专利名称：适用于克百威残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种适用于克百威残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，主要适用于用该试剂盒快速测定大批量蔬菜、水、土壤、中毒等环境、食品等样品中的克百威残留。
背景技术：
农药及其代谢物传统的残留分析方法主要是依靠气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、质谱(MS)等物理化学分析手段，但由于农药使用规模不断扩大，农药残留造成环境影响和人类健康的慢性和长期效应日益受到人们关注和担忧，对农药残留的限制也越来越严格，对分析测定对象、种类、数量、范围、指标等诸方面都提出了新的要求和更高的标准，但传统的理化分析方法通常繁琐复杂，样品前处理过程复杂，工作量大，仪器昂贵，并要求有熟练的技术人员及较长的分析周期。因此人们迫切希望有一种简单，快速，灵敏及廉价的检测技术能在野外和实验室内进行大批量的筛选试验。免疫分析法正具备这些优点，所以尽管免疫分析用于农药残留分析的时间很短，但已很快用于环境样品和食品中农药残留的分析。
克百威(Carbofuran，2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基-N-甲基氨基甲酸酯，商品名呋喃丹)，自1969年由FMC公司和Mobay化学公司开发生产后即作为一种高效和、广谱的杀虫、杀线虫剂，在世界范围内广泛应用于粮食、蔬菜、水果及经济作物的害虫防治。但是由于克百威的毒性大，在酸性土壤中不易降解，极易污染土壤和地下水源。近年来，由于克百威造成的环境生物毒害，屡见不鲜。尤其是在作物和蔬菜上的大量使用，对人体健康造成极大的危害，这已引起人们的关注。因此，开发一种简单快速，适用于农药残留现场监控的痕量分析方法具有重要的现实意义。
检测克百威残留量常规方法有气相色谱法和高效液相色谱法。由于克百威在象其它大多数N-甲基氨基甲酸酯农药一样具热不稳定性，在一般的气谱操作条件下易降解成酚类。虽然这些问题可通过改变操作条件]或将农药衍生化来解决，目前指定的检测N-甲基氨基甲酸酯类农药的较灵敏的方法是用带荧光检测器的HPLC柱后衍生化法(EPA方法531.1)。然而该方法的灵敏度受样品的净化、浓缩、衍生化等步骤的影响很大。再者该方法需要大多数实验室所不具备的复杂的仪器(如荧光检测器)，且过程繁琐，不适合大批量样品的检测与分析。免疫分析为克百威的残留检测提供了一个新的分析检测途径。目前已有克百威免疫分析方法的报道，但要将免疫分析方法运用到实际中，还需要将其研制成试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精确度、操作方法简单快速，并能用于大批量样品快速检测的适用于克百威残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒。
它包括盒体、设在盒体内的96孔/40孔酶标板和设在盒体内的试剂，其特征在于，在酶标板的每孔内，由包被液包被能与抗克百威抗体特异性结合反应的包被抗原，并用1.0～3.0％脱脂奶粉进行封闭，盒内试剂包含洗涤液、底物稀释液、克百威标准溶液、抗克百威抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体、底物、显色物质和反应终止液。
本发明的优点是能用于水、土壤、蔬菜、中毒样品中克百威残留的检测，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大批量的样品，样品检测成本远低于传统的检测方法。试剂盒采用强特异性、高效价的抗体，提高检测的灵敏度、准确度、精密度。试剂盒的保存期超过6个月。本发明简单快速，适用于农药残留现场监控的痕量分析方法具有重要的现实意义。
附图是克百威标准曲线图。
具体实施例方式
本发明是一种适用于克百威残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，它基于免疫反应和酶促反应，能够检测水、土壤、蔬菜、中毒样品中克百威的残留。它包括盒体、设在盒体内的96孔/40孔酶标板和设在盒体内的试剂，其特征在于，在酶标板的每孔内，由包被液包被能与抗克百威抗体特异性结合反应的包被抗原，并用1.0～3.0％脱脂奶粉进行封闭，盒内试剂包含洗涤液(稀释液)、底物稀释液、克百威标准溶液、抗克百威抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体、底物、显色物质和反应终止液，其中(1)包被抗原6-[[(2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]己酸与卵清蛋白的复合物(BFNB-OVA)或4-[[(2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]丁酸与卵清蛋白的复合物(BFNH-OVA)。用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液(含1～2g碳酸钠和2～4g碳酸氢钠，双蒸水1L)稀释成0.1～1μg/mL，(2)洗涤液(稀释液)一瓶，40～80mL/瓶，内含有氯化钠7～9g、磷酸二氢钾0.1～0.3g、磷酸氢二钠2～4g、氯化钾0.1～0.3g、吐温-20 0.5～3mL、双蒸水，为正常使用的15～30倍浓缩液；(3)底物稀释液一瓶，30～50mL/瓶，配制如下柠檬酸3～6g，磷酸氢二钠1～3g，双蒸水，为正常使用的5～10倍浓缩液；(4)酶底物为过氧化氢一瓶，1～5mL/瓶；(5)显色物质为邻苯二胺(OPD)6～10支，8～15mg/支；(6)抗克百威抗体由克百威免疫原免疫兔子制备而得，稀释成蛋白浓度为0.5～4.0μg/mL使用，一瓶，100～200μL/瓶，为正常使用800～1500倍浓缩液；(7)辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体，一瓶，100～200μL/瓶，为正常使用800～1500倍浓缩液；(8)反应终止液一瓶，30～50mL/瓶，为2mol/L硫酸；(9)克百威不同浓度系列(0.05、0.5、2、10、50、100mg/L)标准液6瓶，1～4mL/瓶，甲醇定容，使用时用PBST稀释10倍。这种试剂盒的特异性好，丁硫克百威和呋喃酚的交叉反应率低于7.00％，与供试的其它氨基甲酸酯类农药和有机磷类农药的交叉反应率均小于0.44％，试剂盒的最低检测限为0.005mg/L，线性检测范围为0.005～10mg/L，样品检测的批内、批间、整体变异系数均低于8.00％之间，回收率均高于89.62％。试剂盒在4℃或保存期20℃下至少可保存6个月以上。
土样取10g土壤用20～40mL甲醇提取三次，合并提取液，浓缩，然后用PBST稀释定容至10mL，进行ELISA分析。
蔬菜样品取蔬菜样品用粉碎机绞碎后称取10g，20～40mL甲醇提取三次，合并提取液，浓缩，用PBST定容至10mL，取样进行ELISA分析。
血液取人体血液，加抗凝素后直接用ELISA法进行分析。
洗胃液(2％碳酸氢钠溶液)取10mL洗胃液，用稀HCl调pH值到中性后即可用ELISA法进行分析。
呕吐物取样品研碎，离心取上清用ELISA法进行分析。
以所获得的标样和样品吸光值的平均值计算各孔的吸光值的抑制率 ODmax为不加药时的吸光值，ODx为农药x时的吸光值，ODmin为空白对照孔的吸光值计算的标样值绘成为一个对应克百威浓度(mg/L)的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在0.005～10mg/L范围内为线性，对应样品浓度可从校正曲线读出，也可根据标样的浓度与抑制率求出线性方程，然后求出对应样品的浓度。
将试剂盒放置于4℃和-20℃保存，分别取0，10，20，30，60，90，120，150和180d的试剂盒，以最佳抗体抗原工作浓度为测定浓度，进行标准样品检测以测定其检测效果。保存期测定结果如下表表1 试剂盒保存期试验结果Table1 Validity of ELISA kit
以上结果可以看出，试剂盒在4℃和-20℃下至少可保存6个月以上。
表2 试剂盒特异性试验Table2 Recognition of Several Compounds by ELISA kit
实验例8准确度试验取三个浓度的克百威标样，添加到样品中，每个浓度设6个重复，进行测定。
试剂盒回收率的结果如下，水为99.12％～114.24％，土壤为93.06％～98.42％，蔬菜为89.62％～99.72％，中毒样品(定性检验)为59.71％～98.42％。
权利要求
1.一种适用于克百威残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，它包括盒体、设在盒体内的96孔/40孔酶标板和设在盒体内的试剂，其特征在于，在酶标板的每孔内，由包被液包被能与抗克百威抗体特异性结合反应的包被抗原，并用1.0～3.0％脱脂奶粉进行封闭，盒内试剂包含洗涤液、底物稀释液、克百威标准溶液、抗克百威抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体、底物、显色物质和反应终止液。
2.根据权利要求1所述的一种适用于克百威残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所说的包被抗原为6-[[(2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]己酸与卵清蛋白的复合物或4-[[(2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]丁酸与卵清蛋白的复合物。
3.根据权利要求1所述的一种适用于克百威残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所说的洗涤液内含有氯化钠7～9g、磷酸二氢钾0.1～0.3g、磷酸氢二钠2～4g、氯化钾0.1～0.3g、吐温-20 0.5～3mL、双蒸水。
4.根据权利要求1所述的一种适用于克百威残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所说的底物稀释液内含有柠檬酸3～6g，磷酸氢二钠1～3g，双蒸水。
5.根据权利要求1所述的一种适用于克百威残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所说的酶底物为过氧化氢或过氧化尿素。
6.根据权利要求1所述的一种适用于克百威残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所说的显色物质为邻苯二胺。
7.根据权利要求1所述的一种适用于克百威残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所说的反应终止液为硫酸或盐酸。
8.根据权利要求1所述的一种适用于克百威残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所说的碳酸盐缓冲溶液，含1～2g碳酸钠和2～4g碳酸氢钠，双蒸水1L。
全文摘要
本发明公开了一种适用于克百威残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒,它包括盒体、设在盒体内的96孔/40孔酶标板和设在盒体内的试剂,其特征在于,在酶标板的每孔内,由包被液包被能与抗克百威抗体特异性结合反应的包被抗原,并用1.0～3.0%脱脂奶粉进行封闭,盒内试剂包含洗涤液、底物稀释液、克百威标准溶液、抗克百威抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体、底物、显色物质和反应终止液。本发明的优点是能用于水、土壤、蔬菜、中毒样品中克百威残留的检测,样品的前处理过程简单,耗时少,能同时检测大批量的样品,样品检测成本远低于传统的检测方法。试剂盒采用强特异性、高效价的抗体,提高检测的灵敏度、准确度、精密度。试剂盒的保存期超过6个月。
文档编号G01N33/535GK1385703SQ0211200
公开日2002年12月18日 申请日期2002年6月7日 优先权日2002年6月7日
发明者朱国念, 吴慧明, 杨挺, 程敬丽 申请人:浙江大学