成像装置的制作方法

专利名称：成像装置的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及一种成像装置以及一种获得例如样品玻片之类的透明固相上的样品图像的方法。
背景技术：
对结合至一种结合配对物(binding partner)排列的样品——例如从患者身上获得的细胞——进行分析，这已经被提出作为一种诊断手段，所述结合配对物可以是例如玻璃载玻片上的蛋白质微阵列。
类似地，对指示为样品中特定分子例如蛋白质存在的荧光标记物的存在进行分析已被提出作为一种诊断手段。
希望能提供一种装置，用于捕获该样品的数字化图案以便于使用和实施这样的诊断手段。还希望提供一种易于制造的装置，其能为分布于各地的病理学实验室和研究机构网络普遍使用。
至少在优选实施方式中，本发明致力于提供一种紧凑的成像装置以及一种获得样品玻片上样品图像的方法，以适于实施这样的诊断手段。

发明内容
依据本发明第一个方面，提供了一种成像装置，其包括用于承载样品玻片的托架台；用于照亮所述样品玻片的光源，所述样品玻片包括样品阵列；驱动装置，用于相对于样品玻片移动托架台，从而使得光源照亮样品玻片的依次各部分；数字光学摄像系统，其设置成在使用中基本上仅捕获相对于透过样品玻片并射出的光源光线呈一偏移角度而从样品玻片射出的光线的所述依次各部分，以产生一系列的部分图像，该系列图像用以重构样品玻片或样品阵列的图像。
优选地，所述光源为线性光源，其设置成发射基本上窄的光束，籍此，样品玻片被照亮的依次各部分为带状部分，并且所述系列的部分图像为线性图像。
便利地，数字光学摄像系统设置成在使用时基本上仅接收样品玻片上的所述样品阵列处衍射或者偏折的光线。
典型地，数字光学摄像系统包括鉴别装置，用于防止所述摄像系统捕获未被样品阵列衍射或者偏折的光线。
有利地，所述鉴别装置包括至少一个反射器，对该反射器进行定位，用于将以一偏折角从样品玻片射出的衍射或者偏折的光线导向所述摄像系统的成像透镜。
所述数字光学摄像系统装置典型地包括感知线性图像的能进行行扫描的摄像机。
所述数字光学摄像系统可以被设置成在使用中捕获从样品玻片上的荧光标记物发出的光线。
便利地，所述数字光学摄像系统被设置成以至少两种模式工作，即衍射或偏折模式以及荧光模式，在衍射或偏折模式下，摄像机捕获样品玻片上的样品阵列处衍射或者偏折的光线；在荧光模式下，摄像机捕获从样品阵列上的荧光标记物发射出来的光线。
数字光学摄像系统可以被设置成当驱动装置沿第一方向移动托架台时工作在偏折或衍射模式；而当驱动装置沿第二方向移动托架台时工作在荧光模式。
光学摄像系统可以设置成检测光谱可见部分的光线和非可见部分的光线。
典型地，样品包括与样品玻片上的结合配对物结合的细胞阵列。
在本发明的一个形式中，所述成像装置包括取样室以及电元件室，在使用中托架台位于取样室内，电元件室与取样室流体密封地隔开，从而在使用中，防止取样室对电元件室内的元件造成流体污染，托架台包括设置在样品玻片下面的盘子，以在使用中收集从样品玻片溢出的流体。
所述成像装置可以包括用于与一组装置连接的接口单元，该组装置包括外部参考数据库、外部存储数据库、外部个人计算机以及外部打印机中的至少一个。
有利地，所述部分图像和所述重构图像为暗场图像。
本发明延伸到一种成像系统，包括前述类型的成像装置和用于处理所述样品玻片或样品阵列的图像的处理器装置，以为了比较目的而提供代表样品阵列的图像明暗度值。
本发明还延伸到所述的用于处理所述样品玻片或样品阵列的图像的处理器装置，以为了比较目的而提供代表样品阵列的图像明暗度值。
有利地，处理器装置设置成利用在玻片上的已知参照样品而对所述图像进行归一化处理以定位玻片上的每个样品并且度量每个样品的明暗度。
所述处理器装置优选地设置成通过应用基于已知参照样品的参照矩阵或网格(grid)而定位每个样品，利用参照样品来度量网格内每个方格中的样品明暗度，以确定等级范围(range of scale)，并还被设置成从所述图像生成归一化的明暗度值。
本发明还提供一种获得代表样品玻片上样品的图像的方法，该方法包括提供包括样品阵列的样品玻片；将所述样品玻片置于托架台上；照亮所述样品玻片的至少一部分；相对于样品玻片移动所述托架台，从而使得光源照亮所述样品玻片的依次各部分；基本上仅捕获从样品玻片射出的光线中的衍射或者偏折的依次各部分，以产生一系列部分图像，该系列部分图像用于重构产生所述样品阵列的图像。
优选地，所述样品玻片的依次各部分为带状部分，其由一线性光源照亮，并且所述的一系列部分图像被捕获为线性图像。
所述方法有利地包括基本上仅捕获由于样品玻片上的样品或样品玻片上的样品处发生衍射或者偏折的光线的步骤。
优选地，所述方法还包括利用以一种如下方式设置的参照样品用于显示样品的生物学状况以及/或者明暗度比例，该方式使得在获得图像期间在参照样品处衍射或者偏折的光线被捕获。
该方法还可以包括处理经重构的图像以获得与分子轮廓特征库可比较的分子轮廓。
该方法还可以包括为每一个样品产生图像明暗度值、产生图像明暗度的等值线图以识别等强线内的图像目标，并且将一个虚拟的网格置于所述目标上方。
所述方法还典型地包括纠正歪斜的图象、获得一个增强网格以及从该增强网格计算X-Y坐标。
优选地，该方法包括计算每个样品的平均校正明暗度，其中，所述玻片上设置有至少两组相同的样品，并且基于参照样品和重复样品对与每个样品相关的明暗度数据进行归一化处理。
所述方法还延伸到一种成像处理方法，其用于处理从所述装置获得的图像，也涉及一种计算机可读介质，其中存储用于使计算机实现所述方法的可执行指令。


下面将参照附图仅以示例的方式对本发明的优选实施例进行说明。
图1是一示意立体图，示出了本发明第一实施例的成像装置，为清楚起见，所述成像装置的部分外壳移除并只显示了选定的部件；图2是一示意图，示出了图1的成像装置的不同视角，为清楚起见，所述成像装置的部分外壳移除并只显示了选定的部件；图3是一立体示意图，示出了用于本发明成像装置中的样品玻片实例；图3A是图3的样品玻片的俯视平面图；
图4是一示意图，示出了图2的成像装置中的光学几何形状；图5是一示意立体图，示出了本发明第二优选实施例的成像装置；图5A是形成图5成像装置一部分的玻片盘(slide tray)总成的俯视立体图；图6是图1和图5的成像装置的正面示意图；图6A是图5的成像装置的功能框图；图7显示了使用本发明的成像装置样机所拍摄的一个样品玻片的图像；图8显示了一数据阵列，其列出了根据本发明的待被传送到一个图案匹配程序的样品玻片的信息。
图9是一示意图，示出了对于不同样品类型图1和图3中的成像装置的光学几何形状；图10是一流程图，其显示了有关本发明图像获取和处理方法的一个实施例中获取和处理图像的步骤。
图10A显示了本发明的图像处理方法中的一个步骤，其中图像是平滑的并且被标了等值线；图10B显示了进一步的处理步骤，其中虚拟网格设置覆盖在图像上；图10C显示了一直方图，其显示在所处理的图10B的图像中，代表诊断标志物列中结合事件(binding event)的平均明暗度。
具体实施例方式
在所描述的优选实施例中，本发明提供了一种能拍摄一系列连续的暗场线性图像以构建结合细胞阵列(bound cellular array)或包含荧光标记物的样品的偏移平面图像(offset planar image)的成像装置以及方法，其适于识别分子轮廓从而实现一种诊断手段，该诊断手段利用对样品玻片或其他透明的固体支撑媒介上的样品进行分析。所述偏移平面图像被数字重组以提供数字阵列，该数字阵列可传至图案匹配程序或类似的程序以进行分子轮廓识别。
图1显示了根据本发明的成像装置10的示意图。所述装置10包括托架12，该托架用于安装玻片14以对结合在所述玻片14上的结合细胞阵列(图3中的102)进行分析。所述托架12包括两个导杆16、18，其上可移动地安装有玻片固定件20。所述固定件20包括两个为弹簧部件22、24形式的偏置构件以可松开地接收所述玻片14。
所述成像装置10还包括磁牵引步进驱动机构，图1中示出了该机构的牵引杆26。如图2中可以更清楚地看到，所述牵引杆26包括一个用于连接所述固定件20的磁性端部28，所述磁性端部28由适当的磁性材料构成。在所述实施例中，使用磁牵引步进驱动机构具有以下优点提供牵引杆26和固定件20之间易释放的连接，以便于移除所述托架12来对所述托架以及/或者成像装置10的内部进行清洗或其他维护。
图3显示了一个样品玻片14例子的等轴测视图。所述玻片14包括多个包含局部结合事件(localised binding event)的凹部100。具体地，每个凹部100通常含有不同的结合配体，以提供结合配对物102的结合阵列。所述玻片14由基本上透光的材料例如玻璃和适当的塑料材料例如聚苯乙烯或者聚碳酸酯(Cyrolon TX-V)、聚乙烯醇、尼龙或其复合材料形成。这样的支撑材料要么未被处理，要么用吸附剂或者结合增强涂料处理，以促进每个结合配对物的结合。在实施例中，使用位于美国新罕布什尔州基涅市光学大街10号的施莱歇尔和斯首尔生物科学有限公司(Schleicher and Schuell BioScience，Inc，of 10 Optical Avenue，Keene NH03431 USA)生产的FAST型玻片。这些玻片由具有硝基纤维素覆层的高质量玻璃制成。本领域的普通技术人员应理解，存在多种用来把基于蛋白质的材料固定在所述固相材料上的化学和物理方法。每个玻片可包含多达1000或更多的结合事件。
图3A显示了用作诊断白血病中的一种诊断工具的样品玻片14的俯视平面图。结合配对物阵列102包括几排连续(serial)校准点104和106，其用于对齐和明暗度(intensity)修正目的，并且一般覆盖从最亮到最暗的整个预期光学范围。由能代表所述结合配对物的参考结合配对物例如单克隆抗体(monoclonal antibody)组成的外围几排校准点108和110预期产生最暗的图像。同时，所述外围校准点确定了所述结合事件的空间边界以便于图像构造。所述连续的校准点104和106可由单克隆抗体形成，所用抗体可以从预定的高浓度到经逐次稀释的低浓度。诊断标记阵列112和114位于玻片的中央位置，其还包括治疗性标记物子阵列116以及诊断和质量控制(QC)标记物子阵列118。所述阵列112和114基本上是相同的，所以其可用于交互核对的目的，将结果平均可获得更可靠的结果。有关于所述玻片的其他信息包括目录号120、有效期限122以及含有这些信息和有关玻片其它信息的条形码124。
现在返回到图1，牵引杆26延伸通过所述成像装置10内的隔离壁30，所述隔离壁30将所述光学装置10分成取样室32以及电元件室34。在所述实施例中，对所述隔离壁30进行改装，从而在所述取样室和所述电元件室之间提供一个流体密封，从而防止所述取样室32对所述电元件室34内的电元件的污染。
牵引杆26经由密封件36而延伸通过所述隔离壁30，该密封件36适于允许牵引杆26运动，同时保持所述取样室32和所述电元件室34之间的流体密封。可以为拖架12设置承滴盘(drip tray)46，以用于收集分析过程中可能从玻片14滴下的流体。
所述成像装置10还包括发光二极管支架37，用于发射基本上在一平面内的光束38，以获取位于所述玻片14上的结合细胞或蛋白阵列102(图3以及图3A)的图像。光束38初始由第一个镜(未示出)反射，从而将光束38从所述玻片底部导向玻片。在所述玻片的上方，利用第二个镜(未示出)来把初始光束中包含在结合配对物处(未示出)衍射或者偏折的光线的一部分40导向数字摄像装置。当所述玻片或固相等同物以与所述摄像机捕捉图像的能力相一致的速度穿过从光源发射出来的光带时，所述摄像机拍摄玻片或固相等同物处衍射或者偏折的偏移平面光线的连续线性图像。本领域内的普通技术人员可以理解，通过适当调整用于引导所述偏折光束部分的镜构件(未示出)，所述成像装置10可以如下方式改装——基本上仅有被衍射或者偏折的那部分光束40被行扫描摄像机44捕获以用于导出结合阵列的图像。
在图4中，显示了一个示意图，图示出一实施例中的光学几何形状。从发光二极管阵列37发射出的光束38入射在玻片14上。光束38中包含在结合于玻片14上的结合配对物处(未示出)偏折的光线的那一部分40在玻片14后面射出，成为偏折的那一部分40，该部分与未偏折部分43成一角度α。该角度α一般在3-5°范围内，并可通过调整所述镜由经验确定。因此，通过镜45的适当取向，可确保基本上仅有衍射/偏折或偏移平面的部分40被导向所述行扫描摄像机44，而未偏折部分被反射偏离所述摄像机，如42所示。本领域的普通技术人员应理解，包含了在结合于玻片14上的结合配对物(未示出)处偏折或衍射之光线的初始光束的至少另一部分(未示出)预计以相对于未偏折部分43呈角度(-α)出现在玻片14之后。在不同的实施例中，使用适当的反射装置或通过摄像机44的视野中的光学改变(optical variation)，可将其它的衍射/偏折或偏移部分共同地、可选地或附加地导向所述行扫描摄像机44。
本申请人已经认识到，基本上仅利用在结合于样品玻片14上的结合配对物处衍射或由结合于样品玻片14上的结合配对物而偏折的光线使得可以捕获结合阵列的正象(positive image)。换言之，在样品玻片14各区域中的细胞或结合配对物的数量正比于被捕捉图像中的光明暗度，籍此产生暗场图像。此外，可以理解的是捕获正像避免了与照亮光束透射部分的高背景明暗度相关的问题。图7显示了示例性图像60，将在下面对其进行更加详细的描述。
现在参考图5和图5A，这两个图显示了成像装置46的第二优选实施例，其中与第一实施例中相似或相同的部件已进行了对应地编号并添加后缀“a”。托架或玻片盘12a载有样品玻片14a，以用于对设置在所述玻片上的结合阵列102进行分析。包括承载发光二极管线性组的发光二极管支架37a的发光二极管光源发射出指向所述玻片底面的窄光束38a。在具体的实施例中，利用具有490nm蓝光发射波长的五个发光二极管线性组照亮玻片上宽约10mm的带状区域。镜45a把初始光束中包含在结合的结合配对物处衍射或者偏折之光线的部分40a导向能够行扫描的数字摄像装置44a。在该实施例中，使用Basler L101K行扫描摄像机。
包括一对驱动导轨48的玻片托架12a借助于一对驱动辊18a和惰辊70往复移动，所述驱动辊和惰辊使用直流(DC)马达16a转动。压下按钮78将露出所述玻片盘12a以插入样品玻片。所述样品玻片被插入玻片托架12a内的凹部82，且其前缘前推以抵靠弹簧加载的玻片固定件83，同时所述玻片的后缘抵靠玻片止挡件85。一个玻片传感器通过感知切口86在由所述玻片移位时的闭塞来指示所述玻片的存在。窗口87允许光束38a照亮所述玻片的底面，并且指孔88使得所述玻片易于取出和更换。
玻片传感器89感知玻片插入并发信号给控制器50a开始采集。马达16a以一个速度驱动所述玻片盘14a，该速度足以使当所述玻片移动经过从光源37a发射出来的光带38a时，行扫描摄像机44a能拍摄由于所述玻片上的结合细胞而衍射或者偏折的光线的连续各线性图像。行扫描摄像机44a具有一个传感器线性阵列，该阵列宽度为1个象素而长度为1024个象素。在本实施例中，这等于长度为25mm而宽度为0.025mm的线性图像。因此，随着玻片支架向前移动，通过行扫描摄像机44a可以扫描结合细胞阵列的一组连续的线性图像。从图5很清楚地看到未衍射或未偏折的光线42偏离行扫描摄像机的线性孔时是怎样不影响图像形成的。当玻片上的条形码124到达成像区时，其被一个微型开关(未示出)检测到；由此光源37a关闭并且光源90打开以照亮玻片条形码，从而使条形码124包含于图像中。临近传感器81检测所述玻片支架的存在并且向可编程逻辑控制器(PLC)50a发送信号使得驱动马达反转以移除样品玻片14a。如果需要通过荧光染料进行荧光检测，则光源37a恢复到打开状态。通过临近传感器80检测玻片盘上的传感器目标点89来检测玻片盘的完全延伸，且该传感器向控制器发送信号以关闭驱动马达16a。
图6A中，显示了控制成像装置46工作的可编程逻辑控制器50a；临近传感器80和81以及玻片传感器89和按钮78一起作为其输入。可编程逻辑控制器的输出分别包括用于直流马达16a的马达正转和马达反转输出，以及用于显示扫描和出错事件的发光二极管输出48a和49a。可编程逻辑控制器还包括用于分别控制主光源37a和条形码照亮光源90工作的输出，以及帧触发输出91。
以下参照图1、2、5和6对根据本发明的示例性成像装置10和46的基本工作原理进行说明·将显色了的玻片14沿水平方向插入玻片托架12和12A。
·将所述玻片14传送经过所述平面光束38以获得一组线性图像。
·如果成功对玻片14进行连续扫描，则发光二极管48(图6)将显示扫描完成。若不成功，则将启动出错指示器49和可选的声音报警器。诊断提示将显示在所述装置的液晶显示屏(LCD)51上或相关的个人计算机上。附加的指示器包括显示正在扫描的发光二极管49.1，用于显示承滴盘已满的“承滴盘已满”发光二级管49.2，以及当成像装置要求清洗时作出显示的“清洗”发光二极管49.2。
·将所述玻片14从所述装置中弹出并移走。
·在处理单元50(图2)或者一个外部的基于个人计算机的帧抓取卡中处理所述线性图像，并产生液晶显示器51(图6)、串行端口52，以及/或者以太网端口54、或者个人计算机监视器上可用的结果。
在所述示例实施例中，通过使光传播通过玻片，观察由于结合事件而沿一个偏移平面方向衍射或者偏折的光线，使得结合配对物可见。图7中所示的图像60从一组使用该示例实施例的一个原型装置拍摄的线性图像经过依次组合而成。
尽管图像60相对粗糙，本领域的普通技术人员可以理解，有足够的信息用于说明结果。希望可以通过根据本发明而制造出来的扫描装置来捕获更清楚的图像。
在所述示例实施例的原型装置中，通过贯穿所述玻片的一狭窄带(近似2mm)使得细胞可见。玻片相对于光源和摄像机移动，每次移动将摄下一窄条(0.025mm)的图像，然后在处理单元50中重新组合，该处理单元可以是所述摄像机的一部分。可选地，摄像机通过摄像机连线或数据通信线缆与主机中的帧抓取卡进行通信。使用适当的计算机软件进行图像采集和处理。
下面，讨论本发明的示例实施例的另外一些方面。
图像归一化和图像处理由于光源、成像装置、玻片的生物学状况和其它环境条件的变化/退化，对相同的患者样本，不同扫描仪器扫描的图像以及图像的成像时间将不同。可以通过在每个阵列的至少四个拐角和阵列的其它外围区域内使用例如单克隆抗体(Mab)62(参照图7)的参照结合配对物而使图像归一化，方法如下·显示所述玻片的生物学状况；·为每个点的明暗度设置一上限，并通过对阵列周围背景的测量可以设置一个从零到最大细胞结合的明暗度值范围，并因此衡量结果。这将使系统中的任何变化/退化最小化。
·为结合配对物限定空间边界，且一旦建立则为所述结合配对物的模式识别限定空间边界。
单克隆抗体(Mab)62也可帮助定位每一阵列上的点。一旦每个阵列的拐角确定了，则可以在所述图像、定位的或其它非参照的结合配对物上覆盖一虚拟网格。然后应用本领域的普通技术人员所公知的技术除去背景并且强化图像。则可使用网格中每个方格的平均明暗度来对阵列中每个点上结合的细胞进行定量。已经能容易地获得对例如0～100的所得比例或等效象素密度的量化。现在希望能够获取大大超过这一数值范围的量化水平。本领域的普通技术人员可以理解，根据具体的处理要求，可以在不同的实施例中使用更多或更少的参照结合配对物。该处理可以本地处理或者远离摄像机处理，并且图像捕获后可立即处理或稍后再处理。
图8显示了一矩阵，该矩阵示出了从一阵列获得的数字信息，该数字信息传给一个模式识别程序以识别分子轮廓。
下面模型概括了在实施本发明的扫描仪器和与其通信的其它装置之间的相互作用的例子。
所述装置优选地可与以下装置通信·外部或内部的计算机以及打印机，例如病理学计算机以及打印机，并且可能需要与已有的数据通信标准和协议保持一致；·一个参照数据库。
下面，将简要地概括在应用本发明的扫描装置前后的其它过程的示例。
扫描之前的过程以示例的方式，将玻片显色如下将样品转移到玻片上并对其培养，然后将所述玻片在磷酸缓冲盐水中洗两次，使用化学试剂进入细胞内蛋白隔室(intracellular protein compartment)或者不使用，使用荧光活性分子例如荧光染料标记物(指的是下面参照图8描述的不同样品类型例子)或者不使用，甲醛固定，然后在磷酸缓冲盐水中洗两次或多次。
扫描之后的过程所述玻片将被扔弃进生物垃圾中。
所述扫描装置优选地用适当的材料设计并具有适当的特征，以使该扫描装置能够·用温和的去污剂进行外部清洗；·不会污染玻片(生物学的或其它的)；·允许玻片容器能被清洗、消毒和排出可能从玻片溢出的任何液体；·接受标准的玻璃玻片格式或等价物并维持超过500,000个工作周期。
图9为一示意图，示出了根据本发明的成像装置中用于双重检测方式工作的光学几何形状。在该实施例中，从能够以变波长发射的发光二极管光源110朝样品玻片114的底面发射大致平面的光束116。如上参照图4所述，光束116的一狭窄部分透过玻片114并作为一透射部分118从样品玻片114的顶部射出。
在图9所描述的结构中，样品玻片114含有样品，其中已经使用了荧光标记物来确认结合配对物样品中特定分子比如蛋白质的存在。在本实施例中，选择窄束光源110使在它的光谱中含有适于激发荧光标记物并导致该荧光标记物发光的波长。如图9所示，从荧光标记物所发射出来的光可认为从一点光源发出的，因此产生了全方向的光发射场120，从而产生用于后续重构的一系列线性图像。
相应地，通过镜元件122，所述全方向荧光发射的一部分——如箭头124所示——被导向一个数字摄像装置，该装置可以是能进行单色和多色检测的行扫描摄象机126，例如Basler L301KL。通过适当选择镜122的角度位置，可以保证照明光束116的透射部分118在反射镜元件122处如126所示反射偏离行扫描摄像机，即“采集(collection)”角相对于透射光束部分118偏移。
每一图像的光衍射/偏折和荧光检测——两者都需要线性图像的重构——被同时或者交替地导向行扫描摄像机。当平面光源发射的光的波长近似于荧光活性分子的激发波长时双重检测方式工作最佳。但在另一个实施例中，在通过或交替或同时的操作模式——这取决于摄像机的多色检测能力——而把平面图像和/或偏移平面的图像导向摄像系统之后，出现了不同的荧光活性分子的多路传输。
在本发明的一个实施例中，对行扫描彩色摄像机进行设置，使其在玻片前移过程中检测衍射或偏折的光，而在玻片从所述装置中抽出的玻片倒退过程中检测发出的荧光。摄像机相应地在玻片前移过程中工作在单色检测模式下，而在玻片倒退过程中转为多色检测模式。在返回过程中所述玻片以较低速度运动，以允许更多的暴露时间从而检测荧光染料发出的较弱信号。可以使用适当的带通滤波器例如由Omega Optical，Inc.提供的Omega滤波器以及Chroma Technology Corp.提供的Chroma滤波器，以确保对于所选择的染料/核酸复合物使用正确的波长以激发激发峰和发射峰。不过优选对光波长进行选择使得不需要滤波器而使用软件调节的鉴别就可实现可检测的激发。在本实施例中，发蓝光的发光二级管装置由于适用于绿色荧光染料的细胞跟踪器而被选定。可以理解，可以使用发双色或三色光的二极管以提供能够激发更多荧光染料的更宽范围的波长。确定每个结合事件的图像重构基于由每种检测模式中导出的一个或多个数字图像。
下面将参考流程图10以及相应附图对前面参考图7和8提到的图像归一化和图像处理过程进行更详细说明。如130所示，成像装置10或者46按照在前面所提到的方式产生数字数据。作为摄像机一部分的帧抓取卡或外部微处理器中的图像抓取软件将连续地将各线性部分构造成一幅合成的原始图像(图8)，如132所示。图像处理软件导入原始合成图像用来为每个结合事件产生图像的明暗度值，如134所示。
图像处理的方法包括对合成图像进行平滑处理以去除像素明暗度的高频变量，如136所示，然后在生成和显示所有明暗度的呈等值线形式的一组同心线之前，把图像转换成对数标度亮度下的8个灰度等级，如步骤138所示。平滑处理去除了图像上能使等值线参差不齐或者产生间隙的高频信息。使用256位查询表将图像转换成对数刻度亮度下的8个灰度级，将所有的图像亮度级别转变为下述值，即1、2、4、8、16、32、64和128。使用图像像素的亮度值作为索引来查询这个阵列。不同的灰度等级之间的分界线用于产生等值线。
等明暗度图由最大明暗度值像素即明暗度值为255的白色像素的背景构成。这个过程通过访问x和y循环内的所有像素而遍历所述图像。每个当前被访问到的像素被看作是周围8个像素的中心。如果程序搜索到八个邻域像素中任一像素的明暗度值比中心像素明暗度值大的话，就把这个中心像素标记为位于一条等值线上。标记的过程是把该像素值(pixel value)(1，2，4，8，16，32，64，128中的仅仅一个)拷贝到第二个数组中以仅仅保存图像等值线的像素。结果是生成了一个和图像尺寸一样的数组，除了等值线上的像素保持比其邻域都暗的外部边缘区域的明暗度值外，所有其它像素值设为255。图10A中的140显示一个由图7中的图像生成的典型等明暗度图。
等值线中的所有图像目标被定位和识别出来，并且提供对它们的环状(circularity)的确认和增强，如步骤139所示。在随后的归一化步骤142中，进行与等值线有关的图像增强以去除过多的暗色，因此进一步增强了环状，且进一步归一化图像，以更突出整个阵列中的明暗度的空间变化。具体地，通过以上步骤分隔出的每一等值线现被分类为一个单独的图像目标。当每条等值线都被分类后，其像素被添加到一个尺寸和图像相同的“已处理”阵列中。这允许通过查询这条线的任何一个像素而快速地识别给定的等值线是否已经被处理过。该像素的坐标值用来访问在“已处理”数组中的对应元素，该数组在之前已经被清空过了。
等明暗度图数组的每个像素都被x和y循环遍历到。如果某个像素被发现是一条新(未处理过)等值线的一个成员，其坐标就被传送到ImageObjectPixelsFind方法中，该方法可以找到等值线上其它的像素并且把该等值线规类为开的或者闭的。
这种方法可以找到等值线上的所有像素并且将每一个在“已处理”数组中标记为“已处理”。其还返回两个其它数组RegionX()和RegionY()，所述两个数组存储等值线上每个像素的对应X和Y坐标。这两个数组基本上列出了等值线上的所有像素。然后将包含在这两个数组中的像素的坐标值拷贝到图像目标(即等值线)的数组中。这个数组存储了每一个图像目标的所有像素列表，也存储了该目标的像素个数，以及该目标的灰度标度亮度(也就是包含一个用对数灰度标度亮度等级表示的灰度标度区域的等值线)。
结果是每个图像目标(用等值线表示)被识别出来并且在ImageObject()数组中列出，并且可以通过处理该目标的像素列表中的每个像素而对其快速地遍历。如果等值线超过45个像素的环形目标的数目小于10，则可由下列信息来拒绝该图像“这幅图像的质量太差以至于无法进行处理(没有足够的可识别点)。或许玻片已经干了？请重新弄湿再重新扫描或者重新进行处理。”图像目标被归类为环形的或者非环形的。可以通过分析单一图像目标的方法进行这种归类。在处理图像上每个目标的循环中都调用这个程序。还有一个用于计算目标等值线长度并判断是开目标还是闭目标的程序。封闭意味着等值线是一个条环线。开意味着它是一条两端点不重合的线。每个目标都有一条连续的等值线。程序还用ImageObjectCenter来寻找任一闭目标的中心位置，以及其在X、Y方向上的直径。利用目标的周长和其直径信息，程序可以将目标分类为环形和非环形。
结果是某些图像目标被分类为环形。这些是阵列上的等值点的候选者。很多这些目标的中心将和阵列上点的中心重合。这些目标及其中心的定位过程完成了将阵列某处定位于图像上的任务中的最困难部分，并且允许虚拟网格于其上准确对齐。
图像增强的程序增强了图像来仅显示那些包含重要信息的亮度区域。通过去除那些包含很少信息的很暗区域将提高图像信息部分的对比度。这将使得检测环形区域指示点更加容易，也可以通过图像的归一化来提高诊断的准确性。
搜寻那些亮度级包含有信息的一种方法是查找包含任何环形区域的第一个对数亮度级(从最暗的亮度开始)。等亮度线的亮度是以8个等级覆盖1到128，每次亮度加倍。包含至少一个合适环形目标的第一个亮度级被标识为等级n。然后图像被重新处理，只显示在等级数为n-1的亮度B(Bn-1)和255之间的信息。这个步骤通过用以下公式对图像的每个像素进行处理，得到对比度增强的新图像的象素PixelValue(x，y)新＝Max(0，(255*(PixelValue(x，y)旧-Bn-1)/(255-Bn-1))))该公式应用于所述图像的所有象素坐标x，y。
Max()函数只是保证新的像素不会具有负亮度值。
新的增强之后的图像在第二个阶段被完全重新处理以获得一组新的等值目标。这包括完全重新产生所述8等级亮度的区域和等值目标并且重新对它们进行分类。然而，在第二阶段的处理过程中，增强过程显然被省略掉了。这一步如146所示，即初始放置虚拟网格147于所述图像上，如图10B所示。
为了找到数组的列，在所述图像范围内做一个表示环形目标数目的直方图，其中图像的x坐标落在每一个直方图单元内。直方图单元为一个像素宽。该直方图延伸正好跨过所述图像的宽度。当找到列的时候，忽略环形目标的y坐标。(使用相似的过程寻找行，只不过这时直方图顺着数组往下画，x和y坐标的使用是颠倒的。)如果点落到了列中，则直方图将在每一列中显示一个峰值。
通过观察峰值且找到最完整的列的分隔，可确定网格上每一列的位置，除非在图像上只有太少的几个点而不能这样做。直方图需要平滑以保证可靠地发现其峰值。
如果直方图的峰值被抹掉了，或者存在位置非常接近的双峰，这幅图像多半是倾斜了。为了便于算法评估、测试和调试，把直方图画成图像上的一个覆盖图可以起帮助。这样，至少有一些数组的行和列的位置是知道的，可以建立列分隔和行分隔，这允许建立数组设计和数组图像之间的长度转换比例。
如果可能，每个图像目标都被分配到一个已标识的网格行中。任何被标识为环形和位于有效列上的图像目标，只要它满足特定限制，被分配到所标识的行中的一行。
由于各种不同的因素，假设行的倾斜与列的倾斜一样是不可靠的。也就是说倾斜可能并不都是由图像的旋转引起的，其中一些可能由于其它方式的图像扭曲。因此竖直和水平方向的倾斜应分别消除。然而，这里假定倾斜是线性的，且其他任何高阶的变形在此不做校正。
对于每一个找到的网格列来说，列的斜率通过将标识为落在那一列图像目标的x，y坐标拟合为一条直线来确定。这个拟合通过标准最小方差的方法来实施。对所有列的斜率取平均来找到图像的平均竖直斜率。流程图中的150显示了纠正歪斜图像的步骤。行的斜率通过一种类似的方法找出并校正。
一旦倾斜的图像被纠正了，则在增强后的校正图像上再次重复进行一次图像分析，即重构图像区域和等值线，并对图像目标进行重新分类。显然在第三阶段中跳过图像增强和倾斜纠正的过程。
那些在合理边界内的落在行列交叉处的环形目标被分类为点。其他图像目标没有被分类为点并且在下面的处理过程中被忽略掉。
前面生成的行和列分隔用来生成近似的X和Y比例(可能有很大不同)。这些比例可以用来将图像像素转换成毫米，反之亦然。因此，如流程图中的步骤152所示，玻片的尺寸与图像数组的尺寸相关。
玻片的第一列和最后一列被用于将数组定位于支持所述数组的那部分图像上。X坐标可以从数组的第一列和最后一列得知，由这两列可以计算出其余内部列的坐标。
如图10B所示，显示了所述图像与虚拟网格的叠加。坐标中心是通过寻找与每一个平面角点最近的图像数据来定位的。对于操作员而言，增强并且纠正倾斜后的图像被所述推断出来的环形的角点覆盖。在由于图像质量太差而角点定位失败的情况下，操作员可以选择定位角点。当操作员点击最后的点时，这个定位用来使玻片平面置于阵列图像之上。
利用新的角点位置可以计算出图像像素和毫米之间更为精确的转换比例。这就使得代表玻片数组区域平面的虚拟网格准确地位于数组的图像上方，因此每个点都位于其自身网格方块的中心位置。
通过比较沿适当方向的呈像素的四个角点之中心的x-y坐标，以及由玻片定义(Slide Definition)得出的这些角点在阵列平面上的毫米距离，可以计算出将像素转换成毫米的新的x和y的比例。
行的情况相对比较棘手，因为数组顶行和底行的区分要弱于从左列到右列，其拥有逐渐稀释而不能在图像上全部清楚显示的抗体亚型。此外，液体、来自液体边缘的伪造光线(spurious light)和波，和/或从玻片顶部或者底部开始的逐渐干燥可能将一整行顶行或者底行弄得模糊，并且由于有些行可能几乎没有可见点，因而在前期处理阶段并非所有的行都可以被识别。
因此利用一种不同的算法来将玻片平面沿竖直方向对齐在图像上方。首先用前面得到的近似比例将行间隔转换成毫米。然后总体上(conceptually)将玻片设计沿图像的竖直方向上下滑动，寻找(a)被视为左右边缘点的环形图像目标和(b)平面上边缘点之间的最佳匹配。这是一个单向迭代的过程，总体上使平面沿着图像移动，每次一个像素，然后对每一个图像点和平面上离它最近的点的距离求和。当在迭代的过程中该距离最短时，它的像素指标被记录下来。当迭代结束时，这种具体的定位就是将玻片在阵列图像上方对齐的最佳估计。
如果检测到点读入错误，输入的数据保存在屏幕上，操作员可以选择重新扫描图像，如180所示。
在步骤158，利用已辨识各点的平均修正明暗度来计算背景修正。明暗度值逐一地被读出。如图10C所示，每个象素从0到255的图像明暗度形成了一个直方图162，该象素在包含该点的网格方块定位器内。找到局部背景明暗度并将其定义为像素亮度级M。M将区域中的像素分为两组，即包括亮度比M暗或等于M的所有象素的较暗组A，以及包括比M亮的所有象素的较亮组B。组A中的像素数目与组B中的像素数目具有预定比例，一般为50％。
在确定了哪些像素为局部背景(如上)后，现在计算每一点的相对亮度就变得容易多了。
该处理过程开始于根据点区域的计算半径而对点区域内所有像素明暗度值求和。该算法还要考虑那些部分位于点半径内的像素，根据位于点内的像素部分对按比例计算的分数部分进行累加。和值(Delta)是小于以上计算的局部背景亮度的象素亮度。
然后通过使和值除以包括小数部分的在点内的像素总数，则可以计算出每个像素和的平均值(InnerAverageValue)。
然后通过取InnerAverageValue并且使之归一化表示成与局部背景上的最大可能亮度的比值来得到点的值。
如步骤164所示，一旦点的值被确定下来并且写入了如图8所示的矩阵，则软件可以进行一个迭代的方法以使未知的点图案或者分子轮廓与从病例特征库中已知的被公认的图案最佳匹配。在166中提供了分子轮廓的图和表的形式，对照公认的图案库并根据一种分级方法对最佳匹配的分子轮廓进行确认，作为诊断或预后的依据。如果不令人满意可以在步骤168重复分析，或者在步骤180重新扫描图像。一旦获得了匹配的分子轮廓，则打印诊断报告并将数据发送到中央数据库，如步骤170所示。
本领域的普通技术人员可以理解，可以对如所述特定实施例所示的本发明进行多种修改和/或改变，而不背离广泛说明的本发明的思想和范畴。因此本实施例的各方面应视为是示例性的而非限制性的。
比如，虽然已经说明了某种样品材料，可以理解本发明不局限于对特定样品材料的分析。此外，可以理解本发明不仅仅局限于用于诊断或预后。
在接下来的权利要求和本发明的摘要中，除非上下文要求，由于表达语言或者必要的含义，词“包含”的意思与“包括”相同，即具体特征可以与本发明各种实施例中的其他特征相关。
权利要求
1.一种成像装置，包括用于承载样品玻片的托架台；用于照亮所述样品玻片的光源，所述样品玻片包括样品阵列；驱动装置，用于相对于样品玻片移动托架台，从而使得光源照亮样品玻片的依次各部分；数字光学摄像系统，其设置成在使用中基本上仅捕获相对于来自该光源的穿过该样品玻片并射出的光线以一偏移角从样品玻片射出的所述依次各部分的光线，以产生一系列的部分图像，该系列图像用以重构样品玻片或样品阵列的图像。
2.如权利要求1所述的成像装置，其中，所述光源为线性光源，其设置成发射基本上窄的光束，由此，被照亮的样品玻片的该依次各部分为带状部分，并且所述系列的部分图像为线性图像。
3.如前述权利要求中的任一项中所述的成像装置，其中，该数字光学摄像系统设置成在使用时基本上仅接收样品玻片上的所述样品阵列处衍射或者偏折的光线。
4.如前述权利要求中的任一项中所述的成像装置，其中，数字光学摄像系统包括鉴别装置，用于防止所述摄像系统捕获未被样品阵列衍射或者偏折的光线。
5.如权利要求4所述的成像装置，其中，所述鉴别装置包括至少一个反射器，该反射器被定位成以该偏移角将从样品玻片射出的衍射或者偏折的光线导向所述摄像系统的一个成像透镜。
6.如权利要求4或5中任一项所述的成像装置，其中，所述数字光学摄像系统装置包括一个可感知线性图像的能进行行扫描的摄像机。
7.如前述权利要求中的任一项中所述的成像装置，其中，所述数字光学摄像系统被设置成在使用中捕获从样品玻片上的荧光标记物发出的光线。
8.如前述权利要求中的任一项中所述的成像装置，其中，所述数字光学摄像系统被设置成以至少两种模式工作，即衍射或偏折模式以及荧光模式，在衍射或偏折模式下，摄像机捕获样品玻片上的样品阵列处衍射或者偏折的光线；在荧光模式下，摄像机捕获从样品阵列上的荧光标记物发射出来的光线。
9.如权利要求8所述的成像装置，其中，当驱动装置沿第一方向移动托架台时，数字光学摄像系统设置成工作在偏折或衍射模式；当驱动装置沿第二方向移动托架台时，数字光学摄像系统设置成工作在荧光模式。
10.如前述权利要求中的任一项中所述的装置，其中，光学摄像系统设置成检测光谱可见部分的光线和非可见部分的光线。
11.如前述权利要求中的任一项中所述的装置，其中，样品包括与样品玻片上的结合配对物结合的细胞。
12.如前述权利要求中的任一项中所述的装置，其中，所述成像装置包括取样室以及电元件室，在使用中托架台位于取样室内，电元件室与取样室流体密封地隔开，从而在使用中，防止取样室对电元件室内的元件造成流体污染，托架台包括设置在样品玻片下面的盘子，用于在使用中收集从样品玻片溢出的流体。
13.如前述权利要求中的任一项中所述的装置，其中，所述成像装置包括用于与一组装置连接的接口单元，该组装置包括外部参考数据库、外部存储数据库、外部个人计算机以及外部打印机中的至少一个。
14.如权利要求6所述的装置，其中，所述能进行行扫描的摄像机为适于对具有一像素宽度的线性图像进行扫描的行扫描摄像机。
15.如前述权利要求中的任一项中所述的装置，其中，所述部分图像和所述重构图像为暗场图像。
16.一种成像系统，包括如前述权利要求中的任一项所述的成像装置和用于处理所述样品玻片或样品阵列的图像的处理器装置，以为了比较目的而提供代表样品阵列的图像明暗度值。
17.如权利要求16所述的系统，其中，处理器装置设置成利用玻片上的已知参照样品而对所述图像进行归一化处理，以定位玻片上的每个样品并且度量每个样品的明暗度。
18.如权利要求16或17中的任一项所述的系统，其中，所述处理器装置设置成通过应用一个基于已知参照样品的参照矩阵或网格而定位每个样品，利用参照样品来度量每个网格内方格中的样品明暗度，以确定等级范围，并还被设置成从所述图像生成归一化的明暗度值。
19.一种获得代表样品玻片上样品的图像的方法，该方法包括提供包括样品阵列的样品玻片；将所述样品玻片置于托架台上；照亮所述样品玻片的至少一部分；相对于样品玻片移动所述托架台，从而使得光源照亮所述样品玻片的依次各部分；基本上仅捕获从样品玻片射出的光线中的衍射或者偏折的依次各部分，以产生一系列部分图像，该系列部分图像用于重构所述样品阵列的图像。
20.如权利要求19所述的方法，所述样品玻片的被照亮的依次各部分为带状部分，其由线性光源照亮，并且所述的一系列部分图像被捕获为线性图像。
21.如权利要求19或20中的任一项中所述的方法，其中，所述方法包括基本上仅捕获由于样品玻片上的样品或在样品玻片上的样品处发生衍射或者偏折的光线的步骤。
22.如权利要求19到21中的任一项中所述的方法，其中，所述样品包括与样品玻片上的结合配对物结合的细胞。
23.如权利要求19到22中的任一项中所述的方法，其中，所述方法包括捕捉从样品玻片上的荧光标记物发出的光线的步骤。
24.如权利要求23的一种方法，所述方法包括捕捉以衍射或偏折模式发出的光线，以及以荧光模式从所述荧光标记物发出的光线。
25.如权利要求24的一种方法，所述方法包括捕捉通过第一通道以衍射或偏折模式发出的光线以及通过第二通道以荧光模式发出的光线。
26.如权利要求25的一种方法，其中，第一通道沿第一方向，而第二通道沿相反的第二方向。
27.如权利要求19到26中的任一项中所述的方法，其中，所述方法还包括利用以一种如下方式设置的参照样品用于显示样品的生物学状况以及/或者明暗度等级，该方式使得在获得图像期间在参照样品处衍射或者偏折的光线被捕获。
28.如权利要求27所述的方法，其中，参照样品为参照结合配对物，而所述样品为细胞结合事件。
29.如权利要求19到28中的任一项中所述的方法，其包括处理经重构的图像以获得与分子轮廓特征库可比较的分子轮廓。
30.如权利要求29所述的方法，所述方法包括为每一个样品产生图像明暗度值、产生一个图像明暗度的等值线图、识别等强线内的图像目标，并且将一个虚拟的网格置于所述目标上方。
31.如权利要求30所述的方法，所述方法包括纠正歪斜的图象、获得一个增强网格以及从该增强网格计算X-Y坐标。
32.如权利要求30到31中的任一项中所述的方法，其包括计算每个样品的平均校正明暗度，其中，所述玻片上设置有至少两组相同的样品，并且基于参照样品和重复样品对与每个样品相关的明暗度数据进行归一化处理。
33.一种大致如本文参考相应附图所描述的成像装置。
34.一种大致如本文参考相应附图所描述的成像系统。
35.一种大致如本文参考相应附图所描述的、用于获得表示样品玻片上样品的图像的方法。
全文摘要
一种成像装置(46)，其包括用于承载样品玻片(14a)的托架台(12a)，样品玻片包括含有细胞结合事件之样品的微阵列；线性光源(37a)，其用于照亮样品玻片(14a)；以及马达驱动装置(16a)，其用于相对于所述样品玻片(14a)移动所述托架台(12a)，这样所述光源(37a)照亮所述样品玻片(14a)的依次各部分。数字光学行扫描摄像系统(44a)设置成在使用中基本上仅捕获光线(40a)的依次各部分，该光线(40a)以相对于透过样品玻片(14)并射出的来自光源的光线(42a)的一偏折角度从样品玻片射出，以产生一系列线性暗场图像，对该系列图像的整理将重构所述样品玻片或样品阵列的合成图像。
文档编号G01N21/64GK1748138SQ200480003697
公开日2006年3月15日 申请日期2004年3月1日 优先权日2003年2月28日
发明者约翰·亚历山大, 迈克尔·布鲁斯·钱德勒 申请人:美德赛克有限公司