专利名称:可特异结合的物质的测定方法
本发明涉及依照免疫分析原理检测可特异结合的蛋白质物质的方法，即相互特异结合的物质对的组分之一以固相结合的形式出现;因而还涉及一种适用于该方法的载体材料。
为检测某种可特异结合的物质，常常使用依据免疫学分析原理建立的方法。从而使可相互特异结合的物质对组分之一与对其特异的受体发生反应(其中所说的组分是用已知方法标记的)。之后这两种物质的结合物便可与对结合物特异的或对结合物两者之一特异的受体反应。有许多不同的免疫学方法。如将受体之一结合于固相上将是有利的。这样将比较容易地分离已结合的或未结合的反应组分。之后为检测可特异结合的物质，可检测结合于固相上的或存在于溶液中的标记的反应组分的量，而且测得的量是以已知方式与待检反应组分的量相关的。
在这类免疫学方法中，所使用的固相通常是在其内表面固定了反应组分的合成材料制成的试管或微量滴定板，或者是在其外表面固定了反应组分的扁球体。这些合成树脂试管、微量滴定板或小球通常是由相当惰性的合成树脂材料制成的，致使反应组分的结合产生困难。再者，特异性反应组分同上述表面的结合必须以这样一种方式发生，即不能丧失对可与它特异结合的物质发生特异性结合的能力。为此，反应性组分同固相的结合主要是吸附结合。
因此，有人提出通过一种可导致结合的偶联剂使反应组分固定到固相上。必须特别注意的是，反应组分同结合试剂的结合不能破坏分子的特异反应区域，或者应使被结合的反应组分的反应部位背离固相而朝向结合组分。
另外，西德书2533701号提到，为了达到更好的结合，可使有免疫学活性的各个蛋白质交联，之后使之吸附到聚苯乙烯小球上。该参考文献中给出的另一种可能性是，使惰性蛋白质与具有免疫学特性的蛋白质交联，以使交联的产物具有惰性和活性蛋白质的特性，之后再将其吸附于聚苯乙烯小球上。然而，依据所选用的反应条件，这种类型的交联可导致非交联蛋白质的比例变化，以及已变为不溶性的蛋白质产生不可再生的交联。另外，由于交联的程度不同，而可得到具有不同结合性质的产物。
欧洲书0，122，209号中描述了一种相似的方法，而且也存在着同样的缺点。据此，所有这些已知方法都是不能令人满意的，仍不能导致可特异结合物质的最佳吸附，而且很难适用于已包被之固相的可再生制备。
因此，本发明的目的是提供一种可再生的、改善可特异结合物质同固相吸附的方法，并提供了适用于这一方法的载体材料。因为许多免疫学方法都是经加入去污剂以避免混浊不清的条件下完成的，所以本发明的目的还包括将吸附作用改善到这样一种程度即使在去污剂存在下，也不能将已经结合上去的可特异结合的物质溶解掉。
据此，按照本发明，其提供了一种制备结合于某种不溶性载体材料上的可特异结合之蛋白质物质的方法，特别是依据免疫分析原理用于不均一分析的方法，此方法将分子量约500，000以上，比可特异结合的物质有更大疏水性的可溶性蛋白与可特异结合的物质相偶联，然后将反应组分和蛋白质的结合物吸附于疏水的固相上。
以这种方法固定于固相上的可特异结合物质表现有改善了的附着力。当使用去污剂时这种结合也是稳定的。在制作校正曲线(对于估价许多免疫学方法是不可缺少的)时，依据本发明的可特异结合物质的固相结合给出更陡的校正曲线，使精确度得到提高。
本发明之方法的另一个优点在于，它能更为准确地控制结合量。因为粘附作用显著地好于先前已知的方法，所以必须使用的特异性蛋白质的量也是较少的。
为了选择适用于本发明之方法的可溶性蛋白，必须测定分子量以及疏水性能，与可特异结合物质的相应数值进行比较。分子量是依照已知方法测定的。
亦可用常规方法对可溶性蛋白质和可特异结合物质之间的疏水性进行比较。例如，适用的方法包括先结合于带颜色材料上然后比较荧光吸光率(Biochem，Biophys，Acta，624，13-20/1980);比较疏水层析时的洗脱行为(Biochem，Biophys.Acta，576;269-279/1979);表面张力(Biochem，Biophys.Acta，670，64-73/1981);以及比较疏水性相互作用层析(HIC)时的滞留时间(Angew，Chemic，98，530-548/1986;J.Chromat，296，107-114/1984;Anal，Biochem，137，464-472/1984)。
参考文献Sep.Sci.Technol，14，305-317/1979中比较了适于本发明之物质的疏水性。例如依据该方法，下列物质按疏水性增加排列α2-巨球蛋白(分子量820，000)、牛血清白蛋白蛋白/人血清白蛋白(分子量约70，000)、卵白蛋白、α2HS-糖蛋白(分子量约49，000)、β1C/β1A-球蛋白、免疫球蛋白(分子量约150，000)和铁传递蛋白(分子量约90，000)。
因此，如果使用免疫球蛋白作为可特异结合物质，则按本发明的方法在没有作进一步的预处理时，人血清白蛋白或α2HS-糖蛋白不适于作可溶性蛋白。
这里不仅须对上述各种蛋白质作疏水处理，而且须增加其分子量。在使用铁传递蛋白的情况下，产生足够的交联，以及在使用α2-巨球蛋白的情况下，具足够的疏水性作用。
不作预处理亦适于与作为可特异结合物质的免疫球蛋白偶联的蛋白质，包括β-脂蛋白(分子量约3.2×105)和α2-脂蛋白(分子量约5-20×106)。
例如，可通过加热、用酸、变性剂和/或离液序列高的阴离子处理和/或与某种疏水化合物化学偶联来使之产生疏水性质。
例如，可通过加热、用酸、变性剂和/或离液序列高的阴离子处理和/或与双或多功能蛋白试剂交联来增加分子量。
当蛋白质聚合物分子量达到500，000或更高时即完成了处理过程。最好选用分子量为500，000至20×106的蛋白质聚合物。
当也需要进行交联时，可在交联前、交联期间或交联后，但不是在可特异结合物质的存在下，完成疏水化处理。
通过加热使蛋白质疏水化，所用温度一般是40至95℃，所用时间如Biochem，Biophys，Acta，624，13-20/1980中所述，为1分钟至10小时。
所用的酸有乙酸、丙酸、乳酸或盐酸。适用浓度为1至100mM/升，作用时间为10分钟到16小时。
适用的离液序列高的阴离子如硫氰酸盐、碘化物、氟化物、溴化物、高氯酸盐和硫酸盐的阴离子。适用的变性剂包括盐酸胍和尿素等。所用浓度一般为10mM/升至6M/升。
为衍生疏水化合物，最好选用可溶性脂肪酸、低和高分子量的脂类，以及合成的聚合物如聚乙二醇或聚苯乙烯的可溶性共聚物。依照众所周知的方法进行这一衍生作用。
使用已知的蛋白结合试剂，通过双和多功能化合物进行交联。这些化合物至少含有两个可以是相同的或不同的功能基团，并可通过这些功能基团与蛋白质的功能基团反应。首选的是在其末端含烷基链的化合物，如琥珀酰亚胺、顺丁烯二酰亚胺和/或醛基化合物。
以通常方式使可溶性蛋白与双或多功能化合物一起反应，以使蛋白质与双或多功能化合物交联。
为进行疏水化和/或交联，最好使用分子量为10，000至700，000的蛋白质，特别优选的是牛血清白蛋白、脂酶和γ免疫球蛋白。
然后以已知方法将欲被结合的可特异结合物质与蛋白质偶联。如可使用Ishikawa(J.Immunoassay，4，209-327/1983)所描述的偶联方法。抗体、抗体片段、抗原及半抗原等蛋白质均可用作可特异结合物质。
然后将所得到的可特异结合之蛋白质物质与蛋白质的结合物吸附于用作固相的合成树脂表面。同固相的吸附结合是通过强和弱交换作用、疏水力、偶极-偶极及离子-偶极相互作用达到的。可使用表面张力比疏水性可溶蛋白质表面张力小的载体材料作为疏水固相，即其比蛋白质有更大的疏水性。最好使用表面张力＜40erg/cm2的载体材料。特别优选的有聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚四氟乙烯(Teflon)、聚酰胺、苯乙烯和丙烯腈的共聚物、玻璃和纤维素产品。它们可以以任何要求的形式存在，如薄膜、平板、粉末、颗粒或纤维絮状物，最好是得自纤维素/纤维素酯纤维和聚合物纤维的纤维絮状物。
疏水的蛋白质表现有特别好的吸附结合能力。由于疏水化处理，可能使蛋白质的分子内桥键打开，从而使蛋白质的疏水部分到达表面并比亲水部分更好地附着于疏水的合成树脂的表面，亲水部分往往出现于非疏水化蛋白质表面上。
可依据本发明的方法来检测可特异结合的物质。对于一对物质对，它的反应组分以结合于固相上的形式存在，这种可以使用的物质对包括抗原-抗体、半抗原-抗体及其他能相互特异结合的蛋白质，特别是抗生蛋白链菌素(Streptavidin)或抗生物素蛋白和生物素构成的系统。
在使蛋白质与可特异结合物质的结合物吸附于疏水固相上之前，亦可以用物理或化学方法对固相进行预处理。例如，可以将合成树脂表面预溶胀或用某些其他已知方法活化之。
依据本发明用于固相免疫分析的载体材料，其特征在于它包含一疏水固相，其上吸附有某种分子量约500，000以上的蛋白质，而该蛋白质能结合可特异结合的物质。
因为这种载体材料对可特异结合物质的吸附能力很好而且在去污剂存在下亦不会解吸附，故特别适用于固相免疫分析。
载体材料可以是试管、微量滴定板或小球等形式的，其上复盖一种交联蛋白，后者可与可特异结合物质结合。
由交联蛋白与可特异结合物质组成的结合物被吸附于固体基质上。优选的蛋白质为已经按所述方法交联的牛血清白蛋白、脂酶或γ免疫球蛋白。
依据本发明，提供了具有好的附着力和长时间保持稳定的方法及载体材料，将可特异结合物质固定于疏水固相上。从而可使吸附效果得以改善，以至加入去污剂也不会使该物质解吸附，而且本发明的方法简便易行。
下列实施例中将更详细地描述本发明，附图可供参考，其中图1是使用非交联的Fab＜TSH＞(曲线1)、交联的Fab＜TSH＞(曲线2)、Fab＜TSH＞/β-Gal的结合物(曲线3)及Fab＜TSH＞/热处理牛血清白蛋白(thermo-BSA)的结合物(曲线4)在Luran试管中检测TSH(促甲状腺激素)的校正曲线;
图2是使用固相化的抗生蛋白链菌素和生物素化的AK＜TSH＞;非交联的抗生蛋白链菌素(曲线1)、交联的抗生蛋白链菌素(曲线2)、抗生蛋白链菌素/β-gal结合物(曲线3)、抗生蛋白链菌素/BSA结合物(曲线4)、抗生蛋白链菌素(曲线5)和抗生蛋白链菌素/热处理-BSA结合物(曲线6)检测TSH的校正曲线;在曲线1-5的情况下，固相是Luran试管，而在曲线6的例子中，固相是聚苯乙烯试管。
图3是T3检测试验的校正曲线;
图4是检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的校正曲线。
实施例1抗TSH单克隆抗体之Fab片段在聚苯乙烯试管上的结合a)Fab片段(Fab＜TSH＞)的制备按Galfre和Millstein(Meth.in Enzymology，73/1981)所述的方法制得单克隆抗体(MAB＜TSH＞)。为进一步纯化，将腹水液用硫酸铵沉淀并过一次DEAE纤维素柱。
然后按已述及的方法(Biochem.J.，73，119-126/1959)进行木瓜蛋白酶水解。依照Meth.in Enzymology，73，418-459/1981中所述的方法，在萄聚糖G100柱上凝胶过滤并在DEAE纤维素柱上进行离子交换层析以自未消化的IgG分子和Fc片段中分离所形成的Fab片段。
b)未加蛋白质(对照)条件下Fab片段的交联。
将50mg Fab片段溶解于2ml 0.05M/升磷酸钾缓冲液(PH7.5)中，并向其中加入0.4ml溶于二噁烷中(7.4mg/ml)的辛二酸二琥珀酰亚胺酯(制造商Pierce)，同时进行搅拌。于25℃保温2小时后，加入0.2ml浓度为0.1M/升的盐酸赖氨酸中止反应。用0.2ml磷酸钾缓冲液(见上述)稀释反应混合物并离心。将上清液过Ultrogel AcA 202柱(LKB，Grafelfing，西德)除盐，得到含45mg蛋白质的11.3ml洗脱产物。取该制剂的一部分上Superose-6柱(Deutsche pharmacia GmbH)进行层析分离，用0.05M/升的磷酸钾缓冲液(PH7.0)以0.5ml/分的流速洗脱，并收集分子量约500，000至5×106的部分留作下一步使用。
c)Fab片段与未处理的γ-球蛋白交联(对照)。
将Fab片段与小牛γ球蛋白(Serva，Heidelberg，西德)以1∶1的重量比混合。按b)中所述方法完成交联。
d)Fab片段结合于预交联的γ球蛋白上(依照本发明)将1.25g γ球蛋白(溶于10ml浓度为0.05M/升的磷酸钾缓冲液(PH7.8)中，并在Sorvall冷冻离心机中以5000r.p.m.离心10分钟。向该溶液中加入1.75ml辛二酸二琥珀酰亚胺酯，之后用2.5ml水稀释之。于25℃搅拌4小时后，向其中加入10ml浓度为0.1M/升的赖氨酸，并将pH调到6.8，然后离心。在制备凝胶过滤柱(TSK3000，LKB Grafelfing，西德)上分离上清液，超滤浓缩并于4℃储存备用。
将50mg这一交联的γ球蛋白溶解在5ml浓度为0.05M/升的磷酸钾缓冲液中，并加入固体碳酸钠将pH值调到9.5。然后向其中加入50mg N-乙酰同型半胱氨酸硫羟丙酮(Serva，Heidelberg，西德)并于25℃搅拌5小时，同时通入氮气。继之将该部分材料在0.1M/升磷酸钾(pH7.0)、0.001M/升氯化镁及0.05M/升氯化钠组成的缓冲液中过Ultragel AcA 202柱除盐。
于25℃用0.002ml溶于二甲基亚砜的顺丁烯二酰亚胺基己酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Boehringer Mannheim GmbH)(33mg/ml)将依照a)所制备的Fab片段(即10mg溶于1ml浓度为0.01M/升的磷酸钾缓冲液(pH7.0)中)活化2小时，然后离心并过AcA202柱脱盐。
将这些片段与γ球蛋白合并(蛋白质重量比为1∶1)，并于25℃、pH7.0条件下保温1小时。然后于4℃，以蛋白浓度为2.5mg/ml对除盐水透析过夜。
该结合物可直接用来吸附于固相上。
e.与热处理的BSA偶联的Fab片段的制备(根据本发明)。
热处理的BSA(牛血清白蛋白)的制备于温和搅拌下将1gBSA-Ⅰ溶解于100ml浓度为50mM/升的磷酸钾(pH7.0)中，加热到70℃，并在这一温度保持4小时。将溶液冷却、过滤并在一超滤器(排阻极限30，000道尔顿)中调到浓度为50mg/ml。然后对30倍体积的双蒸水透析并冻干。产品的分子量约为700，000。
在与Fab片段偶联前，先活化热处理过的BSA。为此目的，将68mg热处理的BSA溶解于2ml浓度为0.1M/升的磷酸钾(pH7.8)中，并与3.8mgS-乙酰巯基琥珀酸酐(SAMSA)的溶液缓慢混合。反应3小时后，对2升浓度为50mM/升的磷酸钾溶液(pH6.5)透析。将该热处理的BSA于25℃及pH7.0条件下与按照d)所述方法活化的Fab片段(重量比为1∶1)保温1小时，然后于4℃并以2.5mg/ml的蛋白浓度对除盐水透析过夜。该产品可直接用于包被。
f)与β-半乳糖苷酶偶联的Fab片段的制备(依据本发明)。
按照J.Immunology，4，209-327/1983中所述的方法，将按d)所述方法活化的Fab片段与β-半乳糖苷酶的SH基偶联。所用的β半乳糖苷酶的分子量为500，000至2×106。作另一实验时，则使用交联的β-半乳糖苷酶(分子量约5×106)。
g)用Fab片段或其结合物装填聚苯乙烯试管将50mg Fab片段或结合物的冻干品溶解于10ml双蒸水中。取1ml该溶液加入1000ml装填缓冲液(含5.25g/升磷酸二氢钠和1g/升叠氮钠)中稀释，并于常温下搅拌30分钟。
将各个聚苯乙烯或Luran(制造商为BASF)试管均加入1.5ml溶液并保存过夜(约22小时)。然后将试管完全排空并完成下述的功能试验。
h)通过TSH检测进行功能试验将按照g)所述方法装填的聚苯乙烯和Luran试管用于类似TSH-Enzymun试验的TSH检测试剂(Boehringer Mannheim GmbH，序号736，082)，并按照试验程序测出校正曲线。由此得到如下列表1及附图1中所示的测定值。
可以看出(由图1)，没有加蛋白时，被固定的Fab片段只给出很平坦的校正曲线(曲线1和2)。如与分子量低于500，000且疏水性低的蛋白质偶联，则校正曲线(曲线3)稍为陡些，但仍不能得到令人满意的结果。另一方面，对使用按本发明的方法制备的结合物，则可得到足够陡的校正曲线(曲线4)。
表1各种Fab〔TSH〕结合物的标准数值
＊在吸附情况下蛋白质的总量每管1.5ml，5ug蛋白质/ml;
＊＊Tp〔分钟〕，参见实施例3;
1测定曲线的最低值(应尽可能地低);
2测定曲线的最高值(应尽可能地高)。
实施例2抗生蛋白链菌素的固定a)交联的抗生蛋白链菌素的制备按与实施例1b相似的方法交联抗生蛋白链菌素(制造商Boehringer Mannheim GimbH)。
b)与BSA或β-半乳糖苷酶结合的抗生蛋白链菌素的制备按与实施例1f相似的方法完成与未交联的BSA或β-半乳糖苷酶结合。
c)与热处理的BSA偶联的抗生蛋白链菌素的制备抗生蛋白链菌素的活化将60mg抗生蛋白链菌素溶解于6ml磷酸钾(50mM/升)/氯化钠(100mM/升)(pH7.0)中并于4℃储存。将6.16mg顺丁烯二酰亚胺基己酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶解于620ul二噁烷中并于搅拌下加到抗生蛋白链菌素溶液中。于4℃反应2小时后，于4℃对1升磷酸钾(50mM/升)/氯化钠(100mM/升)(pH5)透析两次。
抗生蛋白链菌素和热处理的BSA的结合物的制备将66mg抗生蛋白链菌素溶解于10ml磷酸钾(50mM/升)(pH5.0)和氯化钠(100mM/升)中，并向其中加入溶于5ml磷酸钾(50mM/升)/氯化钠(100mM/升)(pH6.5)中的活化的热处理过的BSA-SAMBA(依照实施例1e制备)。混合后，向其中加入50ml羟胺(1M/升)(pH7.0)，以终止反应。3小时后，通过凝胶层析
(Superose 6，50mM/升磷酸钾/100mM/升氯化钠;pH7.5)纯化反应产物。由此得到分子量为1至5×106的结合物。
d)用抗生蛋白链菌素装填聚苯乙烯和Luran试管按实施例1g)中所述的方法进行装填。
e)通过TSH检测来测定标准值将依照d)装填的试管用于TSH Enzymun试剂(4倍结合物活性)。但不同于已述的方法是使用生物素化的MAB＜TSH＞代替固定化的抗体。该生物素化的MAB是根据J.A.C.S.，100，3585-3590/1978中所述的方法制备的。用于该试验的抗体浓度为每个试管加400ng，并加有其他试剂。
图2中显示了试验结果。由图中可以看出，随着分子量增加和疏水性增加，校正曲线的斜率增加，并因而使可达到的准确度增加。
实施例3用依照本发明的方法装填的试管进行T3试验。为此目的。在一已用与热处理的BSA偶联的抗生蛋白链菌素包被的试管中，将200ul样品或标准溶液与500ul用POD标记的抗T3多克隆抗体结合物一起预保温。5分钟后，将按已知方法生物素化的聚合的T3400ug加在500ul缓冲液中保温30分钟。作为缓冲液，使用了含0.20%BSA和0.04%8-苯胺基-1-萘磺酸(ANA)的pH8.65的磷酸氢钠溶液。保温后洗三次，然后向其中加入1mlABTs底物溶液。继续保温30分钟，用光度计测定405nm消光率。所得测定值以图3所示的曲线给出。
实施例4用依照本发明的方法制备的试管进行HBSAg试验。为此目的，在依据实施例1g)包被的试管中同时溶解400ng抗HBs抗原的生物素化的单克隆抗体及50mU用POD抗记的同一抗体，并向其中加入1ml如实施例3中所述的同种组分。以及200ul标准溶液。所加入的标准溶液，一方面是纯化的HBsAg ay亚型，另一方面是纯化的HBsAg ad亚型。然后在常温下保温4小时。将试管洗三次后，向其中加入1mlABTS底物溶液。20分钟后，终止反应并在光度计中测定405nm处的消光率。测定值可由图4看出，其中连续的曲线给出HBsAg ad亚型的数值;不连续的曲线给出HBsAg ay亚型的值。
实施例5比较按本发明方法包被的试管与按已知方法包被的试管的溶除作用。为此目的，一方面用1.5ml抗生蛋白链菌素-热处理的BSA溶液(4ug/ml，于40mM磷酸氢钠缓冲液(pH7.4)中)装填试管(20℃，18至24小时)。吸出试管内容物，于20℃用1.8ml含0.9%氰化钠和0.3%BSA的2%蔗糖溶液进行后处理30分钟。然后于20℃和40%相对湿度下将试管干燥24小时。这些试管就可以用以进行这一试验了。另外，按已知方法用抗生蛋白链菌素装填试管。在有去污剂作用的情况下，试验这些试管的溶除引为。下列表2中给出了所得结果
按照普通技术人员已知的方法检测百分溶除，如用125Ⅰ标记抗生蛋白链菌素和抗生蛋白链菌素-热处理的BSA，或用酶学检测法。
就百分溶除的酶学检测法来说，是将已包被的试管与50mM/升磷酸钾缓冲液(pH7.0)保温，在缓冲液中加有表Ⅱ中所示的去污剂并于表Ⅱ所述的条件下完成试验。
然后在常温下保温1小时，用上述缓冲液洗涤并于常温下与生物素POD(200mU/mlPOD活性)的结合物保温1小时，洗涤后向其中加2mlABTs
溶液(见实施例7)。底物反应进行1小时后，测定405nm处消光率，通过标准校正曲线由消光率数值确定抗生蛋白链菌素和抗生蛋白-热处理BSA的百分溶除。
实施例6用疏水相互作用层析法(HIC)检测蛋白的疏水性用液相层析仪(Hewlett Packard 10%LUSI)研究各种化合物的疏水性。预层析柱是BioRad Biogel TSK-phenyl-5PW柱(长5mm×内径4.6mm)。层析柱BioRad-Biogel TSK-phenyl-5PW(长7.5mm×内径7.5mm，10um，1000A)。所用检测仪器是Hitachi F1000荧光计。洗脱液/梯度(见表3)。
a)0.01M/升磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)中含1.5M/升硫酸铵。
b)0.01M/升磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)。
表3A% B% t/分钟100 0 0100 0 50 100 流速30-0.5分钟0 100 5100 0 5100 0 5工作温度冷室+7℃样品制备使用未稀释的样品。样品体积为10ul。
以浓度为0.2至1.4mg/ml将被研究的化合物溶解于10mM/升磷酸钾缓冲液(pH6.8)中。
下列表4总结了各种蛋白质和可特异结合的物质的滞留时间。滞留时间越长，则疏水性越大。
表4蛋白质 滞留时间tp(分钟)Fab TSH 41.5BSA 23.2γ-球蛋白 32.0β-半乳糖苷酶 39.6交联的β半乳糖苷酶 40.2抗生蛋白链菌素 38.3热处理的BSA(实施例1e) 未能洗脱γ-球蛋白，交联的 未能洗脱(实施例1a)在这些条件下不能洗脱的蛋白质是特别适用的并优先被采用，而特别优选的是热处理的BSA。
实施例7处理的BSA-抗生蛋白链菌素在玻璃纤维絮状物上的吸附将玻璃纤维絮状物(6×6mm)，其吸附体积约30ul，用浓度为30ug/ml的热处理的BSA-抗生蛋白链菌素(依照实施例2c制备的)(在50nm/升磷酸钾缓冲液(pH7.0)中)沉浸，并于50℃循环干燥器中干燥。
为测定生物素结合能力，用30ul含过氧化物酶(POD)和生物素之结合物的试剂(POD活性为50mU/ml，生物素标准品浓度为0.5、10、20、30、40、50、100、200、1000ng/ml生物素)沉浸硝酸纤维素印迹条并保温2分钟。然后用含2%O-Tween-20的过量的50mM/升磷酸钾缓冲液(pH7.0)洗一次，继之将100mM/升柠檬酸盐缓冲液(pH4.4)、3.2mM/升过硼酸盐、1.9M/升ABTA
(2，2′-连氮基-二〔3-乙基-苯并噻唑啉磺酸(6)〕-二铵盐引入2mlABTS溶液中并搅拌15分钟。底物反应1小时后，测定405nm处的消光率，并由测得数值通过半最大标记滴数(semimaximum signal drop)确定生物素结合能力。
权利要求
1.制备结合于不溶性载体材料之可特异结合的蛋白质物质的方法，特别是用于根据免疫学原理进行异质性分析的方法，其中将分子量大于500，000、比可特异结合的物质有更大疏水性的可溶性蛋白质与可特异结合的物质相偶联，然后使反应组分与蛋白质的结合物吸附于疏水固相上。
2.根据权利要求
1的方法，其中所用的可溶性蛋白的分子量为500，000至20×106。
3.根据权利要求
2的方法，其中可溶性蛋白是由分子量为10，000至70，000的蛋白质将分子量增加到大约500，000至20×106制得的。
4.根据前述权利要求
之任一项的方法，其中于偶联前，将蛋白质与双或多功能蛋白试剂交联，直至达到所要求的分子量。
5.根据前述权利要求
之任一项的方法，其中使用了经疏水化处理的蛋白质。
6.根据权利要求
5的方法，其中，于偶联前，经加热、用酸、变性剂或离液序列高的阴离子处理和/或与疏水化合物化学偶联，使蛋白质成为疏水性的。
7.根据权利要求
4的方法，其中辛二酸二琥珀酰亚胺酯被用作双功能化合物。
8.根据权利要求
3至7中任一项的方法，其中所用蛋白质为牛血清白蛋白、脂酶和/或免疫γ球蛋白。
9.根据权利要求
1的制备与不溶性载体材料结合之可特异结合的蛋白质物质的方法，基本上是如说明书中所描述和举例说明的。
10.依照权利要求
1至9中任一项的方法制备的与不溶性载体材料结合的可特异结合的蛋白质物质。
11.依照权利要求
1至9中任何一项的方法制备的用于固相免疫检测的载体材料，其中载体材料构成了吸附于分子量约500，000以上的疏水蛋白质与可特异结合的蛋白质物质所成结合物上的疏水固相。
12.根据权利要求
11的载体材料，其中疏水固相由聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚酰胺、聚四氟乙烯或苯乙烯与丙烯腈的共聚物构成。
13.根据权利要求
11或12的载体材料，其中蛋白质是疏水化处理的牛血清白蛋白(热处理的BSA)、疏水化处理的脂酶或疏水化处理的免疫γ球蛋白。
14.根据权利要求
11至13中任一项的载体材料，其中可特异结合的物质是抗原或抗体。
15.根据权利要求
11至13任一项的载体材料，其中可特异结合的物质是抗生蛋白的链菌素或抗生物素蛋白。
16.根据权利要求
11至15中任一项的载体材料，其中载体是玻璃纤维絮状物或由纤维素-/纤维素酯纤维和多聚物纤维制成的纤维絮状物。
专利摘要
本发明提供了一种制备结合于不溶性载体材料的可特异结合之蛋白质物质的方法，特别是依据免疫试验原理用于异质性分析方法中，其中包括将分子量大于500,000左右、疏水性大于可特异结合物质的可溶性蛋白质与可特异结合的物质偶联，然后使反应组分和蛋白质的结合物吸附于疏水的固相上。还提供了适用于该方法的载体材料，其中它构成了吸附于上述结合物上的疏水固相。
文档编号G01N33/74GK87107982SQ87107982
公开日1988年6月15日 申请日期1987年11月25日
发明者威尔海姆·蒂施尔, 约瑟夫·梅尔, 罗尔夫·迪格 申请人:伯伦格·曼海姆有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan