作用。与国际卫生组织规定的人体氨基酸标准比较，红松籽在大多数指标上符合标准，各种氨基酸组成均衡。并且，其含有不饱和脂肪酸、磷脂等活性成分，具有提高机体免疫力，防止血脂沉积，降低胆固醇，预防动脉粥样硬化，抗衰老，抗疲劳，抗辐射以及减肥的作用。红松籽是一种良好的植物蛋白资源，目前大多数研究仅限于其榨油的功效，其产品也多为干果饮料等形式。随着生活水平的提高，越来越多的人开始关注其含有的丰富蛋白资源。研究发现，其肽粉具有良好的抗氧化活性，可通过清除自由基和抑制脂质过氧化，调整和改善人体生理功能，从而达到预防和治疗慢性疾病的目的。
[0006]复合多肽磁性微球是指多肽为材料制备的表面连接有特殊功能基团的磁性高分子微球。由于磁性微球可直接或间接地与生物大分子进行交联，并且其在外加磁场的作用下对目标物质能进行有效富集、分离、回收和再利用，因此在生物学领域有着广泛的应用。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种磁性良好、制备方法简便、成本低的交联红松籽源抗氧化肽磁性微球及其制备方法。
[0008]本发明提供一种交联红松籽源抗氧化肽磁性微球的制备方法，其步骤如下:
[0009]1)、在三颈瓶中加入摩尔浓度为I?5mol/L的对苯二酚100?200mL，搅拌均匀后依次滴加I?5mL、质量分数35?40 %的盐酸水溶液和1?20mL、质量分数30?50 %的甲醛水溶液;然后升温到70?80°C搅拌下反应I?2h，自然冷却至室温，用缓冲液洗涤至中性，抽滤，除去滤液，将滤渣真空冷冻干燥后研磨得到凝胶；
[0010]所述缓冲液为混合磷酸盐、Tri S-HCl、甘氨酸-氢氧化钠中的一种；
[0011]所述真空冷冻干燥，是将滤渣分装于冷冻盘中，厚度5?15_，置于预冻温度为-75°C?-80°C冷冻库中，预冻时间为5?6h后;然后再移至真空冷冻干燥机中，温度设定为-600C?-500C，冻干时间为10?24h，研磨后即获得凝胶；
[0012]2)、以步骤I)所得凝胶、硫酸铁、硫酸亚铁为原料制备四氧化三铁磁性微球；
[0013]将30?5011^、摩尔浓度0.1?0.311101/1的硫酸亚铁溶液和10?301^、摩尔浓度0.1?0.3mol/L的硫酸铁溶液混合，混合均匀后加入I?5g的步骤I)制备的凝胶，然后升温至60?80 0C，再滴加NaOH溶液使反应体系pH> 11，反应I?2h后，自然冷却至室温，用稀盐酸中和至中性，抽滤，除去滤液，将滤渣真空冷冻干燥后研磨得到四氧化三铁磁性微球；
[0014]所述真空冷冻干燥过程，是指将上述滤渣分装于冷冻盘中，厚度5?15mm，置于预冻温度为-75°C?-80°C冷冻库中，预冻时间为5?6h后，然后移至真空冷冻干燥机中，温度设定为-60 °C?-50 °C，冻干时间为1?24h，即得四氧化三铁磁性微球；
[0015]3)、以红松籽源抗氧化肽、步骤2)制备的四氧化三铁磁性微球为原料，以甲醛、戊二醛、双醛淀粉或环氧化合物为交联剂，经过真空冷冻干燥制备出多肽载量为90.3?116.7mg蛋白/g的交联红松籽源抗氧化肽磁性微球，粒径范围为473nm?1.1ym；该交联红松籽源抗氧化肽磁性微球外观呈黑色，具有磁响应性。
[0016]向0.1?0.5g四氧化三铁磁性微球中加入10?20mL、浓度I?2mg/mL、分子量为3?1kDa的红松籽源抗氧化肽(参考专利号:201310513028.0，专利名称:一种以红松籽柏为原料制备免疫活性肽的方法)水溶液，搅拌均匀后滴入10?20mL、质量分数I %?10%的交联剂水溶液，于20?300C摇床恒温交联，I?6h后停止震荡，微球溶液用缓冲溶液洗涤至洗涤液中无肽，将微球溶液真空冷冻干燥后得交联红松籽源抗氧化肽磁性微球；
[0017]所述的真空冷冻干燥过程，是指将该溶液分装于冷冻盘中，厚度5?15mm，置于预冻温度为-75°C?-80°C冷冻库中，预冻时间为5?6h后，移至真空冷冻干燥机中，温度设定为-60°C?_50°C，冻干时间为10?24h，即得到交联红松籽源抗氧化肽磁性微球；
[0018]所述缓冲液为混合磷酸盐、Tris-HCl、甘氨酸-氢氧化钠中的一种。
[0019]本发明的技术优势主要体现在以下方面:
[0020]第一，本发明是以磁性微球技术为核心技术，其技术优势突出体现在:
[0021](I)其可在外加磁场的作用下对目标物质进行有效的富集、分离、回收和再利用；
[0022](2)在体内进行定向移动靶向给药，实现磁性微球与肽的分离，操作简便。
[0023]第二，本发明是以3?1kDa、DPPH清除率为80%以上的红松籽源抗氧化肽组分为磁性微球交联对象，具有来源广泛，原料成本低廉，适于红松籽的副产物增值增效技术应用。
[0024]第三，本发明工艺路线简捷，设备投入少，工业化推广可行，是一种红松籽综合利用和减少污染的有效方法。
【附图说明】
[0025]图1:实施例2通过纳米粒度仪测得磁性微球粒径分布示意图。
【具体实施方式】
[0026]实施例1
[0027]制备凝胶状树脂:在三颈瓶中，加入摩尔浓度为lmol/L的对苯二酚10mL，用电动搅拌器搅拌均匀后依次滴加3mL、质量分数35%的盐酸水溶液和10mL、质量分数为40%的甲醛水溶液。升温到80°C后搅拌下反应1.5h，自然冷却至室温，用混合磷酸盐缓冲液洗涤至中性，抽滤，除去滤液，将滤渣分装于冷冻盘中，厚度5mm，置于预冻温度为-78°C冷冻库中，预冻时间为6h后，移至真空冷冻干燥机中，温度设定为-50°C，冻干时间为10h，研磨即制得凝胶。
[0028]制备四氧化三铁磁性微球:将硫酸亚铁水溶液和硫酸铁水溶液进行混合，加入2g上述制备的凝胶，升温至70°C后，滴加0.lmol/L的NaOH调节反应体系的pH= 12，反应1.5h后，自然冷却至室温，用0.lmol/L稀盐酸中和至中性，抽滤后除去滤液，将滤渣分装于冷冻盘中，厚度15mm，置于预冻温度为-78°C冷冻库中，预冻时间为6h后，移至真空冷冻干燥机中，温度设定为_58°C，冻干时间为20h，研磨后得到四氧化三铁磁性微球。
[0029]其中硫酸亚铁、硫酸铁水溶液摩尔浓度均为0.lmol/L，硫酸亚铁水溶液的体积为30mL，硫酸铁溶液的体积为10mL。
[0030]制备交联红松籽源抗氧化肽磁性微球:0.5g四氧化三铁磁性微球中加入15mL、浓度为2mg/mL分子量为3?1kDa的红松籽源抗氧化肽水溶液，搅拌均匀后滴入15mL、质量分数I %的戊二醛水溶液，于27°C摇床恒温交联，Ih后停止震荡，将溶液用混合磷酸盐缓冲溶液洗涤至洗涤液无肽液洗出，将该溶液分装于冷冻盘中，厚度12mm，置于预冻温度为-78°C冷冻库中，预冻时间为6h后，移至真空冷冻干燥机中，温度设定为-56°C，冻干时间为21h，即得交联红松籽源抗氧化肽磁性微球，用双缩脲比色法检测其肽含量，蛋白载量为97.7mg蛋白/g微球，运用纳米粒度仪测得粒径范围为5 31 nm?9 2 7nm。
[0031]实施例2
[0032]制备凝胶状树脂:在三颈瓶中，加入摩尔浓度为2mol/L的对苯二酚120mL，用电动搅拌器搅拌均匀后后依次滴加lmL、质量分数36%的盐酸水溶液和15mL质量分数为30%的甲醛水溶液。升温到70°C后搅拌下反应lh，自然冷却至室温，用混合磷酸盐缓冲液洗涤至中性，抽滤后除去滤液，将滤渣分装于冷冻盘中，厚度15mm，置于预冻温度为-75°C冷冻库中，预冻时间为6h后，移至真空冷冻干燥机中，温度设定为-58°C，冻干时间为20h，研磨即制得凝胶。
[0033]制备磁性磁性微球:将硫酸亚铁、硫酸铁溶液进行混合，加入5g上述制备的凝胶，升温至60°C后，滴加0.lmol/L的NaOH调节反应体系的pH = 13，反应2h后，自然冷却至室温，用0.lmol/L稀盐酸中和至中性，抽滤后除去滤液，将滤渣分装于冷冻盘中，厚度12mm，置于预冻温度为_75°C冷冻库中，预冻时间为5h后，移至真空冷冻干燥机中，温度设定为-60°C，冻干时间为1h，取样研磨备用。
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