专利名称：消减固定相的逆流色谱分离方法
技术领域：
本发明涉及一种用于分离植物提取物中活性成分的逆流色谱法。
背景技术：
逆流色谱法是二十世纪八十年代发展起来的一种液一液分配技术，目前己广泛应用于植物、海洋生物、微生物发酵产物中生物活性成分的分离。目前应用逆流色谱仪分离植物提取物所采用的方法，均是按照溶剂系统中各溶剂的比例混合均匀，待混合平衡后形成的上、下两相分别用作固定相和流动相。由于此种方法中的溶剂系统进入逆流色谱仪之前，在分离容器中经过了充分的分配平衡，分离后形成的固定相和流动相重新以任意比例相混合时，相互间不会溶解，固定相和流动相中的溶剂比例都不会发生任何变化。进入逆流色谱仪后，在分离植物提取物时，植物提取物中所含的各种活性成分在固定相和流动相中的分配平衡系数也保持不变，各种活性成分按照各自固有的分配平衡系数运动。为了保证好的分离效率，往往有许多活性成分在固定相和流动相中的分配系数大于甚至远大于1，因而造成部分活性成分单体的出峰时间很长，并且这些峰的展宽现象严重。
公开号为1301698A的中国申请专利公开了一种从茶提取物中分离儿茶素单体的方法，其所用的固定相和流动相也分别是各种溶剂混合后形成的上、下相，将上述分离方法应用在工业化生产中，由于分离效率低，从而使植物提取物中的活性成分单体的单时产量低，生产效益低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷，提供一种消减固定相的逆流色谱分离方法，其在保证分离得到活性成分单体的浓度不变的情况下，缩短分离时间，尤其是缩短出峰时间靠后的成分单体的出峰时间，并改善活性成分单体分离的峰形。
本发明的技术方案是这样的消减固定相的逆流色谱分离方法，以植物提取物为分离对象，逆流色谱仪为分离设备，其特征是组成溶剂系统中的固定相与流动相均单独配制，所述的固定相为烷烃、含氯有机溶剂、乙酸乙酯、脂肪醇、脂肪酮中的一种或数种组合，所述的流动相为含氯有机溶剂、脂肪醇、水中的一种或数种组合，固定相、流动相选用非同一种物质，具体操作步骤如下单独配制好的固定相送入逆流色谱仪的色谱柱中，开启逆流色谱仪，将植物提取物溶液和单独配制好的流动相依次注入色谱柱中，根据检测的谱图收集分离物。本发明所用的溶剂均为分析纯，固定相选用的物质与流动相选用的物质不为同一种，例如固定相与流动相为单纯物质时，两者不可能同时选用水，组成溶剂系统的固定相与流动相两部分均是单独配制，改变了现有逆流色谱分离方法中固定相和流动相的溶剂组成，在固定相、植物提取物溶液、流动相分别进入逆流色谱仪之后，实现固定相的动态性消减，即在逆流色谱仪运行过程中，流动相溶解了固定相中的溶剂，固定相在逆流色谱中所占的比例值逐渐减少，从而改变植物提取物中各活性成分单体在逆流色谱仪内的分配系数和运动方式，缩短活性成分单体的出峰时间，出峰时间靠后的成分单体尤为明显，并改善了活性成分单体的峰形。
所述的消减固定相的逆流色谱分离方法，烷烃为石油醚、正己烷或正戊烷。
所述的消减固定相的逆流色谱分离方法，植物提取物为茶多酚时，固定相为石油醚或正己烷和乙酸乙酯，两者的体积比为1∶(1-20)，流动相为水，其与固定相的体积比为(1-50)∶1。
所述的消减固定相的逆流色谱分离方法，所述中固定相的石油醚或正己烷∶乙酸乙酯的体积比为1∶7，水与固定相的体积比为5∶1。。
所述的消减固定相的逆流色谱分离方法，脂肪醇为甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇或正戊醇。
所述的消减固定相的逆流色谱分离方法，植物提取物为葛根提取物时，固定相为正丁醇、乙酸乙酯和甲醇，它们的体积比为1∶(1-10)∶(0.1-5)，流动相为水，其与固定相的体积比为(1-50)∶1。
所述的消减固定相的逆流色谱分离方法，含氯有机溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷。
所述的消减固定相的逆流色谱分离方法，植物提取物为茶叶生物碱，所述的固定相为水和甲醇，它们的体积比为1∶(1-10)，所述的流动相为三氯甲烷，其与固定相的体积比为(1-50)∶1。
所述的消减固定相的逆流色谱分离方法，植物提取物为杜仲或金银花的酚酸，所述的固定相为乙醇、乙酸乙酯和水，它们的体积比为(1-10)∶(1-20)∶1，所述的流动相为二氯甲烷和水，它们的体积比为(1-50)∶1，流动相与固定相的体积比为(1-50)∶1。
所述的消减固定相的逆流色谱分离方法，植物提取物为红茶茶黄素，所述的固定相为正己烷、乙酸乙酯和甲醇，它们的体积比为1∶(1-30)∶(1-5)；所述的流动相为水，其与固定相的体积比为(1-50)∶1。
本发明从改变现有逆流色谱分离法所用的溶剂系统中的固定相与流动相的组成入手，实现逆流色谱运行过程中固定相的动态性消减，在保证分离得到的活性成分单体浓度不变的情况下，改变植物提取物中各活性成分单体在逆流色谱仪内的分配系数和运动方式，缩短了活性成分单体的出峰时间，改善了活性成分单体的峰形。将本发明应用在工业化生产中，提高活性成分单体的单时产量，生产效益高。本发明还可用于分离罗汉果、银杏叶、三七、女贞、苦丁茶、厚朴、石斛或丹参提取物中的活性成分。
图1为现有逆流色谱分离法分离茶多酚中活性成分的色谱图。
图2为实施例1的色谱图。
图3为现有逆流色谱分离法分离葛根提取物中活性成分的色谱图。
图4为实施例2的色谱图。
具体实施例方式
实施例1本发明用于分离茶多酚中的活性成分逆流色谱仪为国产GS-10A型，茶多酚的组成为表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)占26.16％、表儿茶素没食子酸酯(ECG)占5.87％、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)占12.13％、表儿茶素(EC)占9.43％、表没食子儿茶素(EGC)占8.92％、儿茶素(D，L-C)占2.60％，组成溶剂系统中的固定相与流动相均单独配制。固定相的配制，取50ml石油醚和350ml乙酸乙酯配制而成，流动相则为2000ml纯蒸馏水。将固定相泵入逆流色谱柱后，称取茶多酚0.5g溶于40ml流动相中，开启逆流色谱仪至800转/分，然后以2.0ml/min的流速泵入茶多酚溶液，再改用流动相洗脱柱内的儿茶素组分。根据检测的谱图用收集器按5ml/管进行收集，用紫外分光光度法进行检测，收集各单一组分，干燥即可得到儿茶素单体，其中EGC纯度75％、出峰时间为3.5小时，EC+D，L-C出峰时间为4.1小时， EGCG纯度88％、出峰时间为5.4小时，GCG纯度92％、出峰时间为10.2小时，ECG纯度86％、出峰时间为13.1小时。
本发明与现有分离法在分离茶多酚活性成分得到的出峰时间和成分浓度的对比表(使用的溶剂及其体积相同)
实施例2本发明用于分离葛根提取物中的活性成分逆流色谱仪为国产GS-10A型，葛根提取物中异黄酮的组成为葛根素(Puerarin)占36.16％、大豆苷元(Daidzein)占3.87％、大豆苷(Daidzin)占17.13％，组成溶剂系统中的固定相与流动相均单独配制。固定相的配制，取50ml正丁醇、200ml乙酸乙酯和50ml甲醇配制而成，流动相为1200ml的纯蒸馏水。将固定相泵入逆流色谱柱后，称取葛根提取物0.5g溶于40ml流动相中，开启逆流色谱仪至800转/分，然后以1.5ml/min的流速泵入葛根提取物溶液，再改用流动相洗脱柱内的异黄酮组分。根据检测的谱图用收集器按5ml/管进行收集，用紫外分光光度法进行检测，收集各单一组分，干燥即可得到异黄酮单体，其中Puerarin纯度86％、出峰时间为5.1小时，Daidzin纯度90％、出峰时间为8.2小时，Daidzein纯度87％、出峰时间为11.8小时。
本发明与现有分离法在分离葛根提取物中活性成分得到的出峰时间和成分浓度的对比表(使用的溶剂及其体积相同)
实施例3本发明用于分离茶叶生物碱中的活性成分逆流色谱仪为国产GS-10A型，茶叶生物碱中活性成分的组成为咖啡碱(Caffeine)占53.28％、茶叶碱(Theophylline)占1.47％、可可碱(Theobromine)占15.93％，组成溶剂系统中的固定相与流动相均单独配制。固定相的配制，取200ml水(pH值范围为4.5)、300ml甲醇配制而成，流动相为1500ml的三氯甲烷。将固定相泵入逆流色谱柱后，称取茶叶生物碱0.8g溶于30ml流动相中，开启逆流色谱仪至800转/分，然后以1.8ml/min的流速泵入茶叶生物碱溶液，再改用流动相洗脱柱内的生物碱组分。根据检测的谱图用收集器按5ml/管进行收集，用紫外分光光度法进行检测，收集各单一组分，干燥即可得到生物碱单体，其中Caffeine纯度93％、出峰时间为3.9小时，Theophylline纯度85％、出峰时间为5.6小时，Theobromine纯度83％、出峰时间为9.4小时。所得到的三种生物碱，在经过重结晶后均可达到98.5％以上的纯度。
本发明与现有分离法在分离茶叶生物碱中活性成分得到的出峰时间和成分浓度的对比表(使用的溶剂及其体积相同)
实施例4本发明用于分离杜仲或金银花的酚酸提取物中的活性成分逆流色谱仪为国产GS-10A型，杜仲提取物或金银花提取物中活性成分酚酸类的组成为绿原酸(Chlorogenic acid)占36.62％、咖啡酸(Caffeic acid)占10.53％、没食子酸(Gallic acid)占7.69％、奎尼酸(Quinic acid)占3.51％，组成溶剂系统中的固定相与流动相均单独配制。固定相的配制，取200ml乙醇、300ml乙酸乙酯、20ml水配制而成，流动相为1900ml的二氯甲烷和50ml水配制而成。将固定相泵入逆流色谱柱后，称取杜仲提取物或金银花提取物1.0g溶于40ml流动相中，开启逆流色谱仪至800转/分，然后以2.0ml/min的流速泵入提取物溶液，再改用流动相洗脱柱内的酚酸各活性成分组分。根据检测的谱图用收集器按5ml/管进行收集，用紫外分光光度法进行检测，收集各单一组分，干燥即可得到酚酸成分单体，其中Chlorogenicacid纯度92％、出峰时间为4.5小时，Caffeic acid纯度88％、出峰时间为6.8小时，Gallic acid纯度86％、出峰时间为10.6小时，Quinic acid纯度83％、出峰时间为12.5小时。
本发明与现有分离法在分离茶叶生物碱中活性成分得到的出峰时间和成分浓度的对比表(使用的溶剂及其体积相同)
实施例5本发明用于分离茶黄素中的活性成分逆流色谱仪为国产分析型仪器，红茶茶黄素提取物中活性成分的组成为茶黄素(TF)占15.42％、茶黄素-3-没食子酸酯(TF-3-G)占13.73％、茶黄素-3’-没食子酸酯(TF-3’-G)占9.85％、茶黄素双没食子酸酯(TF-3，3’-DG)占23.59％，组成溶剂系统中的固定相与流动相均单独配制。固定相的配制，取1ml正己烷、22ml乙酸乙酯和2ml甲醇配制而成，流动相则为1250ml纯蒸馏水。将固定相泵入逆流色谱柱后，称取茶黄素提取物0.04g溶于4ml流动相中，开启逆流色谱仪至800转/分，然后以1.5ml/min的流速泵入茶黄素提取物溶液，再改用流动相洗脱柱内的活性成分组分。根据检测的谱图用收集器按5ml/管进行收集，用紫外分光光度法进行检测，收集各单一组分，干燥即可得到茶黄素单体成分，其中TF纯度82％、出峰时间为3.4小时，TF-3-G和TF-3’-G出峰时间为6.1小时，TFDG纯度91％、出峰时间为13.8小时。
本发明与现有分离法在分离茶黄素活性成分得到的出峰时间和成分浓度的对比表(使用的溶剂及其体积相同)
实施例6与实施例1不同之处在于，所用的固定相为15ml正己烷和240ml乙酸乙酯，流动相为水，其体积为10L，出峰时间为EGC4.5小时；EC+D，L-C6.3小时；EGCG9.1小时；GCG13.2小时；ECG19.0小时。
实施例7与实施例2不同之处在于，所用的固定相为20ml正丁醇、160ml乙酸乙酯和80ml甲醇，流动相为水，其体积为10L，出峰时间为Puerarin4.6小时；Daidzin7.9小时；Daidzein13.2小时。
实施例8与实施例3不同之处在于，所用的固定相为20ml水和200ml甲醇，流动相为二氯甲烷，其体积为9L，出峰时间为Caffeine2.4小时；Theophylline4.3小时；Theobromine7.2小时。
实施例9与实施例4不同之处在于，所用的固定相为100ml乙醇、100ml乙酸乙酯和20ml水，流动相为三氯甲烷和水，其体积为8L，出峰时间为Chlorogenicacid3.6小时；Caffeic acid5.8小时；Gallic acid8.6小时；Quinicacid11.5小时。
实施例10与实施例5不同之处在于，所用的固定相为2ml正己烷、10ml乙酸乙酯和2ml甲醇，流动相为水，其体积为200ml，出峰时间为TF1.7小时；TF-3-G，TF-3’-G3.4小时；TFDG7.6小时。
权利要求
1.消减固定相的逆流色谱分离方法，以植物提取物为分离对象，逆流色谱仪为分离设备，其特征是组成溶剂系统中的固定相与流动相均单独配制，所述的固定相为烷烃、含氯有机溶剂、乙酸乙酯、脂肪醇、水中的一种或数种组合，所述的流动相为含氯有机溶剂、脂肪醇、水中的一种或数种组合，固定相、流动相选用非同一种物质，具体操作步骤如下单独配制好的固定相送入逆流色谱仪的色谱柱中，开启逆流色谱仪，将植物提取物溶液和单独配制好的流动相依次注入色谱柱中，根据检测的谱图收集分离物。
2.根据权利要求1所述的消减固定相的逆流色谱分离方法，其特征是所述的烷烃为石油醚或正己烷。
3.根据权利要求2所述的消减固定相的逆流色谱分离方法，其特征是所述的植物提取物为茶多酚，所述的固定相为石油醚或正己烷和乙酸乙酯，两者的体积比为1∶(1-20)；所述的流动相为水，其与固定相的体积比为(1-50)∶1。
4.根据权利要求3所述的消减固定相的逆流色谱分离方法，其特征是所述固定相中的石油醚或正己烷∶乙酸乙酯的体积比为1∶7，水与固定相的体积比为5∶1。
5.根据权利要求1所述的消减固定相的逆流色谱分离方法，其特征是所述的脂肪醇为甲醇、乙醇或正丁醇。
6.根据权利要求5所述的消减固定相的逆流色谱分离方法，其特征是所述的植物提取物为葛根提取物，所述的固定相为正丁醇、乙酸乙酯和甲醇，它们的体积比为1∶(1-10)∶(0.1-5)；所述的流动相为水，其与固定相的体积比为(1-50)∶1。
7.根据权利要求5所述的消减固定相的逆流色谱分离方法，其特征是所述的含氯有机溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷。
8.根据权利要求7所述的消减固定相的逆流色谱分离方法，其特征是所述的植物提取物为茶叶生物碱，所述的固定相为水和甲醇，它们的体积比为1∶(1-10)；所述的流动相为三氯甲烷，其与固定相的体积比为(1-50)∶1。
9.根据权利要求7所述的消减固定相的逆流色谱分离方法，其特征是所述的植物提取物为杜仲或金银花的酚酸，所述的固定相为乙醇、乙酸乙酯和水，它们的体积比为(1-10)∶(1-20)∶1，所述的流动相为二氯甲烷或三氯甲烷和水，它们的体积比为(1-50)∶1，流动相与固定相的体积比为(1-50)∶1。
10.根据权利要求1所述的消减固定相的逆流色谱分离方法，其特征是所述的植物提取物为红茶茶黄素，所述的固定相为正己烷、乙酸乙酯和甲醇，它们的体积比为1∶(1-30)∶(1-5)；所述的流动相为水，其与固定相的体积比为(1-50)∶1。
全文摘要
本发明涉及一种用于分离植物提取物中活性成分的逆流色谱法。目前所用的方法，均是按照溶剂系统中各溶剂的比例混合均匀，待混合平衡后形成的上、下两相分别用作固定相和流动相，从而造成部分活性成分单体的出峰时间很长，并且这些峰的展宽现象严重。本发明的特征是组成溶剂系统中的固定相与流动相均单独配制，所述的固定相为烷烃、含氯有机溶剂、乙酸乙酯、脂肪醇、脂肪酮中的一种或数种组合，所述的流动相为含氯有机溶剂、脂肪醇、水中的一种或数种组合，固定相、流动相选用非同一种物质。本发明缩短了活性成分单体的出峰时间，改善了活性成分单体的峰形，将本发明应用在工业化生产中，提高活性成分单体的单时产量，生产效益高。
文档编号G01N30/42GK1506680SQ0215513
公开日2004年6月23日 申请日期2002年12月10日 优先权日2002年12月10日
发明者江和源 申请人:中国农业科学院茶叶研究所