专利名称：：用于检测副溶血弧菌的耐热性溶血素相关溶血素基因的检测试剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于在临床检验、公共卫生、食品检查和食物中毒检验中检测副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的检测试剂。
背景技术：
：副溶血弧菌通常被认为是一种导致感染性食物中毒的致病微生物。从肠胃炎患者中分离的副溶血弧菌之95％或甚至更多为在Wagatsuma培养基上表现溶血活性的神奈川现象阳性菌株，与之不同，从鱼类和水中分离的菌株99％都是神奈川现象阴性。因此，人们认为在致病副溶血弧菌和神奈川现象之间存在密切联系。随后，这种神奈川现象的出现被确定为是由于副溶血弧菌向细菌细胞外释放耐热性溶血素(thermostabledirecthemolysin，TDH)所引起的，这导致对副溶血弧菌作为致病因子的关注的提升。目前TDH基因已知存在TDH1至TDH5五种类型。更近来，从一种尽管是神奈川现象阴性但显示致病性的微生物株系中，鉴定出一种具有相似于TDH的碱基序列且具有部分共同抗原性的溶血素(TDH-相关溶血素[TRH])。目前该TRH基因已知存在TRH1和TRH2两种类型。尽管涉及在扩增培养或分离培养之后评价神奈川现象以检测和鉴定副溶血弧菌的方法是已知的，但就检测的灵敏度、快捷性和简便性而言，优选对副溶血弧菌基因或来自所述基因的RNA中存在的特定序列进行扩增后检测该序列的方法。在检测系统的自动化方面特别优选恒温下扩增靶核酸的方法。已经报道了一种检测和鉴定副溶血弧菌的方法，其中在比较低的温度(41℃)下特异性扩增来自TRH1或TRH2基因的RNA(日本未审专利公开2001-258569和2001-340087和2001-340088)。在此方法中使用RNA扩增法，其中以来自所述TRH1或TRH2基因的特定RNA序列为模板，通过RNA依赖型DNA聚合酶，使用具有与所述特定序列互补的序列的第一引物和具有与所述特定序列同源的序列的第二引物制备cDNA而形成双链RNA-DNA，其中第一引物或第二引物在5’末端被添加了一段RNA聚合酶的启动子序列，通过核糖核酸酶H降解双链RNA-DNA中的RNA，从而获得单链DNA，以所述的单链DNA作为模板，通过DNA依赖型DNA聚合酶合成具有启动子序列的双链DNA，其能转录成由前述RNA序列或该RNA序列的互补序列组成的RNA，其中所述的双链DNA在RNA聚合酶存在下生成RNA转录产物，所述的RNA转录产物作为模板用于随后的通过RNA依赖型DNA聚合酶的cDNA合成中。然而，前述方法存在如下问题。首先，该方法的灵敏度低。根据日本未审专利公开.2001-340087，其中仅指出起始RNA量为至少103拷贝时检测TRH1RNA的数据，而是否可以检测到起始RNA量小于103拷贝(例如，102拷贝)时的TRH1RNA并不清楚。根据日本未审专利公开.2001-340088，其中仅指出起始RNA量为至少103拷贝时检测TRH2RNA的数据，而是否可以检测到起始RNA量小于103拷贝(例如，102拷贝)时的TRH2RNA并不清楚。第二个问题是现有技术中从未报道过既能够检测TRH1又能够检测TRH2的任何试剂，而这是实际应用时所需要的。例如，根据日本未审专利公开.2001-340087，能够检测起始RNA量为至少103拷贝的TRH1RNA的试剂检测不到TRH2。此外，根据日本未审专利公开.2001-340088，能够检测起始RNA量为至少103拷贝的TRH2RNA的试剂检测不到TRH1。第三，没有关于检测速度的任何数据。日本未审专利公开.2001-340087和2001-340088仅公开了自反应开始30分钟后获得的电泳图谱，而反应速度不清楚。因此，本发明的目的在于提供具有优良的灵敏性和速度、能够检测副溶血弧菌TRH1和TRH2的TRHRNA检测试剂。
发明内容为了开发一种用于检测副溶血弧菌耐热性溶血素相关溶血素(TRH)RNA的更灵敏和更快捷的检测试剂，经过深入研究，本发明的发明人开发了一种能够在20分钟内、102拷贝的起始RNA量下检测TRH1或TRH2的试剂。本发明涉及一种用于检测存在于样品中的副溶血弧菌TRH基因的检测试剂，其被用于使用包括以下步骤的RNA扩增程序的检测方法中使用来自所述TRH基因的RNA的一段特定序列，即，所述RNA的至少部分序列，作为模板，通过RNA依赖型的DNA聚合酶，应用具有与所述特定序列互补的序列的第一引物和具有与所述特定序列同源的序列的第二引物，生成cDNA，从而形成双链RNA-DNA，其中第一引物或第二引物的序列在其5’末端被添加了RNA聚合酶的启动子序列；通过核糖核酸酶H降解所述双链RNA-DNA中的RNA部分，从而产生单链DNA；和以所述的单链DNA作为模板，通过DNA依赖型的DNA聚合酶，合成具有所述启动子序列的双链DNA，该DNA能转录成由所述RNA特定序列或互补于所述的RNA特定序列的序列组成的RNA；其中，双链DNA在RNA聚合酶存在下合成RNA转录产物，所述的RNA转录产物作为模板用于随后的通过RNA依赖型DNA聚合酶的cDNA合成中；所述的试剂包括，第一引物，其为由SEQ.IDNo.2所示序列中至少10个连续碱基组成的寡核苷酸，或者在由SEQ.IDNo.2所示序列中至少10个连续碱基组成的寡核苷酸中缺失、替换或添加一个或多个核苷酸后能特异性结合到所述特定序列的寡核苷酸，或者在高严格条件下可以与由SEQ.IDNo.2所示序列中至少10个连续碱基组成的寡核苷酸杂交的、能特异性结合到所述特定序列的寡核苷酸；和第二引物，其为由SEQ.IDNo.1所示序列中至少10个连续碱基组成的寡核苷酸，或者在由SEQ.IDNo.1所示序列的至少10个连续碱基组成的寡核苷酸中缺失、替换或添加一个或多个核苷酸后能特异性结合所述特定序列之互补序列的寡核苷酸，或者在高严格条件下可以与由SEQ.IDNo.1所示序列中至少10个连续碱基组成的寡核苷酸杂交的、能特异地结合到所述特定序列之互补序列上的寡核苷酸。高严格条件指诸如在以下实施例中给出的在44℃温度，60mMTris、17mM氯化镁、100-130mM氯化钾和1mMDTT存在下进行杂交的杂交条件。优选的，上述的第一引物可以是由SEQ.IDNo.2所示的序列组成的寡核苷酸，上述的第二引物可以是由SEQ.IDNo.1所示的序列组成的寡核苷酸。此外，在打算检测与TRH基因来源的RNA互补的RNA时，具有自5’末端到3’末端序列倒转时与上述的第一引物互补的序列的寡核苷酸应被用作第一引物，具有自5’末端到3’末端序列倒转时与上述的第二引物互补的序列的寡核苷酸应被用作第二引物。优选的，上述RNA扩增程序在一段剪切寡核苷酸存在下进行，该寡核苷酸可在上述特定序列的5’末端剪切上述靶RNA，并且具有互补于与所述特定序列的5’末端相邻和重叠的区域的序列。所述的寡核苷酸优选为由SEQ.IDNo.4，5或6所示的序列组成的寡核苷酸。更优选的，上述的RNA扩增程序在一段标记有嵌入荧光染料的寡核苷酸的存在下进行，而副溶血弧菌耐热性溶血素相关溶血素的检测通过测量反应溶液的荧光强度来进行。这里，所述寡核苷酸的序列与mRNA转录产物的至少部分序列互补，在所述寡核苷酸与所述RNA转录产物发生互补结合的情况下，与没有复合物形成时比较，反应溶液的荧光性质发生改变。优选的，上述的寡核苷酸由SEQ.IDNo.3所示序列中的至少10个连续碱基组成。以下提供本发明的详细说明。附图简述图1显示在实施例1中用到的每个寡核苷酸沿着扩增区域所在的位置。图中碱基编号根据文献(Appl.Environ.Microbiol.，58，2449-2457(1992))给出。图2(A)显示实施例2中从10拷贝/检测到107拷贝/检测的起始TRH1RNA量生成RNA时荧光强度比率随着反应时间的增强，(B)显示由初始RNA量的对数值和上升时间而获得的校准曲线。“阴性对照”指的是使用稀释剂代替RNA的样品。在大约15分钟反应时间时可以检测到起始RNA量为102拷贝/检测时的TRH1RNA，并且也观测到起始RNA量和上升时间之间的相关性。图3(A)显示实施例2中从10拷贝/捡测到107拷贝/检测的起始TRH2RNA量生成RNA时荧光强度比率随着反应时间的增强，(B)显示由初始RNA量的对数值和上升时间而获得的校准曲线。“阴性对照”指的是使用稀释剂代替RNA的样品。在大约19分钟反应时间后可以检测到起始RNA量为103拷贝/检测时的TRH2RNA，并且也观测到起始RNA量和上升时间之间的相关性。实现本发明的最佳方式以下提供了本发明的详细说明。在本发明中，尽管序列表中列出的全长碱基序列能被用作第一和第二引物，但是由于大约10个碱基就足以特异性结合到特定核酸序列或其类似物上，因此也可以使用每个序列中的至少10个连续碱基的组合。本发明的扩增程序包括NASBA方法，3SR方法或，例如，在日本未审专利公开2000-014400中记载的RNA检测方法(TRC方法)，其通过反转录酶和RNA聚合酶的协同作用(通过在反转录酶和RNA聚合酶可以协同作用的条件下使它们反应)来扩增TRH1和TRH2RNA。这里，尽管对温度没有特别限定，但优选35至50℃。在本申请上述发明的一个方面中，必须在特定序列的5’端剪切靶RNA。以这种方式剪切靶RNA的一种优选方法优选由如下步骤组成通过添加具有与特定序列5’末端相邻和重叠的区域互补的序列的寡核苷酸(剪切寡核苷酸)，用核糖核酸酶H或类似物剪切靶RNA。所述寡核苷酸优选是由SEQ.IDNo.4，5或6所示的序列组成的寡核苷酸。为了抑制3’末端的延伸反应，在所述剪切寡核苷酸中，3’末端羟基基团优选被化学修饰，例如，被胺化。尽管可以利用已知的核酸检测方法检测上述核酸扩增方法中得到的扩增产物，但在这个方法的一个优选方面，上述核酸扩增优选在标记有嵌入荧光染料的寡核苷酸存在下进行，并随后测量反应溶液的荧光性质的改变。在所述寡核苷酸中，嵌入荧光染料通过接头结合到该寡核苷酸的磷原子上，因此与靶核酸(互补核酸)形成双链的嵌合剂部分嵌入双链部分中，导致了荧光性质的变化，从而导致了本方法不需要分离来进行分析的特征(Ishiguro，T.etal.(1996)NucleicAcidRes.24(24)4992-4997)。被所述寡核苷酸结合的序列可以是对于TRHRNA而言特异的任一序列，并且尽管对此没有具体限定，但优选由SEQ.IDNo.3所示的序列中至少10个连续碱基组成的序列或其互补序列。另外，所述寡核苷酸3’末端的羟基基团优选被化学修饰(例如通过添加羟基乙酸)，从而抑制因使用这段寡核苷酸作为引物而可能出现的延伸反应。这样，在恒温下利用单个步骤，在单管中能快速和高灵敏地扩增和检测副溶血弧菌的TRH1和TRH2RNA，从而有助于自动化应用。尽管以下通过实施例对本申请的发明提供了更详细的解释，但本发明并不限于这些实施例。实施例实施例1比较表1和图1所示(a)至(j)组合在副溶血弧菌的TRHRNA的扩增效率方面的差异。(1)一份含有副溶血弧菌TRH1和TRH2RNA的第1至610位碱基(RNA的碱基编号参照Nishibuchi，等，ApplEnviron.Microbiol.，58，2449-2457(1992))的标准RNA样品(616个碱基)，通过在260nm下紫外吸收来定量，然后用RNA稀释剂(10mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)，1mMEDTA，5mMDTT，0.5U/μlRNase抑制剂(TakaraBio))稀释到103拷贝/5μl。对照组(阴性对照)仅用到了稀释剂。(2)具有以下组成的20μl反应溶液被分装到0.5mlPCR管中(GeneAmp薄壁反应管，AppliedBiosystem)，之后在管中加入5μl上述的RNA样品。此外，预备溶液以将第一引物、第二引物和剪切寡核苷酸按照表1所示方式组合。反应溶液的组成(所示的浓度是在30μl终反应溶液体积中的浓度)60mMTris-HCl缓冲液(pH8.6)17mM氯化镁130mM氯化钾(除了组合(j)中为100mM)6URNase抑制剂1mMDTTdATP，dCTP，dGTP和dTTP各0.25mM3.6mMITPATP，CTP，GTP和UTP各3.0mM0.16μM剪切寡核苷酸1.0μM第二引物1.0μM第一引物25nM标记有嵌入染料的寡核苷酸(YO-TRH-S-G，SEQID.No.3；在距5’末端第5位的“C”和第6位的“A”之间标记有嵌入荧光染料，其3’末端的羟基基团被乙二醇基团修饰)13％DMSO用于调整体积的蒸馏水(3)上述反应溶液在44℃温育5分钟后，加入5μl具有下示组成并在44℃预热2分钟的酶溶液。酶溶液组成(显示的值表示30μl终反应溶液体积中的值)2.0％山梨糖醇3.6μg牛血清白蛋白142UT7RNA聚合酶(Invitrogen)6.4UAMV反转录酶(TakaraBio)用于调整体积的蒸馏水(4)随后，在44℃下温育时，用配有温度控制功能并能直接测量试管的荧光分光光度计，在470nm的激发波长和520nm的荧光波长下，随着时间的变化测量每个PCR管中的反应溶液。(5)表2显示每一个寡核苷酸组合得到的“上升时间”结果(荧光比率增长到阴性对照样品的平均值再加上3个标准差之和的1.2倍时所需的时间)。由于不管使用(a)到(j)中任一组合，都在15分钟内检测出TRH1和TRH2RNA，表明这些组合中用到的寡核苷酸对于检测副溶血弧菌的TRHRNA是有效的。表1表1显示实验体系中用到的第一引物、第二引物和剪切寡核苷酸的组合，以及使用这些组合扩增的特异性条带的长度。对于每一寡核苷酸组合，图1显示了寡核苷酸在副溶血弧菌的TRHRNA中的定位和扩增区域。在剪切寡核苷酸碱基序列的3’末端，羟基基团被胺化。第二引物碱基序列中距5’末端的第1位的“A”到第22位的“A”的区域是T7启动子区域，随后的从第23位的“G”到第28位的“A”的区域是增强子序列。剪切寡核苷酸TR-S22(SEQ.IDNo.4，碱基编号33至54)TR-S26(SEQ.IDNo.5，碱基编号29至54)TR-S30(SEQ.IDNo.6，碱基编号25至54)第二引物TR-F23(SEQ.IDNo.7，碱基编号50至72)TR-F26(SEQ.IDNo.8，碱基编号50至75)TR-F29(SEQ.IDNo.9，碱基编号50至78)第一引物TR-R21(SEQ.IDNo.10，碱基编号225至245)TR-R24(SEQ.IDNo.11，碱基编号225至248)TR-R27(SEQ.IDNo.2，碱基编号225至251)TR-R20+11(SEQ.IDNo.12，碱基编号236至255)表2表2显示用表1所示的寡核苷酸组合，以103拷贝/检测来测定TRH1和TRH2RNA所得到的结果。所有在表1中所示的寡核苷酸组合都在15分钟内检测到TRH1和TRH2RNA。实施例2使用表1中所示的组合(j)检测不同起始拷贝数的副溶血弧菌TRH1和TRH2RNA。(1)类似于实施例1中的副溶血弧菌TRH1和TRH2RNA使用RNA稀释剂(10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA，5mMDTT，0.5U/μlRNase抑制剂(TakaraBio))稀释到107拷贝/5μl至10拷贝/5μl。对照组(阴性对照)仅用了稀释剂。(2)具有以下组成的20μl反应溶液被分装到PCR管中(体积0.5mL，GeneAmp薄壁反应管，AppliedBiosystem)，之后添加5μl上述RNA样品。反应溶液组成(所示浓度是在30μl终反应溶液体积中的浓度)60mMTris-HCl缓冲液(pH8.6)17.85mM氯化镁100mM氯化钾6URNase抑制剂1mMDTTdATP，dCTP，dGTP和dTTP各0.25mM3.6mMITPATP，CTP，GTP和UTP各3.0mM0.16μM剪切寡核苷酸(TR-S26，SEQ.IDNo.5，其3’末端的羟基基团被胺化)1.0μM第二引物(TR-F26，SEQ.IDNo.8)1.0μM第一引物(TR-R20+11，SEQ.IDNo.12)25nM标记有嵌入染料的寡核苷酸(YO-TRH-S-G，SEQID.No.3；在距5’末端的第5位的“C”和第6位的“A”之间标记有嵌入荧光染料，其3’末端的羟基基团被乙二醇基团所修饰)13％DMSO用于调整体积的蒸馏水(3)上述反应溶液在44℃温育5分钟后，加入5μl具有下示组成并在44℃预热2分钟的酶溶液。酶溶液组成(显示的值表示针对30μl最终反应溶液体积的值)2.0％山梨糖醇3.6μg牛血清白蛋白142UT7RNA聚合酶(Invitrogen)6.4UAMV反转录酶(TakaraBio)用于调整体积的蒸馏水(4)随后，当在44℃下温育时，用配有温度控制功能并能直接测量试管的荧光分光光度计，在470nm的激发波长和520nm的荧光波长下，随着时间变化测量每个PCR管中的反应溶液。图2(A)和3(A)显示将加入酶的时间设定为0分钟时，样品的荧光强度比率(预定时间的荧光强度值÷背景荧光强度值)随时间的变化。另外，图2(B)和3(B)显示就起始RNA量的对数值和“上升时间”(荧光比率增长到阴性对照样品的平均值再加上3个标准差之和的1.2倍时所需的时间)之间的关系而得到的结果。此外，起始RNA量的范围是从10拷贝/检测到107拷贝/检测。根据图2和3，在约15分钟内检测到102拷贝的TRH1RNA，而对于TRH2RNA，在约19分钟内检测到103拷贝。此外，由于在约20分钟内，该组合可检测到甚至起始量为103拷贝/检测的TRH1和TRH2RNA，故与现有技术中的方法(日本未审专利公开2001-340087和2001-340088)相比，可以更快地和更灵敏地同时进行TRH1和TRH2RNA的检测。工业实用性按照上述的解释，本发明的检测方法有助于同时高灵敏地检测副溶血弧菌的TRH1和TRH2RNA。本发明的寡核苷酸不局限于序列表中列出的(具有22至30个碱基)序列，而是可以为由这些序列中至少10个连续碱基构成的序列。这是因为明显地，在相对较低的温度(优选44℃)条件下，约10个碱基的碱基序列就足以确保引物或探针对靶核酸的特异性。本领域技术人员应理解尽管已经结合具体的实施方案和实施例对本发明进行了如上描述，但本发明不必局限于此，许多其它的实施方式、实施例和用途，修饰以及由这些实施方式、实施例、用途扩展的内容都可以在不背离本申请的发明范围的情况下实现。序列表<110>东曹株式会社(TOSOHCorporation)<120>用于检测副溶血弧菌的耐热性溶血素相关溶血素基因的检测试剂<130>1033908<160>12<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>TR-F29-T7<400>1actctactttgctttcagtttgctattgg29<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>TR-R27<400>2ttttctttttatgtttcggtttgtcca27<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>YO-TRH-S-G<400>3gattcagtttttattgttgtatttcta27<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>TR-S22<400>4agagttttagtttcataattaa22<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>TR-S26<400>5agagttttagtttcataattaatcct26<210>6<211>30<212>DNA<213>TR-S30<220><223><400>6agagttttagtttcataattaatcctttat30<210>7<211>51<212>DNA<213>TR-F23<220><223><400>7aattctaatacgactcactatagggagaactctactttgctttcagtttgc51<210>8<211>54<212>DNA<213>TR-F26<220><223><400>8aattctaatacgactcactatagggagaactctactttgctttcagtttgctat54<210>9<211>57<212>DNA<213>TR-F29<220><223><400>9aattctaatacgactcactatagggagaactctactttgctttcagtttgctattgg57<210>10<211>21<212>DNA<213>TR-R21<220><223><400>10ttttatgtttcggtttgtcca21<210>11<211>24<212>DNA<213>TR-R24<220><223><400>11tctttttatgtttcggtttgtcca24<210>12<211>20<212>DNA<213>TR-R20+11<220><223><400>12atggttttctttttatgttt20权利要求1.一种用于检测样品中存在的副溶血弧菌耐热性溶血素相关溶血素(TRH)基因的检测试剂，该检测试剂被用于使用RNA扩增程序的检测方法中，所述RNA扩增程序包括以下步骤以一段来自所述TRH基因的RNA的特定序列作为模板，通过RNA依赖性DNA聚合酶，应用具有与所述特定序列互补的序列的第一引物和具有与所述特定序列同源的序列的第二引物，生成cDNA，由此形成双链RNA-DNA，其中第一引物或第二引物在其5’末端添加了RNA聚合酶的启动子序列；通过核糖核酸酶H降解所述双链RNA-DNA中的RNA部分，从而生成单链DNA；和以所述的单链DNA作为模板，通过DNA依赖性DNA聚合酶，合成具有所述启动子序列的双链DNA，其中所述双链DNA能转录为由所述特定RNA序列或者所述特定RNA序列的互补序列组成的RNA；其中，该双链DNA在RNA聚合酶的作用下生成RNA转录产物，所述RNA转录产物作为模板用于随后通过RNA依赖性DNA聚合酶合成cDNA；所述的试剂包括，第一引物，其是由SEQ.IDNo.2所示序列的至少10个连续碱基组成的寡核苷酸，或者是从SEQ.IDNo.2所示序列的至少10个连续碱基组成的寡核苷酸中缺失、替换或添加一个或多个核苷酸后能特异性结合到所述特定序列上的寡核苷酸；和第二引物，其是由SEQ.IDNo.1所示序列的至少10个连续碱基组成的寡核苷酸，或者是从SEQ.IDNo.1所示序列的至少10个连续碱基组成的寡核苷酸中缺失、替换或添加一个或多个核苷酸后能特异性结合到所述特定序列的互补序列上的寡核苷酸。2.权利要求1所述的检测试剂，其中第一引物是由SEQ.IDNo.2所示的序列组成的寡核苷酸。3.权利要求1或2所述的检测试剂，其中第二引物是由SEQ.IDNo.1所示的序列组成的寡核苷酸。4.权利要求1至3中任一项的检测试剂，其中RNA扩增程序在剪切寡核苷酸存在下进行，剪切寡核苷酸具有与所述特定序列的5’末端相邻和重叠的区域互补的序列，并在所述特定序列的5’末端剪切所述靶RNA；其中所述的寡核苷酸是由SEQ.IDNo.4，5或6所示的序列组成的寡核苷酸。5.权利要求1至4中任一项的检测试剂，其中RNA扩增程序在标记有嵌入荧光染料的寡核苷酸存在下进行，并且通过测定反应溶液的荧光强度来检测副溶血弧菌的耐热性溶血素相关溶血素；其中，所述寡核苷酸的序列互补于mRNA转录产物的至少部分序列，并且在所述寡核苷酸与所述RNA转录产物发生互补结合的情况下，与没有生成复合物的情况比较，反应溶液的荧光性质发生变化。6.权利要求5所述的检测试剂，其中标记有嵌入荧光染料的寡核苷酸由SEQ.IDNo.3所示序列的至少10个连续碱基组成。全文摘要本发明涉及一种检测试剂，其用于在特异性扩增TRH1和TRH2RNA的扩增程序中检测耐热性溶血素相关溶血素(TRH)基因，该试剂包括具有与来自TRH基因的RNA的特定序列互补的序列的第一引物，以及具有与所述特定序列同源的序列的第二引物。文档编号G01N33/53GK1637152SQ20041009052公开日2005年7月13日申请日期2004年9月3日优先权日2003年9月5日发明者益田升佳,堀江隆一,保川清申请人:东曹株式会社