专利名称：饮用水生物处理的ttc－脱氢酶活性测定方法
技术领域：
本发明涉及一种环境监测方法，特别是一种对饮用水生物处理中的生物活性进行测定的方法。
背景技术：
水中有机污染物的生物降解过程的本质是酶促反应过程，有机物在微生物酶的催化下进行氧化分解，在微生物生理代谢方面，物质代谢和能量代谢密切相关。细胞中能量代谢的关键一环，是细胞中有机物氧化分解的各代谢之路所产生的氢(H+/e)通过呼吸链而产生能量。脱氢酶是呼吸链的主干酶系，其辅酶口(NAD+-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)或辅酶口(NADP+-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)是重要的递氢体，它们可以把基质氧化脱下的氢(H+/e)传如呼吸链脂质分子态氧。氢(H+/e)在呼吸链传递过程中，释放出能量用于生物合成和维持细胞的生命活动。氢(H+/e)之所以能够通过呼吸链最终与受氢体氧结合成水，其动力在于氧化呼吸链各组成部分的氧化还原电位不同。细胞中有机物脱氢是生物氧化分解的关键步骤，分子氧是生物氧化的最终受氢体，经过氧化传递给最终受氢体的氢(H+/e)越多，说明脱氢酶活性越高。所以，脱氢酶水平的高低直接关系到有机污染物的生物降解速度以及水处理工艺的运行效果。
目前，国内外常以脱氢酶高温萃取法来测定污水生物处理中的生物活性，该法采用高温(90℃)萃取样品显色液，再进行比色分析。由于萃取时溶剂蒸发，极易破塞而溢，从而导致测定结果不稳定，使得这一生化分析技术在实际应用方面受到限制。而且，由于技术上的原因，该方法主要应用于废水生物处理方面，在饮用水生物处理方面尚未见应用脱氢酶活性的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测结果稳定的饮用水生物处理的生物活性检测方法，它包括如下操作步骤a.样品的采集与制备取待处理水样10～15g放入含有50～100mL无菌水的三角瓶中，加盖无菌棉塞，扎紧后置于振荡器上振荡60min，振荡频率240次/min，所得生物膜混合液便可作为TTC-DHA活性测定的样品；b.样品浓缩将a步骤待测样品转移到100mL离心管内，以4000r/min的速度离心10min，静止后，弃去上清液，将沉淀物用10mL蒸馏水洗入25mL比色管中，再依次加入7.5mL Tris-HCl缓冲液，pH＝8.4；2.5mL体积浓度0.36％的Na2SO3溶液；2.5mL体积浓度0.4％的TIC溶液和2.5mL蒸馏水，混合均匀后，立即从上述混合液中吸取5mL注入具塞试管中，并加入0.5mL甲醛溶液，作为对照样品；c.样品培养将25mL比色管连同样品对照管一起置36～38℃恒温水浴振荡培养箱内培养2～4h；d.终止酶反应分别向25ml比色管和对照管中加入2.0mL甲醛溶液，混合均匀，并将25ml比色管内的溶液分装于4个具塞试管中，再连同样品对照管一道离心5min，弃去上清液；e.比色分析向上述试管中各加入5.0mL丙酮，并将试管底部沉淀物搅拌混合均匀，于36～38℃恒温水浴振荡培养箱中保持10min，然后于4000r/min条件下离心5min，取上清液，在1cm比色皿的485nm处进行比色，记录吸光值，然后根据通常方法即可检测出样品的TTC-脱氢酶活性。本发明的TTC-脱氢酶活性法，解决了检测尺度和低基质浓度条件下的生物活性检测问题。该方法采用科学的样品采集手段，以氧化还原性有机染料2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-Triphenyl Tetrazoliumchloride，简称TTC)为人工受氢体，它在细胞呼吸过程中接受氢(H+/e)以后，其还原产物TF呈现红色，该反应在微生物细胞内进行，TF不溶于水，因此可采用有机溶剂将其萃取出来，用分光光度法于485nm处测定其光密度，进而根据标准曲线计算TF生成量，即TTC-脱氢酶活性(Dehydrogenase Activity，简称TTC-DHA)。本发明的方法用于检测饮用水的生物活性，它的检测结果稳定，具有极高的实用价值，利于推广应用。
具体实施例方式本发明的测定方法包括如下操作步骤a.样品的采集与制备用采样器取样10～20g，分别装在无菌平皿中。称取10～15g样品放入含有50～100mL无菌水的三角瓶中，加盖无菌棉塞，扎紧后置于振荡器上振荡60min，振荡频率240次/min，所得生物膜混合液便可作为TTC-DHA活性测定的样品；b.样品浓缩将a步骤经振荡脱膜后所得到的生物絮体悬液转移到100mL离心管内，以4000r/min的速度离心10min，静止后，弃去上清液，将沉淀物用10mL蒸馏水洗入25mL比色管中，再依次加入7.5mL Tris-HCl缓冲液(pH＝8.4)，2.5mL体积浓度0.36％的Na2SO3溶液，2.5mL体积浓度0.4％的TTC溶液和2.5mL蒸馏水，混合均匀，并立即从上述混合液中吸取5mL于具塞试管中，加入0.5mL甲醛溶液，以终止酶反应，作为样品对照；c.样品培养将25mL比色管连同样品对照管一起置37±1℃恒温水浴振荡培养箱内培养2-4h，以便样品中微生物细胞内进行生化反应，还原TIC生成红色Triph-enyl Formazone，即TF；d.终止酶反应分别向25ml比色管和对照管中加入2.0mL甲醛溶液，混合均匀，并将25ml比色管内的溶液以5.5mL为1份分装于4个具塞试管中，再连同样品对照管一道离心5min，弃去上清液；e.比色分析向上述试管中各加入5.0mL丙酮，并将试管底部沉淀物搅拌混合均匀，于36～38℃恒温水浴振荡培养箱中保持10min，然后将萃取完毕的试管于4000r/min条件下离心5min，取上清液，取上清液于485nm处(1cm比色皿)进行比色，记录吸光值，然后根据样品显色液与样品对照萃取液的吸光值之差，查标准曲线，进而计算出检测样品的TTC-脱氢酶活性.测定结果以每立方厘米生物样品每小时还原TTC所生成的TF微克数(ugTF/cm3·h-1)表示。
本发明权利要求所提到的具体参数，如时间、温度等，在实际使用过程中，各具体参数的控制不可能绝对与本发明所述参数一致，所以只要按照本发明的方法实现了本发明的目的，就应在本发明的保护范围之内；另外，如所取水样的量以及使用培养基的量，并不一定是在实际使用过程中的绝对数值，所以，只要是它们之间的比例，即应在本发明的保护范围，而不限于本发明所述的具体数值。
权利要求
1.一种饮用水生物处理的TTC-脱氢酶活性测定方法，其特征在于它包括如下操作步骤a.样品的采集与制备取待处理水样10～15g放入含有50～100mL无菌水的三角瓶中，加盖无菌棉塞，扎紧后置于振荡器上振荡60min，振荡频率240次/min，所得生物膜混合液便可作为TTC-DHA活性测定的样品；b.样品浓缩将a步骤待测样品转移到100mL离心管内，以4000r/min的速度离心10min，静止后，弃去上清液，将沉淀物用10mL蒸馏水洗入25mL比色管中，再依次加入7.5mL Tris-HCl缓冲液，pH＝8.4；2.5mL体积浓度0.36％的Na2SO3溶液；2.5mL体积浓度0.4％的TTC溶液和2.5mL蒸馏水，混合均匀后，立即从上述混合液中吸取5mL注入具塞试管中，并加入0.5mL甲醛溶液，作为对照样品；c.样品培养将25mL比色管连同样品对照管一起置36～38℃恒温水浴振荡培养箱内培养2～4h；d.终止酶反应分别向25ml比色管和对照管中加入2.0mL甲醛溶液，混合均匀，并将25ml比色管内的溶液分装于4个具塞试管中，再连同样品对照管一道离心5min，弃去上清液；e.比色分析向上述试管中各加入5.0mL丙酮，并将试管底部沉淀物搅拌混合均匀，于36～38℃恒温水浴振荡培养箱中保持10min，然后于4000r/min条件下离心5min，取上清液，在1cm比色皿的485nm处进行比色，记录吸光值，然后根据通常方法即可检测出样品的TTC一脱氢酶活性。
全文摘要
饮用水生物处理的TTC－脱氢酶活性测定方法，它涉及一种环境监测方法，特别是一种对饮用水生物处理中的生物活性进行测定的方法。目前，测定污水生物处理中的生物活性方法，由于萃取时溶剂蒸发，极易破塞而溢，从而导致测定结果不稳定，使得这一生化分析技术在实际应用方面受到限制。本发明方法包括如下操作步骤a.样品的采集与制备，b.样品浓缩，c.样品培养，d.终止酶反应，e.比色分析。本发明的方法解决了检测尺度和低基质浓度条件下的生物活性检测问题，它的检测结果稳定，具有极高的实用价值，利于推广应用。
文档编号G01N1/28GK1598578SQ200410043738
公开日2005年3月23日 申请日期2004年7月22日 优先权日2004年7月22日
发明者马放, 韩健, 任南琪, 杨基先 申请人:哈尔滨工业大学