用于相位测量的系统和方法

专利名称：用于相位测量的系统和方法
技术领域：
这份申请是美国专利申请第10/823,389号(2004年4月13日提交)的部份后继申请，而第10/823,389号专利是第10/024,455号的部份后继申请(2001年12月18日提交)，并且要求美国专利临时申请第60/479,732号(2003年6月19日提交)的权益。上述申请的全部内容在此通过引证被完整地并入。
背景技术：
以相位为基础的光学干涉测量技术已被广泛地用于需要亚波长距离灵敏度的光学距离测量。光学距离被定义为折射指数和长度的乘积。然而，大多数这样的技术被在该领域中众所周知的问题限制在能被定义为叙述轴向扫描的干涉图彼此远离方面的困难的2π模糊度或整周模糊度。以未修改的谐波相位为基础的低相干性干涉测量法(LCI)能用来确定差值光学距离(nλ2-nλ1)L，其中L是实际距离，nλ1和nλ2是在各自的波长λ1，λ2下的折射指数，如果光学距离逐渐增加以致用LCI测量的差相位能通过它的2π叠加被跟踪。为了确定溶液中DNA的(nλ2-nλ1)，举例来说，DNA浓度在测量试管中逐渐增加。尽管这样的测量方式在受控的环境中正常工作，但是它在样品的可操作性较低的情况下无法实现。例如，该方法对被迫完整保存的固定的厚板材料不起作用。
问题在于未修改的LCI不能叙述轴向扫描的干涉图彼此远离这一事实，在此被描述为2π模糊度问题。这是困扰大多数基于相位的光学干涉测量技术的问题。因此，这些技术不能完全地确定光学距离。所以，大多数这样的技术被用于诸如计算连续表面的结构或探测随时间改变的距离变化之类的应用，其中相位展开通过在相邻点之间或在小的时间增量之上的相位的比较是可能的。
在许多应用中，重要的是定量地测量透过样品或从样品反射的光波的相位。具体地说，透过生物样品或从生物样品反射的光波的相位光波能在活的或无生命的细胞中形成有效的结构和功能探头。
干涉测量法是用来测量光波的相位的用途广泛的技术。定量的干涉测量法的一个共同问题是对由于诸如振动、空气运动和热漂移之类的外部微扰造成的相位噪声的敏感性。因此，仍然需要解决相位噪音问题的相位测量系统。
干涉测量法是得到与样品相关联的相位信息的一种途径。诸如相位对比和Nomarski显微镜之类的技术仅仅作为对比要素使用光学相位，不提供关于它的数量的定量信息。存在一些用来测量透过几乎透明的样品的光波的相位的技术。这些包括数字记录型干涉显微镜(DRIMAPS)和经由强度方程传递的相位分布图的非干涉仪探测。
反射干涉测量法能够有比所用光波的波长小很多的灵敏度。按几分之一纳米或更小比例的测量在度量衡学和微细结构表征方面是常见的。然而，在诸如生物细胞和组织之类微弱反射样品上用纳米级的干涉测量法的已经完成的工作很少。光学相干性断层摄影术(OCT)——使用生物样品的干涉测量技术——主要是与振幅有关而不是与来自反射光波的干涉的相位有关，所以在分辨率方面被局限于所用光波的相干长度，通常是2-20微米。
引用相位的反射干涉测量法已经用来测量单层细胞的体积变化。所用的基于谐波相位的干涉仪需要两个光源，是相对低的(5赫兹)，而且在所述带宽有大约20mrad的相位灵敏度。因此，仍然需要解决相位噪声问题并且帮助开发不同的成像应用的有效的相位测量系统。

发明内容
本发明的优选实施方案涉及处理诸如相位噪声之类的问题的相位测量系统，例如，使用包括但不限于共向光程干涉测量法、相位参比、主动稳定和差动测量的若干种策略的组合。实施方案涉及用光波使组织或小的生物体成像的光学装置。这些实施方案能被应用于，例如，细胞生理学和神经科学领域。所述优选的实施方案以相位测量和成像技术的原理为基础。使用相位测量和成像技术的科学动机起源于，例如，亚微米水平的细胞生物学，它能不受限制地包括发育异常、细胞通讯、神经元传输和使用遗传密码的程序的执行的成像源。亚细胞组份的结构和动力学现在不能使用现有的方法和技术(包括，例如，X射线和中子散射)在它们的自然状态进行研究。反之，纳米分辨率的以光波为基础的技术使细胞机器能够在其自然状态进行研究。因此，本发明的优选实施方案包括以干涉测量法和/或相位测量的原理为基础的系统，并且被用于研究细胞生理学。这些系统包括使用光学干涉仪测量相位的低相干性干涉测量法(LCI)，或其中使用细胞组份本身之内的干涉光波散射光谱学(LSS)的原理，或在替代方案中，LCI和LSS的原理能被结合起来导致本发明的系统。
相位测量和成像系统的优选实施方案包括主动稳定的干涉仪、隔离干涉仪、共向光程干涉仪，而且能包括使用空间光波调制的相衬显微镜。
在优选的实施方案中，本发明的方法涉及优选以亚纳米精度的，基于精确的相位测量任意长的光学距离的技术。本发明的优选实施方案使用有谐波关系的光源(一个连续波(CW)和有低相干性(LC)的第二光源)的干涉仪，例如，Michelson干涉仪。低相干性来源提供宽广的光谱带宽，优选的是，就1微米(μm)的波长而言带宽大于5nm，例如，必需的带宽能随着波长和应用变化。通过在目标样品的扫描之间微调低相干光源的中心波长，在CW和低相干性光波的外差信号之间的相位关系能用来以亚纳米精度测量反射界面之间的分离。因为这种方法是完全没有困扰大多数基于相位的技术的问题——2π模糊度，所以能用来在不降低精度的情况下测量任意长的光学距离。本发明的方法的优选实施方案的应用是在已知实际厚度的样品的给定波长下精确确定样品的折射指数。本发明的方法的优选实施方案的另一个应用是用已知的折射指数精确确定样品的实际厚度。本发明的方法的优选实施方案的进一步的应用是在两个给定的波长下精确确定折射指数比。
在其它可能的优选实施方案中，低相干光源提供带宽足够宽的光波，优选大于5nm，以便同时提供各自的中心波长彼此分开大约2nm以上的第一低相干波长和第二低相干波长。所述低相干波长的频谱不充分地重叠。附加的探测器和滤波器被安排在干涉仪中以便传输和探测两个低相干波长。
优选实施方案的方法能用来进行精确的光学距离测量。依据这样的测量结果，目标物体的光学性质能被精确地测量。通过测量目标的色散分布图，可以估计目标的结构和/或化学性质。该色散分布图把各种不同的波长下的折射指数差绘成图。在生物医学背景中，本发明的优选实施方案通过非接触和非侵入的方式精确确定生物组织的色散性质。所述色散测定能用在眼睛的角膜或水样液上。所实现的灵敏度足以探测依葡萄糖浓度而定的光学变化。在本发明方法的优选实施方案中，血液的葡萄糖水平能通过非侵入测量眼睛的水样液和/或玻璃体或角膜的色散分布图被确定下来。本发明的优选实施方案能作为半导体制造中的测量技术被应用于测量在制造集成电路和/或光电部件期间形成的小特征。因为所述方法的优选实施方案是非接触的和非破坏性的，所以能够在制造半导体结构或光学部件的时候监测它们的厚度。
依照本发明使用Mach-Zender外差式干涉仪的优选实施方案，用来测量经过一部分样品的光波的相位的方法包括如下步骤提供光波的第一波长；沿着第一光程和第二光程引导第一波长的光波，第一光程延伸到要测量的样品媒介物上而第二路径经历路径长度方面的改变，以及探测来自样品媒介物的光波和来自第二光程的光波以便测量光波通过样品媒介物上两个分开的点在相位方面的改变。媒介物包含生物组织，例如，神经元。该方法包括使用光电二极管阵列或与光电二极管耦合的光纤束使样品的相位在众多的位置同时成像。该方法进一步包括在第二光程中频移所述的光波。该方法包括提供发射第一波长的氦氖激光源()或低相干光源。
依照本发明的另一方面，主动稳定的干涉仪被用于测量通过一部分样品的光波的相位的方法，该方法包括如下步骤提供分别由第一光源和第二光源产生的第一信号和第二信号，第二光源是低相干性来源。该方法包括沿着第一光程和第二光程引导第一信号和第二信号；改变第一光程和第二光程之间的路径长度差；产生指示其间有光程延迟的第一和第二信号之和的输出信号；在干涉仪锁定调制频率下调制该输出信号；以及借助干涉仪锁定相位的时间进展来确定样品的相位。第一和第二信号是两个低相干性信号。该方法进一步包括用混频器或锁定放大器解调第一信号。该方法包括用电子学方法产生干涉仪锁定相位。
依照本发明的另一方面，双光束反射干涉仪被用于测量经过一部分样品的光波的相位的系统。该系统包括产生第一信号的第一光源；产生靠时间延迟与第一信号分开两个脉冲的第二信号的干涉仪；从干涉仪与样品联系的第一光程和从干涉仪与基准面联系的第二光程；以及依据分别来自样品和基准面的第一和第二信号和从样品和基准面反射的光波之间的干涉测量第一外差信号的探测器系统。该系统包括探测指示样品反射相对于基准面反射的相位的外差信号的相位。第一信号是低相干性信号。光波的第一来源能不受限制地包括超级发光二极管或多模激光二极管之一。干涉仪的第二路径进一步包括第一路径和第二路径，而且第二路径有声光调制器。该系统包括包含光纤的光路。该系统包括隔震的外差Michelson干涉仪。该干涉仪进一步包括附着到平移台上调节光程长度差的反射镜。所述的探测系统包括探测从样品反射的信号的第一探测器和探测从基准面反射的信号的第二探测器。
依照另一方面，本发明提供使用相衬显微镜和空间光波调制使样品成像的方法。在各种不同的实施方案中，所述方法包括照亮样品，由于源于照亮样品的光波有低频空间组份和高频空间组份。低频空间组份的相位被偏移以便提供至少三个被移相的低频空间组份。优选的是，相位是按，例如，π/2的增量偏移的，以便产生相移π/2、π和3π/2的低频空间组份。
未偏移的低频空间组份和至少三个被移相的低频空间组份沿着共向光程分开干涉高频空间组份，产生每个分开干涉的强度信号。然后，例如，使用至少四个强度信号产生样品的图像或相位图像。
依照另一方面，本发明提供非接触式光学测量有反射表面的样品的方法，该方法有如下步骤提供产生第一信号的第一光源；使用双光束干涉仪产生靠时间延迟与第一信号分开两个脉冲的第二信号；提供从干涉仪与样品联系的第一光程和从干涉仪与基准面联系的第二光程；依据分别来自样品和基准面的第一和第二信号和从样品和基准面反射的光波之间的干涉测量第一外差信号；以及探测指示样品反射相对于基准面反射的相位的外差信号的相位。
在优选的实施方案中，第一信号是低相干性信号。第一光源可能是超级发光二极管或多模激光二极管。所述干涉仪进一步包括第一路径和第二路径，第二路径有声光调制器。所述方法进一步包括包含光学光纤的光路。所述样品可能是神经细胞的一部分。
在优选的实施方案中，所述干涉仪包括隔震的外差式Michelson干涉仪。该干涉仪进一步包括附着到平移台上可控制地调节光程长度差的反射镜。优选的实施方案包括完成神经膨胀的第一种非接触的和第一种干涉测量法的测量的外差式低相干性干涉仪。神经膨胀的生物物理学机制能依照本发明的优选实施方案使用个别的轴突成像和分析。双光束低相干性干涉仪在测量活细胞的纳米级运动方面可能有许多其它的应用。其它的实施方案能包括以干涉仪为基础探测单一神经元与动作电位相关联的机械变化的显微镜。相关的干涉测量方法也用来测量在被培养的单层细胞中细胞体积变化。
本发明的另一方面包括用来使样品光学成像的光纤探头，该光纤探头包括有近端和远端的外壳；在外壳的近端与光源耦合的光纤准直仪；以及在外壳远端的折射率渐变透镜，该透镜有第一和第二表面，其中第一表面是基准表面，而且该探头的数值孔径提供来自样品的散射表面的有效的光波聚集。该探头进一步包括装在平移式载物台上的光纤探头以便至少完成二维相位成像和三维共焦相位成像之一。平移式载物台包括扫描压电转换器。探头的数值孔径在大约0.4到0.5的范围内。
所述的用于相位测量的系统和方法的上述的和其它的特征和优势从下面的在相似的基准字符在不同的视图中处处表示相同的部份的附图中举例说明的系统和方法的优选实施方案的更具体的描述将变得明显。这些图画不必依比例绘制，而是强调举例说明本发明的原理。


图1是依照本发明测量光学距离的系统的优选实施方案的示意图；图2依照优选实施方案举例说明与反射界面相关联的低相干性外差信号，其中调节低相干性波长压缩或扩展界面周围的外差信号(取决于低相干光源的中心波长的调节方向)；图3依照优选实施方案举例说明与样品中的两个反射界面相关联的外差信号，其中减少低相干性波长压缩界面周围的外差信号；图4依照本发明的优选实施方案举例说明有两个界面的样品的扫描，(a)低相干性外差信号，(b)痕迹，其中放大图表示相位条纹，每个条纹与λCW的光学距离相对应，(c)在Δ的两个差值处的痕迹，其中箭头指出相位交点，垂直轴以弧度为单位；图5举例说明依照本发明的优选实施方案确定通过选择使基于SPhase和SfrigE的估计之间的误差减到最少的数值实测的(n775nmL)的正确估计的方法；图6A和6B是举例说明依照本发明的优选实施方案测量光学距离的方法的流程图；图7是依照本发明测量光学距离的系统的其它可能的优选实施方案的示意图；图8A和8B是举例说明依照本发明的优选实施方案测量光学距离的替代方法的流程图；图9示意地举例说明测量诸如玻璃板、组织样品或组织层之类光学透明的材料的厚度的基于光纤的系统的优选实施方案；图10举例说明依照本发明用于玻璃体和/或水样体液葡萄糖测量系统的本发明的系统的优选实施方案；图11举例说明主动稳定的Michelson干涉仪，其中依照本发明的优选实施方案M是反射镜，MM是移动反射镜，BS是分光镜，PM是相位调制器，D是探测器，LO是本地振荡源，MX是混频器，S是求和放大器；图12举例说明用于光学延迟相敏低相干性干涉测量法(LCI)的稳定的干涉仪，其中DBS依照本发明的优选实施方案是二色分光镜；
图13举例说明当光程长度差ΔL依照本发明的优选实施方案改变时的一对界面的样品解调干涉图，；图14A举例说明用于稳定的相敏低相干性干涉测量法(LCI)的系统，其中LC1和LC2依照本发明的优选实施方案是低相干性光束；图14B举例说明依照本发明使用压电转换器产生相位变化的用于主动稳定的相敏低相干性干涉测量法(LCI)的系统的替代实施方案；图15A和15B是LC1和LC2的解调的条纹图，其中LC2信号的两个峰依照本发明的优选实施方案代表盖玻片反射(大的)和来自样品的反射(小的)；图16举例说明依照本发明的优选实施方案用于稳定的相敏低相干性干涉测量法的成像系统；图17举例说明用于二维相位成像的展开的光学设计，其中依照本发明的优选实施方案，实线表示入射光线，而虚线表示反向散射的光线；图18A依照本发明的优选实施方案举例说明两点Mach-Zender外差干涉仪；图18B依照本发明的优选实施方案举例说明成像Mach-Zender外差干涉仪；图18C举例说明与参照图18B描述的实施方案相关联的外差信号和选通信号；
图18D依照本发明的优选实施方案举例说明成像双光束外差式干涉仪；图19依照本发明的优选实施方案举例说明隔离的双光束外差式低相干性干涉仪；图20依照本发明的优选实施方案举例说明双基准面外差式低相干性干涉仪；图21依照本发明的优选实施方案举例说明光学参比干涉仪的优选实施方案；图22依照本发明的优选实施方案示意地举例说明由于作为抽样对象的基准面点位于同一表面(玻璃)上造成的实测相位的组份；图23A和23B依照本发明的优选实施方案就参照图21举例说明的实施方案分别图解式地举例说明压电转换器(PZT)的电压和对应的相位变化；图24依照图21举例说明的干涉仪以弧度为单位图解式地举例说明噪声性能；图25A和25B是依照本发明的优选实施方案用于样品信号和基准面信号的标定组件的示意表达；图26示意地举例说明依照本发明的优选实施方案的干涉仪系统的优选实施方案；图27举例说明依照本发明的优选实施方案测量神经位移的系统的示意图；
图28A和28B依照本发明的优选实施方案图解式地举例说明有关于时间(ms)的神经位移(nm)和电势(μV)；图29依照本发明的优选实施方案图解式地举例说明单一神经的峰值电势(十字)和位移(圆)，其中变量刺激电流振幅；图30举例说明依照本发明的优选实施方案用于双光束干涉仪的扫描系统的光学设计；图31举例说明依照本发明的优选实施方案检流计位置和使用Lissajous扫描从空的盖玻片收集的相位数据；图32A和32B依照本发明的优选实施方案分别举例说明使用在图31中表现和图解式举例说明的数据的相位图像的彩色映射图和回射强度图像；图33示意地举例说明借助本发明的优选实施方案解决的聚焦问题；图34举例说明依照本发明的优选实施方案用于双焦透镜的设计；图35举例说明依照本发明的优选实施方案用于双焦透镜的替代设计；图36举例说明依照本发明的优选实施方案计算透镜f3(双焦透镜)和f2之间的最佳距离；图37举例说明依照本发明的优选实施方案制造双焦透镜；
图38举例说明依照本发明的优选实施方案，当物镜向玻璃盖玻片扫描时通过光学循环器测量的回射强度；图39举例说明依照本发明的优选实施方案，回射强度随使用双焦透镜f3的物镜焦点位置变化；图40举例说明依照本发明的优选实施方案在两种盖玻片反射的情况下，回射强度随使用双焦透镜的物镜焦点位置变化；图41举例说明依照本发明的优选实施方案，当f2和f3之间的距离被调节到与在前后玻璃表面之间的空隙相配时，在两种盖玻片反射的情况下回射强度随使用双焦透镜的物镜焦点位置变化；统称为图42的图42A和42B依照本发明的优选实施方案举例说明由于轴向的和边缘的光束在光学系统中耦合形成额外的较小的峰；图43A举例说明依照本发明的优选实施方案作为整体元件有基准面表面的双光束探头；图43B是双光束干涉仪探头的另一个优选实施方案；图43C是两个神经纤维的图像；图43D是外差信号振幅作为位置的函数的图像；图43E是在图43D中见到的同一样品的反射相位图像；
图44是依照本发明的优选实施方案，适用于研究在动作电位期间在神经中观察到的位移效果的几何学的双光束探头的图表示例；图45是依照本发明的优选实施方案用来通过扫描探头或样品成像的双光束探头系统；图46A-46C举例说明依照本发明的优选实施方案，使用双焦双光束显微镜从干燥的人类面颊上皮细胞反向散射的光波的强度图像、相位图像和明视场图像；图46D-46G举例说明在图43中举例说明的双光束显微镜的轮廓曲线测定能力，其中图46D是图46E举例说明的平凸透镜系统的中心部分的强度图像，图46F是反射光波的相位映射图，而图46G是相位图像的横截面，依照本发明的优选实施方案通过二次拟合展开的相位。
图47A-47E依照本发明的优选实施方案分别举例说明移相干涉测量法系统的示意图、相位步进和桶式整合；图48A-48C分别举例说明依照本发明的优选实施方案的频闪式外差干涉测量系统和桶式整合的原理；图49A举例说明依照本发明的优选实施方案的双光束频闪式外差干涉仪；图49B和49C举例说明表现依照本发明的优选实施方案的双光束探头聚焦在静止的玻璃表面上的相位噪声的数据；图50A举例说明另一个优选实施方案，其中来自分开的路径的光波被引向公共路径而且被聚焦在被测量的材料的不同区域；
图50B是使用图50A所示系统的双光束系统的优选实施方案；图50C提供关于在图50B举例说明的系统之内的偏振组份的细节；图51A-51D是这种依照本发明的优选实施方案的图像描述的各种特征的示意表达；图52示意地举例说明依照本发明以透射几何学为基础的显微镜系统的各种不同的实施方案；图53示意地举例说明依照本发明以反射几何学为基础的显微镜系统的各种不同的实施方案；统称为图54的图54A和54B示意地举例说明用光学显微镜整合本发明的各种实施方案的一个实施方案；图55示意地举例说明本发明利用4-f系统的系统和方法的各种不同的实施方案；图56示意地举例说明依照本发明利用空间光波调制(SLM)的相衬显微镜系统的一个实施方案；图57A和57B依照本发明的优选实施方案示意地举例说明在振幅模式和相位模式中在图像的象素上的光电效应；图58A-58C是依照本发明的优选实施方案操作的SLM模式的各种不同的实施方案的方框图；
图59是依照本发明的优选实施方案针对按振幅模式操作的仪器获得的标定曲线的例子；图60A-60D展示依照本发明的优选实施方案使用反射几何学的系统在四种不同的相位移动下获得的图像；图61示意地举例说明依照本发明的优选实施方案在电磁场矢量E和电磁场的高频波矢量组份EH和电磁场的低频波矢量组份EL之间的关系；图62是依照本发明的优选实施方案使用例如在图35A-35D和等式55中举例说明的数据产生的标定样品的Δφ图像；图63是使用依照本发明的系统和方法的实施例1的标定样品的相位图像；图64展示依照本发明的优选实施方案使用透射几何学获得的相位图像；图65展示依照本发明的优选实施方案获得的洋葱细胞强度图像；图66展示依照本发明使用透射几何学获得的洋葱细胞相位图像；图67依照优选的实施方案举例说明实验装备，其中VPS是虚拟的点光源；CL是矫正透镜；IP是成像平面；P是偏光波镜；BS是光束分离器；FL是傅立叶透镜；PPM是可编程的相位调制器；CCD是电荷耦合器件，PC是个人计算机；
图68A和68B举例说明依照优选的实施方案使用10×显微镜物镜获得的关于聚苯乙烯微球浸没在100％丙三醇中的实验结果，其中图68A是强度图像，图68B是定量的相位图像。彩色条代表以nm表达的相位；图69A-69C举例说明依照优选实施方案使用40×显微镜物镜获得的LCPM图像，其中图69A是经历有丝分裂的HE1A癌细胞的相位图像，图69B是整个血涂片的相位图像，而图69C是与缺乏细胞的点相关联的瞬时相位变动(标准偏差σ被指出)。彩色条代表以nm表达的相位。
具体实施例方式
用于距离测量的谐波干涉测量法本发明涉及以相位相交为基础测量光学距离的系统和方法，所述系统和方法通过在干涉仪中引进色散不平衡解决整数或2π模糊度问题。所述方法的优选实施方案能精确测量表面上两个毗连的点的相对高度差。此外，业已发现样品的折射指数的准确度仅仅受实验测量样品实际厚度的精度的限制。
在基于谐波相位的干涉测量法(HPI)中用连续波(CW)光源代替其中一个低相干光源允许使用相关联的CW外差信号作为测量低相干性外差信号的光学标尺的形式。低相干光源提供光谱带宽，例如，对于1微米波长大于5nm。使用所述改进的HPI的优势之一是实测相位现在对长度标尺nL而不是对(nλ2-nλ2)L敏感，其中n是在低相干波长下的折射指数。数量n实际上比合成数量(nλ2-nλ2)有用得多。通过把低相干波长略微调节，例如，大约2nm，人们能发现数值nL没有2π模糊度而有亚纳米级的灵敏度。这种方法使用CW外差干涉信号作为测量光学距离的基准面光学标尺。
使用容易得到的低相干光源测量干涉光学距离的系统已实现大约几十个波长的分辨率。尽管这种技术是比较不敏感的，但是它不必解决2π模糊度问题。优选实施方案包括使用相位以亚纳米精度测量任意长的光学距离的低相干性干涉测量法。这种方法使用低相干性相位相交技术来确定整数干涉条纹并且使用来自测量的附加的相位信息来准确地获得分数条纹。除此之外，它提供深度分辨率并且能被用于成层样品的X射线断层剖面测定。因为所述方法能精确测量长的光学距离，所以它能用来准确地确定众多材料的折射指数。因为这是基于相位的方法，所以这样发现的折射指数是相位折射指数而不是群体折射指数。
图1举例说明本发明的包括改进的Michelson干涉仪的系统10的优选实施方案。输入光波12是由来自Ti蓝宝石激光器的(例如，以775.0nm发射的)150-fs锁模光波和来自例如半导体激光器的连续波(CW)1550.0nm的光波组成的双色复合光束。在优选的实施方案中，所述方法根据CW波长(在这个实施方案中准确地说是1550.0nm)算出光学距离，而且所有的光学距离都是基于这个基础计算的。复合光束在分光镜14处被一分为二。一部份信号入射到目标样品16上，而另一部分入射到优选以(例如)大约0.5毫米/秒的速度移动的基准反射镜32上，后者在基准光束34上诱发多普勒偏移。多普勒偏移可以是用其它装置诱发的，例如，通过使用电光调制器。背反射的光束在分光镜14处被再次结合，借助二向色镜18被分成它们的波长组份，而且被光电探测器20、22分开测量。由此产生的信号借助模数转换器(ADC)24(例如，16位100kHz的A/D转换器)数字化。诸如个人计算机(PC)26之类的数据处理器与ADC24通信，以便进一步处理数据。由此产生的外差信号在它们各自的多普勒偏移频率下有在它们各自的中心外差频率周围的通频带而且被进行Hilbert变换以便推断出外差信号对应的相位，ψCW和ψLC。下标CW和LC分别表示1550.0nm的连续波组份和775.0nm的低相干性波长组份。
然后，把低相干性光波的中心波长调节大约1-2nm，而且测量第二组ψCW和ψLC数值。依据这两组读数，能以亚纳米精度使目标样品中的各种不同的界面定域。用于定域的数据处理在下文予以描述。
考虑由距分光镜14未知距离x1的单一界面所组成的样品。从分光镜14到基准反射镜32的距离x在基准反射镜的扫描中在每个时间点都是已知量。
寻找x1的近似值的方法是通过在重新组合的低相干性光束中扫描x和监测由此产生的外差信号。当x近似等于x1的时候，外差信号振幅的峰值是预期的。这种方法的精确度受光源的相干长度LC和外差信号的信噪比质量限制。在现实的实验条件下，确定的x1的误差不可能好于相干长度的五分之一。
假定典型的低相干光源的相干长度名义上是大约10μm。这意味着所述确定长度的方法的误差被限制到大约2μm。
在考虑外差信号的相位时，检测到的外差信号的不同组份能被表示成Iheterodyne=Erefei(2kx-ωt)Esige-i(2kx1-ωt)+c.c.]]>=2ErefEsigcos(2k(x-x1))---(1)]]>
其中ErEf和Esig分别是基准电磁场振幅和信号电磁场振幅，k是光学波数，ω是光学频率。指数中的因子2表示光波两次经过该路径即照射到反射镜/样品和返回分光镜。
请注意，当x精确地与x1相配的时候，外差信号被期望达到峰值。两个返回的光束处在相长干涉之中。所以，这个性质被用来定域界面。x1是通过寻找两个光束处于相长干涉时的x数值找到的。由于相位能被准确地测量，所以这种方法给出大约5nm的长度灵敏度。不幸的是，这种方法是需要加强计算的，因为有多个外差信号达到峰值的x值；明确地说，外差信号在x满足下式的时候达到峰值x＝x1+aλ/2 (2)其中a是整数，λ是光学波长。这是2π模糊度问题的表现。
优选的实施方案包括辨别正确的峰的方法。请注意，当x确切地等于x1的时候，不管光学波长，外差信号达到峰值。另一方面，如同在图2中举例说明的那样，后来的峰取决于波长。图2举例说明与样品中的反射界面52相关联的低相干性外差信号。所以，通过调节低相干性波长，该外差信号被压缩在界面和与能确切地区别x-x1的情形相关联的正确的峰的周围。人们应该注意到外差信号可能在界面周围被压缩或扩展，取决于调节方向。肉眼观察定域的直观方法是画出挤进x确切地等于x1的条纹或远离x确切地等于x1的条纹扩展的外差信号。
由于以下两个原因在所述定域方法中需要CW光源。第一，实际上在干涉仪中绝对准确地识别该数值是非常困难的。干涉仪的CW组份允许在扫描基准反射镜的时候，非常精确地测量x。在特定的优选实施方案中，为了确定样品中两个界面之间的距离，数出发生在x1等于到图1所示的第一界面的距离的位置和x2(x2＝x1+nL，其中n是样品的折射指数)等于到第二界面的距离的位置之间的CW干涉条纹的数目。图3举例说明与样品中两个反射界面相关联的外差信号。调节低相干性波长把外差信号78、80压缩82、84到界面周围。
第二，如果有与反射过程相关联的相位偏移，前面描述的界面定域方法可能部分地失败。例如，如果表面是金属的，那么相位偏移并非是微不足道的，而且当x确切地等于x1时外差信号的相位具有某个其它的数值。尽管先前的方法允许在x＝x1之时识别正确的干涉条纹，然而亚波长灵敏度可能是折衷的。CW外差信号的出现允许借助HPI方法发现差相位。对这个数值的了解允许以高水平的灵敏度使界面定域。
HPI方法的原理能通过可仿效的，在775nm的波长下折射指数为n775nm的，厚度为L样品的实施方案举例说明。该样品的两个界面处在距分光镜的光学距离分别为x1和x2(其中x2＝x1+n775nmL)的位置。请注意，如果光学距离间隔大于相干长度，例如，典型地在低相干光源的1微米和100微米之间，该方法才能工作。否则，与界面相关联的外差相位信号合并在一起并且导致错误的界面定域。为了解释清楚，与反射相关联的相位偏移的结合被推迟到后面。
图4是举例说明数学描述的扫描。该扫描是有两个界面的样品。信号100是低的相干性外差信号。痕迹102是ψCW(x)。放大视图104展示相位条纹。每个条纹对应于λCW的光学距离。较低的ψD(x)痕迹是两个不同的Δ值。箭头106、110指出相位交点。垂直轴以弧度为单位。当扫描基准反射镜的时候，低相干性外差信号的相位用下式给出
ψLC(x)]]>=mod2π(arg(RLC,1ei2kLC(x-x1)e-(2a(x-x1))2+RLC,2ei2kLC(x-x2)e-(2a(x-x2))2))]]>≈hc(x-x1)mod2π(2kLC(x-x1))+hc(x-x2)mod2π(2kLC(x-x2)),---(3)]]>其中RLCj是在低相干性波长下界面j的反射率，k是光学波数，a＝4ln(2)/lc，lc是相干长度，x是基准反射镜到分光镜的距离，hc(x)是分段连续函数，|x|＜2lc时，其数值为1，否则为0。指数中的因子2是由于在回射几何学中光程被有效地加倍。公式3反映由于噪声不能测量远远超过相干性包络线的相位这一事实。虽然建立模型的相干性包络线在轮廓上是高斯型的，但是同样的相位处理对于任何缓慢变化的包络线的轮廓都是有效的。
CW外差信号的相位是用下式给出的ψcw(x)=mod2π(arg(Rcw,1ei2kcw(x-x1)+Rcw,2ei2kcw(x-(x1+n1550nmL)))]]>=mod2π(arg(R‾ei2kcw(x-x‾)))=mod2π(2kcw(x-x‾)),]]>(4)其中RCWj是界面j在CW波长下的反射率，n1550nm是样品的折射指数，R和X分别是有效平均反射率和到分光镜的有效平均距离。如果两个光源中心波长是这样选定的，以致kLC＝2kCW+Δ，(5)其中Δ是小的有意附加的偏移，那么这种形式的差相位ψD被获得ψD(x)＝ψLC(x)-2ψcw(x)＝hc(x-x1)mod2π(4kcw(x-x1)+2Δ(x-x1))(6)+hc(x-x2)mod2π(4kcw(x-x2)+2Δ(x-x2))上述的量提供在间隔(x2-x1)中条纹的大体数目和提供亚波长精度的分数条纹两者。
当参数Δ被少量改变时(对应于大约1-2nm的波长偏移)，ψD(x)的斜率围绕x＝x1和x＝x2的点转动。换句话说，在不同的Δ值与所述点相交的地方扫描相位。从x1到x2的光学距离能通过计算ψCW(x)在两个相位交点之间经过的条纹找出来。如此找到的数量的两倍用非整数Sfringe指出，而且对应于低相干波长下的条纹数目。就单一界面而言，若出现多个相位交点，与界面位置相对应的点能通过以多个附加的Δ值进行多样的扫描找出来。界面位置是唯一的位置，在该位置ψD(x)对于所有的Δ值都将相交。
相位偏移信息用来进一步使界面间距定域。明确地说，在x＝x1和x＝x2处的相位偏移之间的差是Sphase=mod2π(ψD(x=x1)-ψD(x=x2))2π=mod2π(4kcw(x2-x1))2π·---(7)]]>这用高灵敏度测量分数条纹。
绝对的光学间距(x2-x1)能通过下面的公式精确地从Sfringe和SPhase确定(x2-x1)measured=(n775nmL)measured=]]>λcw4([int(Sfringe)+U(ΔS-12)-U(-ΔS-12)]+Sphase)]]>(8)其中ΔS＝rEs(Sfringe)-SPhase，U()是单位步骤函数。在这里，int()和res()分别表示自变量的整数部分和分数部份。第一项通过将SPhase和Sfringe的分数部分之间的误差减到最小以定域光学距离到条纹的正确的整数数目。光学间距测定误差仅仅受SPhase的测量误差限制。在实施方案中，这样的误差转换到在大约0.5nm的(n775nmL)measued中的误差。SPhase的测量误差只需要小于半个条纹，以便正确的干涉条纹能被建立；满足了这个判据，它不进入(n775nmL)measued的误差。最大的可测量的光学距离仅仅取决于系统准确地数出在两个交点之间的条纹数目的能力和光源的频率稳定性。
上述公式是用来发现正确条纹和分数条纹的方法的精练表达。操作能通过下面的实施例和展示通过选择使基于SPhase和Sfringe之间的估计误差最小的数值确定正确估计的图5来举例说明。假定Sfringe和SPhase是26.7和0.111。从SPhase的测量结果，光学距离的数值是(n775nmL)measued＝λCW(a+0.111)/4(9)其中a是整数。给出Sfringe的数值，可能的(n775nmL)measued数值限定在下列三个数值λCW(25.111)/4、λCW(26.111)/4和λCW(27.111)/4。如果λCW(27.111)/4的数值最接近λCW(Sfringe)/4，那么它就是(n775nmL)measued的正确估计。
在用于谐波关系光源为基础的干涉测量法测量的优选实施方案中，适当地选定的光源对和推断出差相位的方法允许最小化并优选消除干涉仪中以别的方式使高精度光学距离测量变成不可能的抖动效应。消除抖动还允许比较在不同时间完成的扫描。
为了证明该方法的优选实施方案的能力，所述系统被用来探察实际厚度L＝237±3μm的熔凝石英盖玻片的顶部表面和底部表面之间的光学距离。在这个实施方案中，存在与来自第一界面的反射相关联的π相位偏移，这标志正折射指数跃迁。因此，在公式1和2中有与因子RLC，1和Rcw，1相关联的e-iπ项。这导致关于Sfringe和SPhase的二分之一的校正因子。图4展示在773.0nm和777.0nm的LC波长下典型的扫描结果。四组扫描结果被概括在表示关于石英盖玻片的(n775nmL)的测量结果的表1中。实验数据的重复性表明光源在频率方面是足够稳定的。
表1

实验数据产生有亚纳米精度的绝对光学距离测量结果。所发现的光学距离与低相干光源相关联。CW外差信号充当光学标尺。如果石英盖玻片的L是精确地已知的，那么石英在775.0nm波长下的n775nm就能从(n775nmL)measued以非常高的准确度确定。
作为替代，不知道L的精确数值，在两个不同的波长下折射指数比能通过使用在这些波长下的低相干光波和在它们各自的谐波下的CW光波测量对应的光学距离来确定。使用一系列低相干性波长，材料的色散分布图能被准确地确定。色散分布图把各种不同波长下的折射指数差绘成图。依照优选的实施方案，这些实验结果预测大约七位有效数字的精确度能用大约1毫米厚的样品实现。
在另一个优选实施方案中，所述系统的光源改为以1550.0nm发射的低相干性超级发光二极管(SLD)和以775.0nm发射的CWTi蓝宝石激光器。通过调节通过SLD的工作电流，中心波长被改变大约2nm；这适合实现相位相交。使用本发明系统的所述优选实施方案，光学距离能在1550.0nm测量。采用所述测量结果与前面的测量结果之比，石英的折射指数比n775nm/n1550nm能被确定。人们应该注意到所发现的折射指数比由于在所述优选实施方案中所用的光源适合于谐波关系波长。其它波长的折射指数比能用适当选择的其它光源测量。为了比较，玻璃和丙烯酸塑料对应的数据被列于表2中作为不同材料的n775nm/n1550nm的测量结果。
表2

请注意，当低相干性波长是CW波长的一半的时候所用的一些公式略微不同于先前在此出现的公式。例如ψLC(x)]]>=mod2π(arg(RLC,1ei2kLC(x-x1)e-(2lc(x-x1))2+RLC,2ei2kLC(x-x2)e-(2lc(x-x2))2))]]>≈hc(x-x1)mod2π(2kLC(x-x1))+hc(x-x2)mod2π(2kLC(x-x2)),---(10)]]>ψcw(x)=mod2π(arg(Rcw,1ei2kcw(x-x1)+Rcw,2ei2kcw(x-(x1+n1550nmL)))]]>=mod2π(arg(R‾ei2kcw(x-x‾)))=mod2π(2kcw(x-x‾)),---(11)]]>2kLC＝kCW+Δ (12)ψD(x)＝2ψLC(x)-ψcw(x)＝hc(x-x1)mod2π(4kLC(x-x1)+2Δ(x-x1))(13)+hc(x-x2)mod2π(4kLC(x-x2)+2Δ(x-x2))
Sphase=mod2π(ψD(x=x1)-ψD(x=x2))2π=mod2π(4kLC(x2-x1))2π·---(14)]]>(x2-x1)measured=(n775nmL)measured]]>=λLC4([int(Sfringe)+U(ΔS-12)-U(-ΔS-12)]+Sphase)---(15)]]>用来解决2π模糊度的方法的优选实施方案在诸如高精度深度测距和薄膜固态材料的高精度折射指数确定之类的应用中是非常有用的。
优选方法的使用能通过考虑玻璃平板来举例说明。有一些能非常准确地测量从系统到玻璃平板平均中心的距离的系统。还有一些能非常准确地测量玻璃表面粗糙程度的系统。本发明系统的优选实施方案以纳米灵敏度测量玻璃平板端面的厚度。
落实用来确定光学距离的方法的优选实施方案的步骤是用图6A和6B中的流程图124举例说明的。方法124包括在Michelson干涉仪中使用两个谐波关系光源，其中一个是CW光源，而另一个是低相干光源。需要测量其界面之间的光学距离的样品每逢步骤126都被用作干涉仪信号臂的末端反射镜。干涉仪基准臂中的基准反射镜每逢步骤128都被扫描。该方法包括把来自信号臂和基准臂的反射合并然后按照波长分开的步骤130。进而，每逢步骤132探测组合光波强度的外差振荡。然后，每逢步骤134借助，例如，Hilbert变换或任何相位推断出替代方法找出两种波长的外差信号的相位。每逢步骤136都通过从较短波长的相位两次减去较长波长的相位估算整个扫描的差相位。每逢步骤137都用被略微失谐的光波波长重复扫描。然后，重复步骤130-136。
然后，每逢步骤138都把从两次扫描发现的两个差相位重叠在用x轴表示基准反射镜的位移的曲线图上。人们应该注意到，差相位的推断出也能用适当的光源或滤色镜或对单一扫描的软件/硬件信号处理来完成。
在方法124中接下来的步骤包括每逢140步骤在曲线图上确定相位交点以便标出样品界面的位置。每逢步骤142，通过计算与CW光波相关联的外差信号在两个交点之间用2π叠起的次数，以大约达到波长的分数(例如，大约0.2)的准确性确定界面之间的光学间距。通过测量在交点的差相位，进一步使该间距定域和/或精炼到波长的非常小的分数，例如，大约0.001。
在用作为测量光学距离的系统的示意图的图7举例说明的另一个优选实施方案中，低相干光源在带宽方面可能是足够宽的，例如，超过4nm。在探测结束时，为两个探测器166、176增添第三个探测器174。这导致低相干性光波信号168被进一步一分为二。在到达探测器之前，两个光束通过不同的滤波器170、172。这两个滤波器传输光谱中的不同部份。一个让波长较长的频谱组份通过，而第二个让波长较短的频谱组份通过。优选的是两个透射光束在它们的光谱方面被分开2nm以上。
然后，光束入射到探测器上，而且它们的外差信号以参照图1讨论过的方式进行处理。依照其它可能的优选实施方案的方法的优势在于该方法用经过调节的低相干性波长消除程序的重复。这两个信号是在同一次扫描中获得的。
图8A和8B举例说明依照本发明的优选实施方案测量光学距离的替代方法的流程图184。方法184包括在干涉仪中使用两个谐波关系光源，其中一个是CW光源，而另一个是低相干光源。每逢步骤186，需要测量光学距离的样品都被用作干涉仪信号臂的末端反射镜。每逢步骤188，干涉仪基准臂中的基准反射镜都被扫描。该方法进一步包括每逢步骤190把来自信号臂和基准臂的反射合并然后按照波长把它们分开。每逢步骤192，使用滤波器把低相干性波长进一步分开。方法184包括用至少三个探测器探测外差振荡的步骤194。下一个步骤196包括探测组合光波强度的外差振动。然后，每逢步骤198都借助，例如，Hilbert变换或任何相位推断出替代方法找出两个波长的外差信号的相位。然后，每逢步骤200，都算出每个低相干性信号与CW信号的差相位。
然后，每逢步骤202，都在曲线图中表示基准反射镜的位移的x-轴上把两个差相位彼此重叠。剩余的步骤204、206、208类似于参照图6B讨论过的步骤140、142、144。
该方法的优选实施方案绝对能用来以亚纳米精度测量任意长的光学距离。该系统的优选实施方案能以自由空间为基础或以光纤为基础。图9举例说明以光纤为基础测量光学距离的系统的优选实施方案。
输入光波256包括在光纤251中传播的近似谐波关系低相干性光波(波长λ1)和CW光束(波长λ2)。复合光束被一分为二，一部分信号入射到目标透镜254和样品256上并且在光纤253中传输，而另一部分信号经由透镜268入射到基准反射镜266上并且在光纤251中传输。基准反射镜的运动在反射光束上引进多普勒偏移。反射光束被再次合并，然后，借助二向色镜258被分成它们的组成波长组份。所述波长组份是借助光电探测器260、262分开测量的。这些在它们各自的多普勒偏移频率下产生的外差信号有在它们各自的中心外差频率周围的通频带，而且被完成Hilbert变换，以便推断出外差信号对应的相位ψCW和ψLC。
优选实施方案的方法能用来进行精确的光学距离测量。依据这样的测量，目标物体的光学性质能被精确地测定。通过测量目标的色散分布图，目标的结构性质和/或化学性质能被算出。在生物医学领域，本发明的优选实施方案能用来以非接触和非侵入的方式精确地确定生物学组织的色散性质。这样的色散测定能用在眼睛的角膜或水样液上。所实现的灵敏度足以探测依葡萄糖浓度而定的光学变化。在本发明方法的优选实施方案中，血糖水平能通过非侵入式测量眼睛的水样液或玻璃液或角膜的色散分布图来确定。
如同上文讨论的那样，基于相位的干涉测量法能够非常灵敏地测量光学距离。然而，所述测量法在它们的应用方面受到例如2π模糊度之类的在该领域中众所周知的问题的限制。这个问题的症结在于不可能把10.1个波长的长度与11.1个波长的长度区分开。本发明的优选实施方案克服了这个限制而且允许亚纳米准确度的绝对光学距离测量。
有许多以近似纳米范围的灵敏度测量光学距离变化的基于相位的方法。只要这种变化很小而且是渐进的，所述变化就能被连续地跟踪。存在测量绝对光学距离的低相干性方法，所述方法通过跟踪到达从反射镜灵敏度大约为数微米的不同的界面反射的光波的探测器的延迟来测量绝对光学距离。如同上文讨论的那样，在干涉仪中CW光源和低相干光源的同时使用为测量光学距离的方法创造条件。与两种波长相关联的信号的外差相位本质上是相关的。通过处理每个优选实施方案的相位，运动噪声被减到最小并且优选从我们的测量中消除。
优选实施方案的应用是使用眼睛的玻璃体液和/或水样液的折射指数的测量结果确定葡萄糖水平。这种技术的灵敏度提供以临床上恰当的灵敏度测量化学浓度的能力。优选实施方案的方法的比较明显的应用之一是通过在眼睛上完成的测量确定血糖水平。眼睛中流体的葡萄糖水平用临床上无关紧要的时间延迟反映血液的葡萄糖水平。
优选实施方案的方法使用图10举例说明的至少两个分开的波长组测量眼睛中的玻璃体液和/或水样液层的光程长度。该方法测量低相干性波长下的折射指数和两个界面之间的实际间距的乘积。通过改变低相干光源的波长(而且为了匹配适当地改变CW波长)，以不同的波长测量折射指数差。例如，一组测量是用可调谐的500nm的低相干光源和1微米的CW光源完成的，以便析取n500nmL，其中L是玻璃体液和/或水样液在测量点的实际厚度。另一组测量是用可调谐的1000nm的低相干光源和1800nm的CW光源完成的，以便析取n900nmL。通过取得这两个测量结果的比，玻璃体液和/或水样液的折射指数比n500nm/n900nm被推断出。采用现有的灵敏度，例如，0.5nm光程灵敏度，该系统的优选实施方案能针对厚度与人类的玻璃体液和/或水样液的材料测量灵敏度为10-8的折射指数比n500nm/n900nm。这把该灵敏度提供给大约0.25毫克/分升的葡萄糖水平变化。假定典型的血糖水平是大约100毫克/分升，本发明的优选实施方案非常适合血糖化验。光学波长的选择是灵活的，以上使用的波长只是为了举例说明。就最高的灵敏度而言，波长间隔优选尽可能大。优选实施方案包括大于500nm的间隔。
在这样的折射指数比由于在玻璃体液和/或水样液中出现正在变化的其它化学药品不足以确定绝对血糖水平的情况下，更完全的一系列光程长度测量能在一系列其它波长下进行。这组更完全的测量结果允许通过使测量结果与已知的葡萄糖和其它化学药品的色散分布图拟合确定葡萄糖水平和其它化学的浓度。
本发明的优选实施方案能作为测量技术应用于半导体制造业。因为所述方法的优选实施方案是非接触性的和非破坏性的，所以它能用来在制造过程中监测半导体结构的厚度。除此之外，半导体结构的组成能以与就玻璃体液和/或水样液测量的特色讨论的同样多的方式进行化验。
相位测量和成像系统本发明的其它可能的优选实施方案涉及用光波使小的生物体或特征成像。这些实施方案能应用于诸多领域，例如，细胞生理学和神经科学。这些优选实施方案以相位测量和成像技术的原理为基础。使用相位测量和成像技术的科学动机起源于，例如，能没有限制地包括发育异常、细胞通讯、神经元传输和遗传密码执行的成像起因的亚微米水平的细胞生物学。亚细胞组份的结构和动力学现在不能使用现有的方法和技术(包括，例如，X射线和中子的散射)以它们的自然状态进行研究。反之，以光波基础的纳米级分辨率的技术使细胞机器能够以其自然状态进行研究。因此，本发明的优选实施方案包括以干涉测量法和/或相位测量的原理为基础的系统并且被用来研究细胞生理学。这些系统包括使用光学干涉仪测量相位的低相干性干涉测量法(LCI)或其中使用细胞组份本身之内的干涉的光波散射光谱学(LSS)的原理，或在替代方案中LCI和LSS的原理能在本发明的系统中合并。
用于相位测量和成像系统的优选实施方案包括主动稳定的干涉仪、隔离干涉仪、共向光程干涉仪和提供差动测量的干涉仪。涉及差动测量系统的实施方案包括两点外差干涉仪和双光束干涉仪。使用共向光程干涉仪的实施方案能包括使用空间光波调制的相衬显微镜。
光学低相干性干涉测量法(LCI)已经在生物媒介物的研究方面找到许多应用。最广泛使用的LCI技术是使生物样品的2D或3D反向散射轮廓成像的光学相干断层摄影术(OCT)。Drexder，W.等人已经在“In vivo ultrahigh-resolution optical Coherencetomography”(Optics Letters，Volume 24，No.17，pages 1221-1223)中描述过LCI技术，在此通过引证将其全部教导并入。OCT有受所用光源的相干长度限制的深度灵敏度。超宽带光源已能分辨大约1微米的尺寸特征。
相敏低相干性干涉测量法对样品亚波长光程的变化是敏感的。相敏LCI的主要困难是在干涉仪双臂中光程变动造成的相位噪声。通过几乎同一光程的不同波长的激光束能用来测量干涉仪相位噪声，然后把所述相位噪声从有类似的噪声的样品信号中减去，以便析取真实的样品相位偏移。其它的研究员已经使用沿着共向光程正交的激光偏振来测量高相位灵敏度的微分相衬或双折射。在这两种技术中，都扫描基准臂路径，而且需要计算机计算，以便从由此产生的条纹数据(经由Hilbert变换)推断出相位；除此之外，必须使用相位展开算法消除相位测量中的2π模糊度。条纹扫描和信息处理程序实质上降低测量速度而且可能增加噪声。
包括主动稳定的干涉仪的系统本发明的优选实施方案使用LCI方法，其中干涉仪借助基准光束的主动稳定允许以高带宽和最少的计算机处理不间断地探测非常小的相位偏移。锁定在任意相位角的基准光束在没有基准臂扫描的情况下给出直接的样品相位测量结果。优选的实施方案提供二维和三维相位成像。
优选的实施方案依赖Michelson干涉仪借助基准激光束的主动稳定。主动稳定的干涉仪300的优选实施方案的示意图被展示在图11中。主动稳定的Michelson干涉仪系统300包括反射镜306；移动反射镜310；分光镜304；相位调制器308；探测器318；本地振荡源320、322；混频器316和求和放大器312。被分光镜304分开的连续波激光束横越两个干涉仪臂并且在探测器318处被重新组合。干涉仪的一个臂包含相位调制元件308，例如光电调制器或安装在压电转换器上的反射镜。对光程差的大幅度调节可以借助平移反射镜310或任何其它可变的光学延迟线来完成。处理装置(例如，计算机315)与用来提供反馈和处理相位偏移测量结果的电子器件通信。电子图像显示器317用来显示相位偏移和相关的图像。
两个干涉仪臂之间的相位差是按正弦曲线调制的φ＝ψ+ψdsin(Ωt) (16)其中ψ＝k(L1-L2)＝kΔL是两个臂之间的相位差，ψd＜2π是调制深度，而Ω是调制频率。被探测的干涉仪信号是用来自干涉仪两个臂的光束的相干加法给出的I＝I1+I2+2(I1I2)1/2cosφ(17)I和φ之间的非线性关系导致被探测的信号有在调制频率Ω的许多谐波频率下的组份。第一(IΩ)和第二(I2Ω)谐波项是用下式给出的IΩ＝4J1(ψd)(I1I2)1/2sinψsin(Ωt) (18)I2Ω＝4J2(ψd)(I1I2)1/2cosψcos(2Ωt) (19)
IΩ和I2Ω分别按Ω和2Ω解调是借助混频器316或锁定放大器完成的，而且两个信号都作为ψ的函数被放大，以便给出相等的振幅V1＝V0sinψ(20)V2＝V0cosψ(21)使用模拟或数字电路，线性组合V0是用随时间变化的参数θ计算的Vθ＝cosθ*V1-sinθ*V2＝V0sin(ψ-θ) (22)这个信号被用作误差信号把干涉仪锁定在有正斜率的任何零交点。Vθ(t)在被反馈到相位调制器(高频)和路径长度调制器(低频)之前被积分、滤波和放大以便主动消除干涉仪噪声。线性组合Vθ(t)被用作误差信号以便允许锁定到任意相位θ。
稳定的干涉仪可以如同在此描述的那样与相敏低相干性干涉测量法结合。在此被描述的系统组件全部可以借助自由空间光学系统或光纤光学系统来实现。为了清楚，例证展示自由空间光学系统的实现。
用于光学延迟相敏LCI的靠基准光束稳定的干涉仪的示意图展示在图12中。来自低相干光源的光束353在稳定的干涉仪中通过与锁定光束355相同的路径。通过改变干涉仪两个臂之间的(稳定)路径长度差，准备由按干涉仪锁定调制频率调制的其间有非常稳定的连续可变的光程延迟的两份LC光束“副本”之和组成的输出光束。
样品382被放在盖玻片上，该盖玻片已在与样品接触的侧面上涂上一层防LC波长反射的涂层。LC光束是借助显微镜物镜380通过盖玻片和样品聚焦的。反向散射光波是用同一光学系统收集的并且聚焦在探测器366上。被探测的信号是反向散射扫描电磁场与时间延迟ΔL/c的自相关。它能被展示，以便显示在零延迟和与图13举例说明的依照到样品臂中的数对散射或反射表面之间的两倍光程长度相对应的延迟下的干涉图。具体地说，盖玻片没有涂层的侧面位于距离样品大约一个盖玻片厚度d的位置；来自样品的干涉信号在玻璃的折射指数为n的情况下是按光程延迟nd看到的。
由于ΔL＝～2nd，样品信号借助混频器或锁定放大器按调制频率被解调，提供样品相位的连续测量。为了锁定解调的低相干性信号中的零交点，干涉仪锁定相位θ可以依次用电子学方法改变。以所述方式，干涉仪锁定相位的时间进展被用作样品相位的直接测量。所述锁定方案有独立于样品信号的振幅的优势。
所述系统依照优选实施方案类似于双光束光学计算机断层摄影术(OCT)技术，因为光学延迟在低相干性光波进入样品之前已准备好，而且被探测的信号对样品和干涉仪之间的距离变化是不敏感的。在其它可能的优选实施方案中，也可以使用Mach-Zender干涉仪配置准备低相干性光束。
通过把可变的衰减器引入干涉仪的一个或两个臂，两个时间延迟的电磁场的相对振幅能为了优化干涉信号而被调制。
靠基准光束稳定的相敏的LCI的示意图被展示在图14A中。该系统组件与图11类似，但是用盖玻片430上的样品代替干涉仪的一个反射镜。来自两个低相干光源(LC1和LC2)的两个光束422、424是干涉仪输入端上的入射光束。基准光束有相当于或大于盖玻片厚度(例如，大约150微米)的相干长度。盖玻片反射被用来锁定干涉仪。短的相干长度的基准光束防止干涉仪锁定受来自显微镜物镜和其它表面的虚假反射的影响。
为了区分样品表面和后表面的反射，信号光束有比盖玻片厚度小好几倍的相干长度。基准臂长度是为了给出来自样品的干涉图而被调节的，而且如同先前描述的那样，该信号是为了给出图15A和15B举例说明的样品相位而被解调的。干涉仪关于盖玻片无涂层侧面的锁定导致与这个界面相关的样品相位测量，而且几乎排除所有外部的干涉仪噪声。
与参照图11描述的光学延迟方法比较，这个优选实施方案有信号光束和基准光束两者都作为样品上的入射光束的缺点。对于生物材料，尤其是活细胞，这或许限制可能使用的基准光束功率，从而导致降低锁定质量。另一方面，扫描基准反射镜允许更直截了当地辨认来自样品的反射。诸如计算机453之类的处理装置与用来提供反馈和处理相位偏移测量结果的电子器件通信。电子图像显示器455用来显示相位偏移和相关的图像。
优选的实施方案能使用两种方法使某个区域上的样品相位成像。在优选的第一种方法中，入射光束可以如同在大多数OCT设备中那样沿着X-Y方向在样品上扫描。在包括靠基准光束稳定的LCI的实施方案中，务必在光束扫描的时候维持基准光束干涉仪锁定。依照第二种方法，电荷耦合器件(CCD)或光电二极管阵列可以用来探测这些信号而不需要扫描。图16举例说明用于稳定的相敏LCI的成像系统500。这个光学系统用来照明扩大范围的区域并且使散射光在探测器上成像。图17举例说明系统配置的简化的展开方案，以便依照本发明的优选实施方案举例说明光学设计。实线表示入射光线，而虚线表示反向散射光线。
就CCD成像而言，相对相位的测量可以通过分析4幅图像的序列完成，每幅都在相位方面不同于前一幅，相差π/2。图14B举例说明在用于依照本发明使用带压电转换器(PZT)461的反射镜产生相位偏移的主动稳定的相敏低相干性干涉测量法的系统中使用CCD成像的实施方案。电路469是用来使用PZT产生相位偏移的电子器件和用于探测相位偏移的电子器件。CCD是被集成到一片紧凑的电子芯片之中的象素阵列。本身与诸如计算机478之类的处理装置连接的CCD控制器477与CCD通信。图像显示器479用来显示相位偏移和相关的图像。
对于高带宽相位成像，来自光电二极管阵列的信号可以按第一谐波和第二谐波个别地解调；这允许明确地测量每个象素的相位。
本发明的干涉测量系统的优选实施方案的较高的灵敏度和带宽为在生物学的或非生物学的媒介物中测量小的光学相位偏移提供新的可能性。例如，这些优选实施方案能研究细胞膜的运动和波动。双波长的相敏LCI已经用来观察人类结肠细胞培养物的细胞体积调节和膜动力学。最近，已在培养物中添加叠氮化钠之后观察到细胞膜的低频振荡。优选的LCI实施方案允许按较小的时间刻度研究膜动力学，在这种情况下热驱动的波动和机械振动可能是更重要的。依照本发明的优选实施方案的二维成像方法允许在收集互相影响的细胞时研究膜波动。振荡和相互关系能提供关于细胞发信号的信息。
本发明的优选实施方案能用于神经元动作电位的测量。在神经科学中对于改进的非侵入式地监测神经元的电信号的光学方法有很大的兴趣。现在的方法仰靠对钙敏感或对电压敏感的染料，它们有许多问题，包括寿命短、光致毒性和缓慢的响应时间。
几十年前人们就已经知道动作电位在神经纤维和细胞体中伴有光学变化。除此之外，在刺激期间，神经已经表明呈现短暂的体积增加。这些变化已经根据细胞膜中的相位转变和由于细胞膜中的偶极子的重新定向造成的指数偏移得到解释。
依照优选实施方案的相敏LCI方法可以用来测量与动作电位相关联的光学和机械变化。增大的带宽允许按大约1ms的动作电位时标灵敏地测量相位。本发明的优选实施方案能用来提供神经信号的非侵入式的长期测量和提供使许多神经元同时成像的能力。这些实施方案帮助分析神经活动的时间空间图式形成对于了解大脑是重要的。已知与动作电位相伴的小的(≈10-4rad)指数偏移和膜波动在本发明的提供高水平敏感速度和高带宽(＞1kHz)的优选实施方案中能被探测出来。这些实施方案使用消除噪声的方法，例如，防止噪声进入的隔离法；使用反馈元件消除噪声的稳定法；提供不用反馈消除噪声把噪声影响减到最小的共向光程干涉测量法的差动测量。
在此描述的实施方案能被用于许多医学应用。例如，皮层映射能在神经外科手术期间完成，与现有技术的电极法相比较在速度和分辨率方面有进步。此外，这些优选实施方案能在神经外科手术期间用来使癫痫焦点定域。这些实施方案也能监测眼睛中的视网膜神经活动。本发明的优选实施方案的其它应用包括归因于这些实施方案提供的高速度的二维和三维扫描；光电二极管探测器提供的高动态范围和DC抑制；细胞生物学方面的纳米级成像；上皮组织的表征和膜的振动的探测，例如，但不限于，听觉细胞和血管。
包括双光束干涉仪的系统本发明的优选实施方案包括集成在传统的光波显微镜中的以光纤为基础的光学延迟相敏低相干性干涉仪。同步的电学和光学测量能在海马神经元的培养物中完成。优选的实施方案包括包含光电二极管阵列或快速扫描光束的成像系统。用于光学刺激神经元的方法与动作电位的LCI测量相结合能形成用来研究神经网络动力学、突触可塑性和神经科学方面的其它基本问题的极其有用的新型工具。
另一个实施方案将相敏成像技术应用于脑切片，甚至活体神经元。跟踪和补偿脑表面的运动的是有重大意义的挑战。光学散射限制可能提取神经元信号的深度，但是大约100微米的深度可能是可能的。
在此以前描述的主动稳定的干涉仪的优选实施方案已经包括两个波长系统，其中第一波长被用于稳定而第二波长被用于相位测量。图18A举例说明两点式Mach-Zender外差干涉仪系统的示意图，其中使用一个波长。这种点稳定的/基准干涉仪系统测量通过样品586上两个点的光波的相位差。几乎共向光程的几何学降低干涉仪的相位噪声。
准直激光束或低相干光源被分光镜584分成样品586路径和基准路径。样品光束通过样品586和透镜L1(物镜透镜)588和在最后的分光镜592前面的L2(管透镜)590。透镜L1588和L2590分别有焦距f1和f2而且构成放大倍率M＝f2/f1的显微镜。这些透镜排成一线，以致样品586和L1588之间的距离是f1，L1和L2之间的距离是f1+f2，而成像平面位于距L2的距离为f2的位置。
基准光束通过用频率分别为ω1和ω2的射频RF电磁场驱动的两个声光调制器594，AOM1和AOM2。可变光栏用来选择来自AOM1的+1级衍射光束和来自AOM2的-1级衍射光束。所以，以频率ω0在AOM1入射的光波以频率ωR＝ω0+Ω(其中Ω＝ω1-ω2)从第二针孔射出。这种双AOM配置是为了获得大约100kHz的比较低的外差频率Ω而被采用的。低的外差频率对于高灵敏度光电探测器的使用可能是优选的而且也有利于光学对准，因为在光束方向改变非常小的情况下，Ω可能被设定为等于零。如果需要较高的外差频率，可以使用单个AOM。诸如计算机609和图像显示器611之类的处理装置与所述系统通信。
频移的基准光束的频率被分开的距离等于其焦距之和的透镜L3598和L4600扩展。在两个成像平面的信号电磁场和基准电磁场能以复数记号法用下式描述ES(x，y，t)＝ES0(x，y)exp[i(φs(x，y，t)+φN，S(x，y，t)-ωt)](23)ER(x，y，t)＝ER0(x，y)exp[iφN，R(x，y，t)-(ω+Ω)t] (24)在这里x和y是沿着光程的横向坐标，φS(x，y，t)是正在研究的样品相位，φN，S(x，y，t)和φN，R(x，y，t)表示样品臂和基准臂中的干涉仪噪声，而ES0(x，y)，ER0(x，y)是电磁场振幅轮廓，它们可能是，例如，但不限于，高斯型的。
样品相位φS(x，y，t)可以用样品随时间变化的折射指数分布nS(x，y，z，t)来表达φS(x,y,t)=∫z1z2nS(x/M·,y/M,z,t)dz---(25)]]>其中z是轴向坐标，而且积分是在样品的深度之上完成的。请注意放大因子M。
在两个成像平面的强度是用下式给出的I±＝|ES±ER|2＝|ES0|2+|ER0|2±2|ES0||ER0|cos[φS(x，y，t)+φN，S(x，y，t)-φN，R(x，y，t)+Ωt] (26)外差信号是用定位在位置(x1，y1)和(x2，y2)的两个光电二极管PD 1604和PD2 606探测的。光波可能是通过光纤或针孔收集的。
被探测强度的AC分量是用下式给出的I1(t)＝2|ES0||ER0|cos[φS(x1，y1，t)+φN，S(x1，y1，t)-φN，R(x1，y1，t)+Ωt] (27)I2(t)＝-2|ES0||ER0|cos[φS(x2，y2，t)+φN，S(x2，y2，t)-φN，R(x2，y2，t)+Ωt] (28)然后用锁定放大器或相位探测器电路608测量外差信号I1和-I2之间的相位差。
Ф12(t)＝[φS(x1，y1，t)+φN，S(x1，y1，t)-φN，R(x1，y1，t)]-[φS(x2，y2，t)+φN，S(x2，y2，t)-φN，R(x2，y2，t)]＝φS(x1，y1，t)-φS(x2，y2，t)+φN，S(x1，y1，t)-φN，S(x2，y2，t)-φN，R(x1，y1，t)+φN，R(x2，y2，t)(29)如果现在假定干涉仪噪声与横向位置无关，即，φN，S(x1，y1，t)＝φN，S(x2，y2，t) (30a)φN，R(x1，y1，t)＝φN，R(x2，y2，t) (30b)，那么实测的相位差只是样品相位在选定的点的差φ12(t)＝φS(x1，y1，t)-φS(x2，y2，t)(31)依照本发明优选实施方案的方法可以用在仅仅服从物理限制的成像平面的许多光电探测器来实现。光电二极管阵列或光电二极管耦合光纤束可以用来使许多位置的相位同时成像。任何单一的探测器都可以被选作相对于它测量所有其它点的相位差的“基准”探测器。
成像Mach-Zender的外差干涉仪的示意图被展示在图18B中。装置670使已通过样品673的光波的相位成像。
φS(x,y,t)=∫z1z2nS(x/M,y/M,z,t)dz]]>光学设计类似于结合图18A描述的两点式Mach-Zeder外差干涉仪，但是有两个改变(i)成像探测器(例如，电荷耦合器件(CCD)682)位于成像平面之一，以及(ii)使用光电偏振调制器672和偏光片681来完成频闪式探测。定量的相位图像是用相移干涉测量法获得的。
在CCD成像平面随时间变化的强度分布用下式给出I_(x，y，t)＝|ES±ER|2＝(32a)|ES0|2+|ER0|2-2|ES0||ER0|cos[φS(x，y，t)+φN，S(x，y，t)-φN，R(x，y，t)+Ωt]频闪式相位干涉测量法用来以相敏方式使这个外差干涉图成像。这需要“门控”CCD的探测而且能以几种方式完成。增强的CCD能通过控制增强器电压被门控。在CCD前面的大孔径光电元件能作为快速光闸使用。在图18B举例说明的系统中，光电偏振开关用来控制干涉仪的输入光束的偏振。两种偏振能被标为“面内”和“面外”，对应于图18B。线偏振片681被放在CCD成像装置682前面，以便仅仅探测面内偏振光；面外偏振光的被偏振片吸收或反射。
对准第一成像平面(如果需要，经由光纤)的光电二极管阵列用来获得两点式外差干涉仪中的下列信号I1(t)＝2|ES0||ER0|cos[φS(x1，y1，t)+φN，S(x1，y1，t)-φN，R(x1，y1，t)+Ωt](32b)然后，门控信号起源于外差信号I1，如下所述。电子比较器当外差信号是正的而且有正斜率的时候输出“高电平”。这对应于在相位0的门控信号。在相移为π/2，π和3π/2的类似信号能通过当外差信号分别为正的而且有负斜率、负的而且有负斜率和负的而且有正斜率的时候触发产生。依照本发明的优选实施方案，外差信号687和门控信号688-691被展示在图18C中。
然后，门控信号被用于连续地门控CCD探测器。该序列受计算机685控制。只有当门控信号处于“高电平”的时候，才允许光波落到CCD上。对应于四个门控信号而不是相等数目的外差周期的四次曝光被CCD捕获，以便获得四次曝光时对应的强度。四个实测的条纹图像被称为I0(x，y)、Iπ/2(x，y)、Iπ(x，y)、I3π/2(x，y)。于是，相对的样品相位能用下式计算出来φS(x,y)=tan-1(I3π/2(x,y)-Iπ/2(x,y)I0(x,y)-Iπ(x,y))---(32c)]]>由于相位在四帧之中每一帧之间偏移。用来改变相位和计算相位的其它方法能被使用，例如，在此通过引证将其全部教导并入的Creath，K在“Phase-Measurement Interferometry Techniques”，Progress in Optics，Vol.XXVI，E.Wolf，Ed.，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，1988，pp，349-393中描述的那些。此外，干涉仪噪声只要它在图像平面上是常数就能借助基准有相关关系的噪声外差信号I1(t)被消除。频闪式相位成像能被看作是“桶式”积分形式，其中积分是根据共同的外差基准信号对时间完成的。
依照本发明的优选实施方案，频闪式相位成像也能用双光束外差干涉仪完成。这需要能够被CCD探测的低相干性波长，例如850nm。与下文描述的图19相比较，它还需要把样品光束递送系统修改成图18D所示的成像系统。在这个实施方案中，用来产生四个门控信号的基准外差信号是由光学基准信号提供的。探测信号的模板可能是借助光纤开关或偏振调制器用偏振片完成的。
本发明的优选实施方案包括双光束反射干涉仪。双光束反射干涉测量法的优选实施方案包括隔离双光束外差LCI。外差式双光束干涉仪620被展示在图19。所述干涉仪用来测量来自样品的反射光波相对于位于样品之前的部份反射表面的相位变化。例如，人们可能测量从玻璃薄片上的样品反射的光波的相位。作为另一个例子，测量可能是相对于来自放在被研究的样品附近的光纤探头顶端的反射进行的。
诸如超级发光二极管(SLD)或多模激光二极管之类的低相干性来源622被耦合到通过真空馈通进入真空室640的单模光纤之中。被封闭在该真空室里面的是隔震的自由空间外差Michelson干涉仪。低相干性光束经由准直透镜从光纤发射，然后被分光镜626分离。干涉仪的两个臂(叫做1(656)和2(658))包含被频率分别为ω1和ω2的射频电磁场驱动的声光调制器(AOM1 628和AOM2634))。在每个臂中，正偏移的一阶衍射光束是借助针孔选定的。光波被透镜630和636聚焦，然后被反射镜M1 632和M2 638反射回两个AOM。透镜被放在距离AOM和反射镜两者一倍焦距的位置。这种设计允许AOM回射校正继续保持低相干性(广谱的)光波的光谱。
由于AOM是在双光路配置中操作的，以频率ω0入射的光波在通过臂1(656)和2(658)之后被分别偏移到ω0+2ω1和ω0+2ω2。两个通过臂1和2的光束之间的频率差是Ω＝2(ω1-ω2)。
反射镜之一M1(632)附着在平移台上，以便调节两个臂之间的光程长度差Δl＝l1-l2。在通过两个臂之后，组合光束可以被看作是被时间延迟Δl/c分开两个脉冲的光束。来自两个干涉仪臂的反射借助准直仪660被聚焦返回光纤并且退出舱室640。
光循环器用来把回射光束与入射光束分开。光波作为自由空间光束被另一个准直仪662发射并且被聚焦在样品642上，因此首先通过部份反射的表面664。反向散射的光波被同一准直仪收集并且在通过另一个光循环器之后被光电二极管650探测。调节Michelson干涉仪的光学延迟，以便与来自样品S的反射和来自基准表面的反射之间的光程差Δs相配。当条件ΔL＝Δs维持在光源的相干长度L之内时，在频率Ω下的外差信号由于从表面S642和R 664反射的光波之间的干涉而被探测。外差信号的相位代表样品反射相对于基准反射的相位的度量，所述外差信号相位相对于通过两个AOM驱动的电磁场的混合和加倍提供的本地振荡器测量。为了阻止由单一表面反射产生外差信号，长度Δs必须实质上大于相干长度LC。假定，样品厚度小于玻璃厚度Δs，以致信号涉及玻璃表面，而不涉及来自样品的散射。
干涉仪的定量描述如下。首先考虑波数为k0的单色光源。在Michelson干涉仪的输入端的电磁场振幅能用下式描述Ei＝Aicos(k0z-ω0t) (33)通过AOM之后从分光镜返回的电磁场是用来自干涉仪两个臂的由磁场之和给出的
Em＝E1+E2＝Aicos(2k1l1-(ω0+2ω1)t)+Aicos(2k2l2-(ω0+2ω2)t)(34)其中k1＝k0+2ω1/c而k2＝k0+2ω2/c。
双重光束现在是样品上的入射光束。令s1是对基准反射的光学距离和s2是对样品反射的光学距离。如果基准反射和样品反射的反射率分别是R1和R2，而且忽略多次反射，那么从样品反射的电磁场是用下式给出的Es=AiR1cos[2k1(l1+s1)-(ω0+2ω1)t]+AiR1cos[2k2(l2+s1)-(ω0+2ω2)t]]]>+AiR2cos[2k1(l1+s1)-(ω0+2ω1)t]+AiR2cos[2k2(l2+s2)-(ω0+2ω2)t]---(35)]]>探测到的强度iD与电磁场振幅的平方成比例iD∝⟨|Es|2⟩=(R1+R2)(1+cos(2k0Δl-Ωt)+]]>2R1R2[2cos(2k0Δs)+cos(2k0(Δl+Δs-Ωt))+cos(2k0(Δl-Δs-Ωt))]]]>(36)其中光学频率振荡项已被忽略，而且假定频率偏移造成的波数偏移Ω/c与路径长度差Δs和Δl的逆相比较是可以忽略。
为了建立低相干性(宽带)光源模型，假定它有高斯功率频谱密度，其中心波数为k0而且全波长的半最大值(FWHM)频谱带宽为Δk。
s(k)=2ln2Δkπexp[-(k-k0Δk/(2ln2))2]---(37)]]>
对低相干性辐射探测到的强度是通过在频谱分布上积分单色结果发现的iD~=∫iD(k)S(k)dk=(R1+R2)(1+F(Δl)cos(2k0Δl-Ωt)]]>+2R1R2[2F(Δs)cos(2k0Δs)+F(Δl+Δs)cos(2k0(Δl+Δs-Ωt))]]>+F(Δl-Δs)cos(2k0(Δl-Δs-Ωt))]]]>(38)其中F(x)=exp[-(xlc/(2ln2))2]---(39)]]>是选定频谱密度的光源相干性函数。在这里lc是相干长度lc=4(ln2)Δk=2(ln2)λ02πΔλ---(40)]]>如果路径长度差被这样选定，以致在相干长度之内Δl＝Δs，而且Δl＞＞lc，那么依支配时间而定的信号有如下形式iD~(AC)=2R1R2[F(Δl-Δs)cos(2k0(Δl-Δs-Ωt))]---(41)]]>通过测量这个信号相对于本地振荡器652LO＝cos(Ωt)的相位，Δs的改变能被测量。请注意，为了阻止相位噪声通过Δl的改变影响测量结果，Michelson干涉仪的隔离是必不可少的。
图20依照本发明的优选实施方案举例说明隔离的双重基准外差低相干性干涉仪。干涉仪用来测量从选定的样品深度反射的光波相对于来自不同的样品深度的散射的相位。因为不需要玻璃反射表面，这种组件优于比较简单的双光束干涉仪。这个系统对于活体测量是理想的。双重基准Michelson干涉仪能用来在足够薄或透明的样品中使神经活动在三维体积上成像。所述系统能用来研究神经网络的生长。
来自低相干光源702的光波被光纤耦合器706分离到上面的和下面的路径之中。上面的路径类似于上文结合图19描述的双光束干涉仪，频移为ω1的双光路AOM代替现在位于所述干涉仪的下面的路径之中的样品。两个电磁场在另一个光纤耦合器742中被重新组合。光电二极管746、748是按双平衡模式安排的。
在单色光源情况下，干涉仪的定量描述如下。上面路径的电磁场可以写作E1＝Aicos(2k0l1-(ω0+2ω1-2ω3)t)+Aicos(2k0l2-(ω0+2ω2-2ω3)t)(42)而下面路径是(再次假定样品包含在位置s1和s2的两个反射)E2=AiR1cos[2k0s1-ω0t]+AiR2cos[2k0s2-ω0t]---(43)]]>已假定光纤电缆的路径长度在两个臂之间是相等的。与频率为ω3的AOM 736相关联的反射镜740可以被平移，以使路径长度相等。
光电探测器信号的AC分量用下式给出iD∝⟨|E1+E2|2⟩AC=R1[cos(2k0(l1-s1)-Ω13t)+cos(2k0(l2-s1)-Ω23t)]]]>+R2[cos(2k0(l1-s2)-Ω13t)+cos(2k0(l2-s2)-Ω23t)]]]>(44)
其中Ω13＝2(ω1-ω3)，而Ω23＝2(ω2-ω3)。就高斯频谱分布而言，多色情况给出i~D=∫iD(k)S(k)dk∝R1[F(l1-s1)cos(2k0(l1-s1)-Ω13t)]]>+F(l2-s1)cos(2k0(l2-s1)-Ω23t)]]]>+R2[F(l1-s2)cos(2k0(l1-s2)-Ω13t)+F(l2-s2)cos(2k0(l2-s2)-Ω23t)]---(45)]]>假如在相干长度之内，l1≈s1，l2≈s2，而且Δl，Δs＜＜lc，那么主项是i~D∝R1F(l1-s1)cos(2k0(l1-s1)-Ω13t)+F(l2-s2)cos(2k0(l2-s2)-Ω23t)]---(46)]]>接下来，这两个频率组份在混频器中被组合起来，而且通带滤波器选择差频Ω12＝Ω13-Ω23＝ω1-ω2X=R1R2F(l1-s1)F(l2-s2)cos(2k0(l1-l2-(s1-s2))-Ω12t)---(47)]]>然后，相敏探测器测量信号相对于在通过AOM驱动电磁场的混频和加倍产生的Ω12下的本地振荡器的相位。该实测的相位是φ＝2k0(Δl-Δs)。
移相器用来抵消可能不顾它的微分特性对相位测量有一些影响的干涉仪噪声。光电二极管信号组份的相位R1F(l1-s1)cos(2k0(l1-s1)-Ω13t)---(48)]]>被测量并且被用作误差信号，将来自s1的反射借助移相器锁定到恒定不变的相位。
在使用真实样品的实施方案中，除了散射分布之外将没有两个反射。通过设定基准臂位置，干涉仪测量从两个不同深度散射的光波之间的相位差。
结合图19描述的实施方案测量光学外差信号相对于通过声光调制器(AOM)射频电磁场混频产生的电信号的相位。有为数众多的与实施方案相关联的噪声来源。它们包括或许归因于来自射频电磁场的AOM加热的约为数分钟大约一个波长(1λ)的缓慢漂移和在60Hz和120Hz的相位噪声。此外，振幅出现在AOM调谐电压中而且或许归因于传输线噪声。在舱室外面的光纤移动时改变的宽带振幅和相位噪声的其它来源最有可能归因于光循环器中的偏振模色散(PMD)。
本发明的优选实施方案最大限度地减少并优选消除噪声并且包括光学基准测量、或使用精确电压电源提供的AOM调谐电压或作为替代使用维持偏振的纤维光学部件以减少漂移和噪声。图21举例说明最大限度减少噪声的光学基准干涉仪的优选实施方案。所述实施方案解决结合图19描述的系统所经历的漂移和噪声问题。参照图21举例说明的实施方案是外差式双光束干涉仪。干涉仪用来使用可能作为样品物体或个别元素上不同的横向点的基准测量来自样品的反射光波的相位改变。诸如SLD之类的低相干性光源762被耦合到通过真空馈通进入真空室782的单模光纤之中。外差Michelson干涉仪如同图19描述那样操作。来自两个干涉仪臂的反射被准直仪766、792聚焦返回两个光纤并且退出该舱室。附加光程提供作为在个别元素上不同的横向点的基准。反向散射光波分别被两个准直仪788、790收集并且在通过光循环器794和798之后被两个光电二极管796、800探测。
在双重基准干涉测量法实施方案中，把横向基准点和反射-基准相位测量结合起来。理想的是，基准点和样品物体都位于同一玻璃之上。对消除盖玻片中的任何倾斜、振动和/或膨胀效应有附加好处。如图22所示，实测的相位是φ(t)＝(φ1-φ1′)-(φ2-φ2′) (49)双重基准干涉仪的优选实施方案包括有相似的增益和频率响应的光电探测器，以便消除噪声。此外，维持偏振的组份和光纤能用来处理光纤中的偏振效应。具体地说，光循环器中的偏振模色散在两个正交偏振之间产生导致能通过使用维持偏振的部件减轻的振幅和相位噪声的可变延迟。在优选的实施方案中，数字式通带滤波器用来处理在光学信号中发现的谐波。
图23A图解式地举例说明用来标定结合图21描述的系统的压电转换器(PZT)的电压。PZT标定组件是在图25A中举例说明的。
与反射镜888的位移相对应的相位改变是在图23B中图解式地举例说明的。这个相位变化对应于27nm的标定距离变化。
图24图解式地以弧度为单位举例说明在50ms的总时间周期里与图21举例说明的干涉仪相关联的噪声性能，其中干涉仪的两个臂是相等的。
图25A和25B是依照本发明优选实施方案用于样品信号和基准信号的标定组件的示意表达。在反射镜和分光镜之间的间隔是随着PZT改变的。PZT的运动是通过监测光源(He-Ne或Ti蓝宝石)的发射标定的。
本发明的优选实施方案涉及系统包括用来在动作电位期间完成诸如神经移位运动之类的弱反射表面的细微运动的非接触测量的双光束低相干性干涉仪。神经纤维在动作电位期间呈现迅速向外侧面移位。这种通常归因于水流入轴突的“膨胀”现象最初是在螃蟹神经中观察到的，后来是在许多其它的无脊椎动物和脊椎动物的实验标本中观察到的。所有的神经膨胀观察迄今仍然倚赖与神经实际接触的光学传感器或压电传感器。用来测量神经移位的非接触式光学方法能消除与接触相关的人工制品并且允许多条神经的活动以它们的天然状态同时成像。
本发明的优选实施方案包括双光束外差式低相干性干涉仪及其在测量龙虾神经束的膨胀效应中的应用。现有的用干涉仪观察神经膨胀的方法尚未成功，因为灵敏度低和无法探测任何与青蛙或龙虾神经的动作电位相关联的运动。最近，已使用透射光波干涉仪成功地测量了神经在动作电位期间的折射指数变化。
测量在毫秒时间范围内约为数纳米的神经位移需要能够从低反射率表面记录的快速的和稳定的干涉仪测量系统。依照优选的实施方案，由单模光纤和自由空间元素组成的双光束系统被展示在图26中。来自与超级发光二极管922(Optospeed SLD，FWHM的中心波长为1550nm，带宽为40nm)耦合的光纤的光波准直后进入包含在双光路配置中校直的并且由频率为ω＝110.1MHz和ω2＝110MHz的射频电磁场驱动的声光调制器(AOM)946、952的Michelson干涉仪。安装在平移台上的反射镜允许控制在两个干涉仪臂之间往返光程差ΔL。光波通过光纤准直仪进出Michelson干涉仪。
来自Michelson干涉仪的两个口之中每个口的输出是由有不同的频移和可变的延迟的两个低相干性电磁场组成的双重光束。双重光束之一是神经舱室组件(在图27中详细说明)上的入射光束，而另一个是基准间隙上的入射光束。神经组件和基准间隙每个都包含被可调节距离分开的两个反射表面，而且被校直以便将入射光波反射回其各自的光纤。这些表面之一几乎是在空气和无涂层玻璃之间的界面。在样品中第二反射来自在空气和神经表面之间的界面。
ΔLS和ΔLR分别是来自样品和基准间隙的表面1和2的反射之间的往返光程差。调节各种不同的组份以致三个路径长度ΔL、ΔLS和ΔLR全部等于在光源相干长度之内。当条件满足时，光电探测器932、962(新的聚焦2011)记录由于(1)横越Michelson干涉仪的臂1并且从样品(或基准间隙)的表面2反射的光波和(2)横越Michelson干涉仪的臂2并且从样品(或基准间隙)的表面1反射的光波之间的干涉造成的频率为Ω＝2(ω1-ω2)＝200kHz的外差信号。两个外差信号之间的相位差(多达2π的倍数)是φ(t)＝k0[(ΔLS-ΔL)-(ΔLR-ΔL)]＝k0(ΔLS-ΔLR)，其中k0是来源的中心波数。最易受相位噪声影响的量——Michelson路径延迟ΔL在这种差动测量方法中被删除。与偏振无关的光循环器926、930、960用来使探测到的功率达到最大值并且阻止反射光波再次进入Michelson干涉仪。偏振控制器(未展示)用来最大限度地减少纤维光学组份中的偏振模色散的效果。
为了测量相位差φ(t)，光电探测器的输出被12位的A/D卡(美国国家仪器公司PCI-6110)以每秒五百万个样品的速率数字化。计算机中的指令序列借助Hilbert变换计算两个信号之间的相位差而且把该相位偏移表达成相对的表面位移d(t)＝φ(t)/2k0。
为了检验干涉仪完成了位移测量，神经组件被使用压电转换器以300Hz频率和27nm振幅按正弦曲线调制谐振腔间隔的平面Fabry-Perot谐振腔代替。当谐振腔在若干微米范围内被扫描的时候，双光束干涉仪的振幅和频率测量结果与通过监测632.8nm氦-氖激光器光束的传输确定的数值很好地一致。
依照优选的实施方案，来自美国龙虾(美洲龙虾)的步足神经(～1mm直径，～50毫米长)被解剖并且被放在图27所示的用丙烯酸树脂机械加工而成的神经舱室上。该舱室包含五个充满龙虾盐水溶液的容器，而在各容器之间的神经被凡士林绝缘层包围着，以使容器之间电阻最大。刺激隔离器递送振幅可变的电流脉冲(0-10mA，持续时间1ms)以便通过刺激电极刺激神经。刺激隔离器所递送的电流由于通过盐水的平行电导或许比通过神经的真实电流大得多。在神经中产生的复合动作电位是用一对记录电极998a、998b探测的，而且是以增益104放大的。在中心孔中，神经被放置在小玻璃台上，以致它没有浸没在盐水溶液中。在解剖和数据收集期间，神经用盐水保持潮湿。
图28A和28B举例说明依照本发明的优选实施方案在一个试验里的电位和神经的光学法实测位移。在电信号中时间零点处的尖峰是人为刺激造成的。它后面跟着一系列描述神经束中多个轴突的动作电位的峰。光学信号展示高度大约为5nm、FWHM持续时间大约为10ms的峰，其方向对应于上表面位移。光学信号展示单一的峰，而不是像电信号那样多个尖峰；这可能是由于位移信号的单相(单一符号)特性造成的。位移测量的rms噪声对于1kHz带宽大约为0.25nm。
位移是在大约一半神经标本中观察到的而且对于5mA刺激振幅从0nm变化到8nm。大的易变性可以反映出在神经本身或准备程序方面的差异。相似的位移振幅也已经有使用螃蟹和小龙虾的神经的报告。在使用光学杠杆的龙虾神经膨胀最新研究中大约～10次较小的位移被观察到，这可能反映技术的人为现象。
为了控制诸如来自欧姆加热的热膨胀之类由于刺激电流造成的神经加热的人为现象，单一神经的峰值电信号和位移信号是在改变刺激电流时测量的(如图29所示)。电信号和位移信号呈现几乎同一的阈电流(大约1.5mA)和饱和电流(大约5mA)，从而暗示观察到的位移与动作电位相关联。相反，欧姆效应将以与电流的二次依存关系为特色而与饱和无关。因此，依照本发明的优选实施方案提供能控制人为刺激的神经位移研究。优选的实施方案包括完成首次非接触式的和首次干涉测量法的神经膨胀测量的外差低相干性干涉仪。依照本发明的优选实施方案，神经膨胀的生物物理机制能就个别的轴突成像和分析。双光束低相干性干涉仪可能在测量活细胞的纳米级的运动方面有许多其它的应用。其它的实施方案能包括以干涉仪为基础探测与动作电位相关联的单一神经元的机械改变的显微镜。相关的干涉测量法也用来测量在被培养的单层细胞中细胞体积的改变。
图30依照本发明的优选实施方案，举例说明双光束干涉仪的扫描系统的光学设计。安装在机动化检流计1024、1030上的反射镜被放置在成像系统的傅立叶平面并且允许光束以不变的角度扫过样品。反射镜以大约30Hz、1-2度振幅(在样品上50-100nm)扫描。检流计可以按Lissajous图1052被设置光栅或扫描。
图31举例说明依照本发明的优选实施方案检流计位置和使用Lissajous扫描从空白盖玻片收集的相位数据。总视场大约是100微米。垂直轴是实测的相位。噪声轮廓是在1kHz上大约25mrad。
图32A和32B举例说明依照本发明的优选实施方案回射的相位图像和强度(振幅)图像的彩色映射图。光束扫描数据是从空白盖玻片收集的。噪声轮廓是在1kHz上大约25mrad。功率由于当光束离开光轴移动的时候发生的未对准和修剪在中心最高。图像中的黑点对应于用Lissajous图不被访问的象素。
图33示意地举例说明借助本发明的实施方案解决的聚焦问题。细胞2002放置在双光束显微镜的玻璃盖玻片2004上。实线代表聚焦在玻璃上表面和细胞上的光束。虚线代表从玻璃的底面反射的光束。相位-基准干涉测量系统是依照本发明优选实施方案的双光束干涉测量法，并且需要不仅收集从兴趣样品散射的光波而且也收集来自位于样品前面的固定的基准表面的反射。样品和基准不同的轴向位置应对有效地同时收集基准和样品两者的散射，尤其是对于高数值孔径的光学系统。焦点问题的两种解决办法是由优选实施方案之中允许在数值孔径为0.50的情况下有效地收集样品和基准的光波的两种系统提供的。首先，双焦透镜系统通过把数值孔径分为通过双焦点光学元件中曲率不同的部分的边缘光线和近轴光线把样品表面和基准表面同时带进焦点。双焦元件能通过在平凸透镜的凸面上磨平中心区域构成。把双焦透镜放置在显微镜的傅立叶平面附近允许经由用于样品成像的反射镜检流计的光束扫描。
图34举例说明依照本发明优选实施方案的双焦透镜设计。把双焦透镜放在物镜前面而不是后面是比较容易的。所述实施方案使平移变得容易。
图35举例说明依照本发明的优选实施方案的双焦透镜系统的另一种设计。双焦透镜系统2050通过把双焦透镜放在成像系统的傅立叶平面或该平面附近允许光束扫描。光束2068是近轴光束，而光束2070是边缘光束。所述光学性质对一阶倾斜光束是不变的。
图36举例说明透镜f3(双焦点的)和f2之间的最佳距离的计算，以致在物镜后面的两个焦距之间的间距依照本发明的优选实施方案等于Δ＝100微米。所述光学设计是通过光线跟踪提供的。
图37举例说明依照本发明优选实施方案的双焦透镜的制造。双焦透镜能通过抛光平凸透镜的中心部分制作。除去非常小的玻璃厚度(大约2-10μm)。小的改变导致信号和基准之间的路径长度差。
图38举例说明当物镜依照本发明的优选实施方案向玻璃盖玻片扫描的时候通过光循环器的实测回射强度。来自背面和正面的反射被分开大约100微米。没有重叠并因此没有干涉。
图39就依照本发明的优选实施方案有来自反射镜的单一反射的双焦透镜而言举例说明回射强度与物镜焦点位置之间的关系。使用双焦透镜f3，(当物镜位置被扫描时)来自反射镜的单峰被一分为二，对应于以不同的物镜焦点位置在反射镜聚焦的近轴光束和边缘光束。峰之间的间距取决于透镜f2和f3之间的距离。在本实施方案中，间距是大约100微米。
图40举例说明依照本发明的优选实施方案在有双面盖玻片反射的情况下使用双焦透镜时的回射强度和物镜焦点位置之间的关系。这张图将早先的两张图放在一起，提供四个主峰和几个较小的峰。
图41举例说明依照本发明的优选实施方案当f2和f3之间的距离被调节到与前后玻璃表面之间的间距相匹配的时候回射强度和物镜焦点位置之间的关系。边缘光线在后背面上聚焦，在相同位置近轴光线在前背面上聚焦。这提供可以在中心见到的大峰。
图42举例说明由于依照本发明的优选实施方案近轴光束和边缘光束的耦合产生的额外的较小的峰。这些额外的峰能通过在中途精确地发生在两个峰之间的从近轴向边缘光束耦合得到解释。额外的峰的振幅高度地取决于光学对准并且能通过微调光学系统被减到最小并优选被消除。
图43A举例说明依照本发明的优选实施方案作为集成元件的有基准表面的双光束探头。该探头由光纤准直仪2382和折射率渐变(GRIN)透镜2390组成。GRIN透镜的无涂层的后表面提供基准反射。由于不需要分开的基准表面，所以该探头非常适合于活体内应用。为了完成二维相位成像或三维共焦相位成像，该探头可能被装在快速扫描压电转换器上。所述实施方案提供容易用于位移测量的预先对准的光纤探头。该探头有高数值孔径(NA)，在大约0.4-0.5的范围内，提供从散射表面有效的光波聚集。整体基准表面解决景深造成的问题。所述优选实施方案的探头代替复杂光学器件的集合而且适合于活体内使用。
图43B举例说明的是光纤型双光束干涉仪探头2381的另一个优选实施方案。在这个例子中，基准反射是由光纤夹层末端2385提供的。在这种情况中，末端2385被抛光成与光纤轴成直角。光纤2383安装在插进外壳2387的玻璃套环2389中。光纤末端2385发出的光波是用折射率渐变(GRIN)透镜聚焦的，在这个例子中该透镜有大约0.29或0.3的节距。被校直光纤的有近似等于3.5的放大倍数M，以使光纤(NA＝0.13)和GRIN透镜(NA＝0.50)的数值孔径相匹配。光束聚焦在样品上，在这个例子中样品距探头的远端表面大约300微米。
图43C是来自鼠海马培养物的两个神经纤维(轴突或枝晶体)的明视场显微镜图像。图43D是作为使用双焦双光束显微镜扫描样品实测的位置函数的外差信号振幅的表达。
图43E是在图43D中见到同一样品的反射相位图像。
图44是依照本发明的优选实施方案用来研究在动作电位期间在神经中观察到的位移效应的几何学的双光束探头的示意图2400。通过改变探头的角度，能测量不同方向的位移。
图45举例说明依照本发明的优选实施方案能通过扫描探头或样品用于成像的双光束探头系统。为了避免引进由于样品运动造成的人为现象，扫描探头是优选的。探头由于它的重量轻(大约2-3克)能被非常快地(大约1kHz)扫描。因为基准表面被集成在探头中，(强度和相位两者的)三维共焦成像是可能的。列举的双重光束探头系统能测量透射或反射。优选的实施方案包括扫描型双光束探头显微镜，所以物镜到样品的距离是高度稳定的。
图46A-46C分别举例说明依照本发明的优选实施方案使用双焦点的双光束显微镜从放在有防反射涂层的玻璃盖玻片上的干燥的人类面颊上皮细胞(或两个重叠细胞)获得的强度图像、反向散射光波的实测相位图像和明视场图像。这些图像是通过扫描有电动平移装置的显微镜载物台产生的。图46A和46B的图像(水平方向130微米×垂直方向110微米的视场，扫描是100×100象素)分别显示外差信号的振幅和相位。图46C是同一面颊细胞的明视场图像(视场大约为60微米×40微米)。该相位图像显示少于一个波的对比这可能反映由于与玻璃基体接触几乎平坦的细胞下表面的形貌。
图46D-46G举例说明图43举例说明的双光束显微镜的轮廓曲线测定能力，25毫米焦距的平凸透镜的凹面如图46E所示被放到盖玻片上，所述盖玻片的顶部有防1.5微米波长反射的涂层。图46D举例说明透镜中心部分的强度图像。图46F是反射光波的相位映射图。图46G举例说明相位图像的横截面，相位通过二次拟合展开。二阶项的系数对应于与已知的透镜表面曲率一致的11.7毫米的曲率半径。在强度图像和相位图像中的边远点可能是透镜上的尘粒或凹陷造成的。
图47A-47E举例说明移相干涉测量法的原理，包括干涉图和依照本发明的优选实施方案收集诸如相位步进(图47B和47C)和桶式积分(图47D和47E)之类画面的不同方法的示意图。该方法包括调制相位、记录三个画面的最小值和计算光学相移。
图48A-48C举例说明依照本发明优选实施方案的频闪式外差干涉测量系统的原理。为了给出非常低的相位噪声，这个系统包括导致除了桶式切换涉及相关的噪声基准外差信号以外类似于桶式积分的连续相位斜升的声光调制。反之，频闪式外差干涉仪提供连续的测量，因为没有机械式反射镜位移造成的停顿。
图49举例说明依照本发明的优选实施方案的频闪式双光束外差干涉仪2570的示意图。来自双光束干涉仪的光波被准直然后进入光电偏振调制器2594。光波从分光镜2582反射出来，通过呈望远镜配置的两个透镜2580、2576(f1和f0，物镜)，然后作为准直光束照射样品。来自样品(例如，细胞2573)和盖玻片后表面的回射光波被物镜和f1收集到CCD 2586上。透镜f1被调整到距CCD一个焦距和距傅立叶平面(FP)2578一个焦距。物镜f02576同样是距傅立叶平面一个焦距和距样品一个焦距。光电偏振调制器与在CCD前面的偏振片2584组合充当快速的光学开关。光电偏振调制器是依照作为来自双光束干涉仪中的基准间隙的外差信号的基准信号的相位实施门控的。820nm的SLD被用于优选实施方案。样品2573上的光波被准直，因此预先排除任何焦点问题。
图49B和49C举例说明依照本发明的优选实施方案展示图43所示的双光束探头聚焦在静止的玻璃表面上造成的相位噪声的数据。
结合图26展示和描述的系统向尝试在典型的例子中把光波聚焦在被轴向分开大约100微米的反射表面和样品上提出挑战。在数值孔径＞0.1的情况下，这比景深大得多。改变双焦光学系统或探头设计解决这个问题是可能的，然而，双焦系统通常有采用高数值孔径物镜时变得更差的低收集效率，而且来自透镜离轴部分的绕射能产生边缘效应。探头设计受表面基准与样品分开和NA在采用GRIN透镜时被限制在0.5这一事实的限制。
图50A举例说明的是来自两条路径的光波在被引到样品上之前先沿着共向光程合并的系统2700。来自路径1的光波聚焦在表面1上，而来自路径2的光波聚焦在表面2上。
把这个特征并入的干涉仪被展示在图50B的双光束系统2800中。系统2800有光源2801，两个移动反射镜2803、2805和把来自两条路径的光波引向样品2807表面和基准2809表面的偏振分光镜2811。偏振组份的方向被清楚地展示在图50C中。干涉仪的每个臂被引到一个表面上。光波因此被更有效地使用。光束被分开聚焦，没有来自双焦透镜的边缘效应。不存在由此产生的数值孔径方面的折衷，而且该系统交易能被配置在自由空间中不需要光纤耦合，除了非必选地来自光源的光纤耦合之外。这能改善光波收集效率。
使用空间光波调制的定量相衬显微镜另一方面，本发明提供把相衬显微镜与和相移干涉测量法结合起来的显微镜系统和方法。本发明的系统和方法能应用于透射几何学和反射几何学。在各种不同的实施方案中，所述方法和系统把共向光程用于不同空间频率的波并且偏移发源于样品上同一点的不同空间频率的波之间的相位。
光学领域的相位多年来已被用来提供许多应用中需要的子波长准确性。例如，作为本质上弱的散射体的生物学系统通过使用相衬显微镜的原理已变成看得见的。干涉测量法是一种获取相位信息的途径，所以，在过去的数年中以重新获得与样品相关联的相位为目的已开发了各种不同的干涉测量技术。诸如相衬和Nomarski显微镜之类的技术虽然非常有用而且是流行的方法，但是仅仅使用光学相位作为反衬工具，不提供关于其它大小的定量信息。
另一方面，移相技术能够定量地确定相位信息，而且各种不同的干涉测量方案在过去的数十年中已被提出。以偏振光学为基础的差动相衬技术已经与通常的光学相干性断层摄影术对接。桶式集成技术，作为移相干涉测量法的特定情况，也已被用于二维相位成像。然而，大多数这样的干涉仪需要形成两个物理上被分开的光束，这使它们易受无关联的环境噪声影响。为了主动地消除噪声，这个问题往往需要特定的措施。锁相环已被用于这个目的。所需要的是减少或消除来自干涉测量信号的无关联的噪声的显微镜系统和方法。
本发明的系统和方法使用共向光程使发源于样品的不同空间频率的光波相干。在各种不同的实施方案中，本发明提出的系统和方法提供实质上没有无关联的环境相位噪声的样品相位图像。除此之外，在优选的实施方案中，本发明的方法在使用低相干性照明光源的时候即使存在相位奇点也能获得相位图像。
在各种不同的优选实施方案中，本发明提供对环境相位噪声不敏感而且能在任意的曝光时间范围内提供非常精确和稳定的相位信息的仪器。在各种不同的实施方案中，本发明以作为干涉图的图像描述为基础。这种描述的一个例子是阿贝成像理论。图像平面中的每个点都被看作是相对于光轴以不同角度传播的波的重叠(干涉)。如果我们把来自样品的零阶散射作为干涉仪的基准考虑，那么该图像能被看作是零阶电磁场和离开光轴传播的电磁场之间的干涉。
图51A-5D是这样的图像描述的各种不同特征的示意表达。图51A是由高空间频率组份1104和零阶组份1106形成的干涉图1102的示意表达1100。图51B是由低频组份1114和零阶组份1106形成的干涉图1112的示意表达1110。图51C是由空间频率宽广的光束1124在图像平面1126的重叠形成的衍射斑1122的示意表达1120。图51D是由较狭窄的空间频谱1134在图像平面1126产生的较宽的衍射斑1132的示意表达1130。除此之外，例如，零阶组份和较高阶的组份能被看作DC分量和AC分量。
在成像平面中电子场的振幅和图像平面中的强度能被表示成 Iimage∝cos(1-0) (51)其中Eimage代表光波在成像平面上某点的电场振幅，代表光波的相位，Iimage代表光波在成像平面上某点的强度，而其中的下标0和1分别代表用于方程式50-56中的零阶组份和高阶组份，例如，单一的振幅已被考虑。方程式51举例说明对于在样品上与π相比较很小的相位变化Δ＝1-0，图像平面中的强度缓慢地改变，这等于说图像缺乏反差。然而，通过把零阶相位0偏移π/2，图像强度分布能被表示成Iimage∝sin(1-0) (52)方程式52举例说明现在图像平面的强度在数值Δ＝0的周围是非常敏感的，相当于该图像即使对于纯粹地调整物体相位也呈现明显的反差。
除了改善强度反差之外，偏移零阶光波组份的相位也能提供关于该物体的相位分布的定量信息。例如，考虑将零频率组份的相位偏移能被可控制地改变的数量δ。在图像平面中任何点(x，y)的总电场E(x，y)image和强度Iimage(x，y，δ)能用下式表示，从而记住零阶电磁场在图像平面上是不变的 其中I0是与低频组份相关联的强度，I1是与高频率组份相关联的强度。
在此，我们一般地提到来自样品的光波的阶次。然而，当使用SLM的时候，在实践中，仅仅可控制地偏移来自样品的光波的零阶组份的相位是非常困难的。因此，在优选的实施方案中，我们偏移包含所有零阶光波的低频空间组份的相位。因此，人们将会理解，本发明的系统和方法能通过仅仅偏移零阶组份的相位被实践，而且偏移其它阶次的相位不是必需的。
通过改变δ，能获得Δ(x，y)＝1(x，y)-0和表达式 与样品相关联的相位能使用方程式53和54获得，而这两个方程式本身使用，例如，总电场E(x，y)的相位表达式。与物体相关联的相位能用下式表示 在方程式56中，β＝I1/I0而且代表分别与高空间频率组份和低空间频率组份相关联的强度之比。β的数值能被获得，例如，从四个数值δ下的Iimage(x，y，δ)获得。
在各种不同的实施方案中，本发明的系统和方法以显微镜系统的透射几何学为基础。图52示意地依照本发明以透射几何学为基础举例说明显微镜系统1200的一个实施方案。参照图52，一对透镜，物镜透镜1204和管透镜1206按透射几何学使样品1210在图像平面P21212成像。透镜L31214能用于在空间光波调制器(SLM)1216上形成图像的傅立叶变换。SLM 1216上的中心区域能相对于SLM的其余部分把可控制的相位偏移δ应用于入射光束1220的中心区域而且反射整个入射光束1220。入射光束1220的中心区域对应于用光束内边界1222描绘的低空间频率波。外边界1224举例说明高频光束组份的路径，放大低频光束组份和高频光束组份两者的发散以便被看到。透镜L31214也能充当4-f系统的第二透镜，使用分光镜BS 1232在诸如电荷耦合器件(CCD)之类的探测器1230上形成最后的图像。
各式各样的装置都能用来控制SLM和获得样品图像。例如，在各种不同的实施方案中，计算机1250控制SLM1216的调制从而使δ增加π/2而且优选使探测器1230的图像采集同步。方程式55的运算能被实时地完成；因此显示相位图像的速度在优选实施方案中仅仅受探测器1230的采集时间和SLM1216的刷新率的限制。
各式各样的照明模式和照明光源能用来为本发明的透射几何学提供照明1260。该照明能在明视场模式或暗视场模式中完成。除此之外，对所用来源的相干性质没有特殊的要求。本发明的系统和方法能使用激光、部份相干的辐射或“白”光(例如，来自放电灯)。然而，照明光源应该有好的空间相干性。
如图52所示，相干的低频和高频电磁场是同一光束的组份；并因此分享共向光程。因此，低频组份和高频组份以类似的方式受相位噪声影响，因此本发明的系统的各种不同实施方案能被看作是无光学噪声的定量相衬显微镜。例如，在各种不同的实施方案中，在任意的采集时标范围内λ/1000的相位灵敏度是可能的。
在各种不同的实施方案中，本发明的系统和方法以适合于显微镜系统的反射几何学为基础。透射几何学和反射几何学之间的差别在于照明几何学。透射几何学能被转换成反射几何学。
图53示意地举例说明依照本发明以反射几何学为基础的显微镜系统1300的一个实施方案。低频组份和高频组份两者的路径外边界为了清楚起见在图53中未被举例说明。除此之外，在图53中光束的发散为了看得见被放大。在各种不同的实施方案，分光镜BS11301允许第二照明光源1302耦合到该系统之内并提供照明1303。在一个实施方案中，第二照明光源包括超级发光二极管(SLD)。为了避免由于在光程中各种不同界面的反射造成的干涉，诸如SLD之类的低相干性光源是符合需要的。
参照图53，一对透镜、物镜透镜1304和管透镜1306使样品1310在图像平面P21312成像。透镜L31314能用来使图像的傅立叶变换在空间光波调制器(SLM)1316上形成。SLM1316上的中心区域1317能相对于SLM的其余部分把可控制的相移δ应用于入射光束1320的中心区域1318和反射整个入射光束1320。入射光束1320的中心区域1318对应于低空间频率波。透镜L31314也能充当4-f系统的第二透镜，在诸如CCD之类使用分光镜BS1332的探测器1330上形成最后的图像。
各式各样的装置能被用来控制SLM和获得样品图像。例如，在各种不同的实施方案中，计算机1350控制SLM1316的调制使δ增加π/2而且优选使探测器1330的图像采集同步。方程式55的运算能被实时地完成；因此显示相位图像的速度在优选的实施方案中只受探测器1330的采集时间和SLM1316的刷新率限制。
反射几何学依照本发明的优选实施方案也能包括诸如在透射几何学中使用的照明1360。适当的透射照明模式包括但不限于明视场和暗视场模式。如同依照本发明在透射几何学中那样，关于照明光源的相干性性质没有特殊的要求。本发明的系统和方法能使用激光、部份相干的辐射或诸如来自放电灯之类光源的“白”光。然而，照明光源应该有好的空间相干性。
依照本发明在反射几何学中，相干的低频电磁场和高频电磁场也是同一光束的组份并因此分享共向光程。因此，低频组份和高频组份以类似的方式受相位噪声影响，而且本发明的系统的各种不同实施方案能被看作是无光学噪声的定量相衬显微镜。例如，在各种不同的实施方案中，λ/1000的相位灵敏度在任意的采集时标范围内都是可能的。
在各种不同的实施方案中，本发明提供利用空间光波调制的相衬显微镜系统，该系统包括成像组件和相位成像组件。成像组件和相位成像组件能，例如，被独立地建造，从而使它们更容易用于现有的光学显微镜。
被统称为图54的图54A和54B示意地举例说明将本发明与光学显微镜整合的一个实施方案1400。低频组份和高频组份两者的路径外边界为了清楚起见没有在图54中举例说明。除此之外，光束的发散在图54中为了看得见被放大。
相位成像头1450能使用，例如，显微镜的视频输出与光学显微镜1410对接。光学显微镜1410包括能操纵光波使之从样品1420到显微镜视频输出的一对透镜L11412、L21414和反射镜1416。通常，一部分光波被分光镜1424引向为了供人类眼睛1430观看将光波聚焦的目镜1426。
相位成像头1450包括用来在空间光波调制器(SLM)1456上形成图像的傅立叶变换的透镜L31454。SLM1456的中心区域能相对于SLM的其余部分把可控制的相移δ应用于入射光束1460的中心区域并反射整个入射光束1460。入射光束1460的中心区域对应于低空间频率波。透镜L31454也充当4-f系统的第二透镜，在诸如CCD之类使用分光镜BS 1472的探测器1470上形成最后的图像。
SLM的控制和样品的图像采集可以被完成，例如，使用控制SLM1456的调制使δ增加π/2并优选使探测器1470的图像采集同步的计算机1480。计算机可以是独立的计算机，例如，备有相位成像头，或者“计算机”能包括依照本发明驻留在与显微镜相关联的计算机上的指令。方程式55的运算能被实时地完成；因此，显示相位图像的速度在优选的实施方案中只受探测器1470的采集时间和SLM1456的刷新率限制。
在各种不同的实施方案中，本发明的系统的横向分辨率能借助4-f系统的扩充得到改善。4-f系统能用于透射几何学和反射几何学。除此之外，4-f系统能用于包括标定系统的系统。4-f系统使利用对图像完成的其它傅立叶操作变得容易。
图55示意地举例说明本发明方法利用4-f系统的系统1500和方法的一个实施方案。该4-f系统包括一对透镜L41504、L51506，而且能包括空间滤波器F 1508。空间滤波器F 1508提供个别空间频率的振幅控制。与依照本发明由SLM提供的相位控制相结合，所述振幅控制使，例如，研究细胞里面的小细胞器变得容易，因为高频组份的增强能改善对比度。人们能想象空间滤波器F能优先衰减某些空间频率的其它应用。
4-f系统能被加到本发明的各种不同的透射几何学实施方案和反射几何学实施方案上。反射光源(例如，图53中的第二照明光源1302)能很容易地依照本发明被原本熟悉这项技术的人使用本发明提供的揭示加到图55的实施方案中。
用于利用空间光波调制的相衬显微镜的系统和方法有各式各样的应用。例如，这些系统和方法能用来使微米级和纳米级的结构成像。重要类别的应用在于研究细胞间和细胞内的组织、动力学和行为。通过将共向光程用于低频组份和高频组份提供的稳定性，以及按透射模式和反向散射模式完成测量的能力使本发明的各种不同的优选实施方案适合在延长的时间周期(从几个小时到数天)里研究单一细胞和细胞全体。因此，在各种不同的实施方案中，本发明的优选实施方案提供的相位成像被用来提供关于细胞的缓慢动态过程的信息，例如，活细胞在从有丝分裂到细胞死亡的生命周期中的大小和形状变化。
在各种不同的优选实施方案中，本发明的方法和系统被用来以纳米精度研究细胞在分裂之后的分离过程和提供关于细胞膜的尺寸、性质或两者的信息。近来已受到特别关注的现象是程序性细胞死亡——凋亡。假定凋亡能在实验室中受到控制，在各种不同的优选实施方案中，本发明的方法和系统被用来研究在这个过程中诱发的细胞变形。在各种不同的优选实施方案中，本发明的方法和系统用来研究和探测各种不同类型的细胞(例如，癌细胞与正常细胞)的生活周期的差异。
人们期望细胞融合层有能导致集体机械行为的某种程度的共有的相互作用。在各种不同的优选实施方案中，本发明的方法和系统用来研究这种共有的相互作用，例如，通过完成依照本发明获得的相位图像的不同点之间的交叉相关。
由本发明的优选实施方案提供的相位成像也能用来提供关于细胞的快速动态过程的信息，例如，对刺激的反应。例如，诸如细胞体积调整之类的过程是活细胞对生物化学刺激的反应。这个反应的时标可能在从数毫秒到数分钟之间而且应该能使用本发明的系统和方法的优选实施方案非常准确地测量。在各种不同的优选实施方案中，本发明的方法和系统用来研究细胞对生物化学刺激的反应并且测量细胞结构(例如，细胞骨架)的机械性质。
在各种不同的优选实施方案中，本发明的方法和系统用来研究有重大意义的细胞结构信息，例如理解细胞中细胞器的转运现象以及创造人造生物材料。在各种不同的优选实施方案中，本发明的方法和系统用来研究细胞结构，例如，通过使用机械振动刺激细胞膜并测量细胞膜振荡的振幅以便，例如，使它们与细胞机械性质和细胞物质发生关系。传统上，使用磁性的或捕集的珠子来刺激这种运动。在各种不同的优选实施方案中，本发明的方法和系统用来使用磁性的或捕集的珠子刺激机械振动、毫微微秒激光脉冲的光子压力引起机械刺激或两者来研究细胞结构。
一类重要的应用是研究胞内组织和细胞器动力学。在各种不同的优选实施方案中，本发明的方法和系统用来研究各种不同的粒子在细胞里面的转运。
除了生物学研究的多样性之外，本发明的优选实施方案还适合工业应用，例如，研究半导体的纳米结构。半导体工业缺乏在纳米级加工过程中晶片质量的可靠的快速检验。在各种不同的实施方案中，本发明的方法和系统用来提供关于半导体结构的纳米级信息，例如，以定量的方式。在优选的实施方案中，纳米级信息拥有大约一秒的测量结果。
图56示意地举例说明依照本发明利用空间光波调制(SLM)的相衬显微镜系统1600的一个实施方案。以1600举例说明的系统能使用反射几何学和透射几何学。除此之外，该系统拥有标定子系统。
参照图56，一对透镜、物镜透镜L11607和管透镜L21606使样品1610使用反射镜1613在平面P 1612成像。成像可以是使用透射几何学完成的，例如，通过光纤耦合器(FC)1614和来自第一照明光源1620(在这里被举例说明为氦氖(HENE)激光源)的第一光纤1616光波与样品1610耦合。成像也能使用反射几何学完成，例如，通过FC 1614和第二光纤1622耦合来自第二照明光源1624(在这里被举例说明为SLD)的光波再使用第一分光镜1626把来自第二照明光源1624的光波引到样品1610上。
透镜L31630用来在第一空间光波调制器(SLM)1632上形成图像的傅立叶变换。SLM1632用来把可控制的相位偏移δ加到入射光束1634的中心区域。在一个实施方案中，透镜L3充当4-f系统的第二透镜1630使用第二分光镜1638在第一探测器1636(在这里被举例说明为CCD)上形成最后的图像。在一个实施方案中，图56所示的系统进一步包括第二个4-f系统，例如，在图49中示意地举例说明的。图50的系统也包括用来标定SLM的标定子系统。标定光波的路径是用虚线1640示意地举例说明的，而照明光波和成像光波的路径是用实线1642示意地举例说明的。标定子系统使用一对透镜L41652和L51654(形成光束扩张器)收集一部分来自第一分光镜1626的光波并且通过能用来在相位模式和振幅模式之间切换SLM操作的偏振片Pc1656传送该光波。为了标定，SLM1658按振幅模式从头到尾扫描从0到2π的相位偏移，因此产生的移相光波当它通过偏振片返回的时候被衰减。然后，光波通过透镜L61660被收集起来并且在探测器1664上聚焦。
多种装置和方案能用来控制图50的系统和标定相位图像。在一个实施方案中，第一控制单元PC11670被用于借助第一探测器1636的图像采集，而第二控制单元PC21672用来控制第一和第二SLM1632、1658和通过示波器1674收集来自探测器1664的数据。控制单元PC1，PC2可能是分开的单元或单一单元。例如，PC1和PC2可能是分开的计算机或同一台计算机，所述的控制单元可以包括适合实现控制单元的功能的模拟和/或数字电路。
在各种不同的实施方案中，本发明的系统和方法包括例如使用微透镜的动态焦点。在各种不同的实施方案中，本发明的系统和方法包括平行的焦点以便，例如，使样品上的两个或多个点同时成像。在各种不同的实施方案中，本发明的系统和方法包括适合于，例如，在深度方面同时访问几个点的相干函数。
本发明利用空间光波调制的相衬显微镜系统能按两种模式操作。在第一种模式(此后被称为“振幅模式”)中，获得傅立叶滤波并完成标定。在第二种模式(此后被称为“相位模式”)中，重建光波的波阵面并完成相位成像。
在各种不同的实施方案中，在“相位模式”中，没有在SLM前面的偏振片，而且光波对准SLM的快速轴。入射光波是被移相，例如，按照在SLM上编址的数值。
在“振幅模式”中，偏振片放在SLM的前面。SLM上的入射光波是被移相位(如同，例如，在“相位模式”中那样)，而且偏振是旋转的。当光波从SLM反射的时候，它通过偏振片返回，而且该信号被衰减。因此，在振幅方面有基于SLM相移的标定减少。
图57A和57B示意地举例说明在振幅模式1700和相位模式1750中在图像的象素上的光电效应，其中Ei1702、1752是入射波阵面的电场发射，s轴1704、1754是SLM的慢速轴，而f轴1706、1756是SLM的快速轴。
图58A-58C是SLM操作模式的各种不同实施方案的方框图1800、1850、1855。图58A举例说明用于相位成像的设置的正常操作模式而且描述SLM操作。RGB 1802是控制单元(例如，计算机)获得的灰度值，它控制SLM(RGB到是在标定中确定的)。RGB被转换成电压而且用来确定象素在SLM1804上的地址。该电压被加到，例如，SLM上的液晶上，把相位偏移给予入射光波1806。标定结果能在振幅模式中获得。图58B举例说明发生在标定中的转化。强度是作为灰度图像的函数使用探测器1852(例如，光电探测器)获得的。然后，作为灰度图像的函数的强度被作为灰度的函数1854转换成相位。图58C举例说明控制-相位模式而且举例说明在各种不同的实施方案中标定结果(灰度)是怎样变成SLM控制和SLM引起的实际相移之间关系的。从此，例如，人们能制订用于该仪器的标定查询表。然后作为灰度的函数的相位被用来产生灰度图像1856(例如，用于计算机上的显示器)并且与SLM所引起的相移1858相关联。
图59是对按振幅模式操作的仪器获得的标定曲线1900的例子。标定曲线1900是以弧度为单位的相移1902随以RGB数值为单位的灰度1904变化的曲线。所获得的合量曲线1906以标定查询表的格式展示SLM的计算机控制和SLM引起的实际相移之间的关系。图59能作为标定查询表。曲线1906中的分离点1908是相位的重叠。
实施例提供了一些依照本发明使用透射几何学的实施例和一些依照本发明使用反射几何学的实施例。出现在，例如，在图62-66B中的旋转展开记号法表明2π模糊度已被消除。
实施例1标定样品的相位成像在这个实施例中，标定好的样品已被研究并且举例说明本发明能以纳米(nm)刻度提供定量信息。样品由玻璃基体上的金属沉积物组成，然后被蚀刻。金属沉积物图案呈数字“8”的形状而且金属层的厚度是用显微光波干涉仪实测的大约140nm。
图60A-60D展示使用反射几何学的系统以四种不同的相移δ获得的图像。图60A是δ＝0的图像2000；图60B是δ＝π的图像2200；图60C是δ＝π/2的图像2400；而图60D是δ＝3π/2的图像2600。
图61示意地举例说明电场矢量E 2102和该电场的高频波矢量组份EH和该电场的低频波矢量组份EL之间的关系2100。如图61所示，Y轴2110和X轴2112代表CCD象素尺寸。相位是物体的“真实”相位。
图62是使用数据(例如，图60A-60D中举例说明的数据)和方程式55产生的标定样品2200的图像。在图62中，Y轴2202和X轴2204两者都以CCD上的象素为单位。图62右边的标尺2206代表以弧度为单位Δ。
图63是使用依照本发明的系统和方法标定的样品2300的相位图像。图63是使用方程式56和数据(例如，图62举例说明的数据)产生的。图63也能使用方程式55和56和数据(例如图60A-60D举例说明的数据)产生。Y轴2302和X轴2304都以在CCD象素为单位而垂直的标尺2306以nm为单位。
如图63所示，人们能看到沉积金属图案2310的高度已被正确地恢复，以举例说明本发明的系统和方法提供定量特征信息的能力。相位图像2300中存在的噪声主要是由用于记录的低质量(8位)照相机造成的。
实施例2相栅的相位成像图64展示使用透射几何学获得的有名义上10微米宽和名义上266nm深的沟槽的相栅的相位图像2400。在图64中，Z轴2402以nm为单位，Y轴2404和X轴2406以CCD象素为单位。垂直标尺2408也以nm为单位并且是为了进一步帮助依据相位图像2400确定深度(Z轴尺寸)而提供的。
实施例3洋葱细胞的相位图像在这个实施例中，洋葱细胞是依照本发明使用透射几何学相位成像的。洋葱细胞的强度图像2500被展示在图65中以便与在图66中展示的相位图像2550进行比较。在图65和图66中，y-轴2502、2552和x-轴2504、2554都以CCD象素为单位。图66中的标尺2556以nm为单位。
强度图像(图65)代表在低频组份和高频组份之间没有相位偏移δ＝0的情况下取得的第一帧。如比较图65和图66所示，常规显微镜(强度)图像相对于依照本发明获得的相位图像有非常低的反差。如同在图66中见到的那样，在相位图像中反差被大大提高，在这种情况下，精细得多的细胞结构能被区分开。除此之外，相位图像中的信息被定量到纳米水平的精度而且能根据电磁场通过该细胞的光程长度换算。这个类型的信息代表不仅与常规光学显微镜有关而且与传统的相衬和Nomarski显微镜有关的很大的改进。
本发明的优选实施方案包括使用相干分解把低相干性光学像场分解成两个能被可控制地相对于对方偏移相位的不同的空间组份以开发相位成像仪器。这种技术把典型的光学显微镜转变成以高准确性和λ/5500的灵敏度为特色的定量相衬显微镜。在活的生物细胞上获得的结果暗示依照本发明的优选实施方案的仪器对于定量地研究生物学结构和动力学有很大的潜力。
相衬和差动干涉对比(DIC)显微镜能够提供透明生物结构的高反差强度图像，无需样品准备。在光波相位中编码的结构信息通过干涉过程被重新获得。然而，尽管两种技术都揭示横断(x-y)平面中的样品结构，但是在纵轴(z)上提供的信息在很大程度上是定性的。
如同本文在前面描述的那样，移相干涉测量法已经在相位样品的定量度量衡学中使用相当长的时间，而且各种不同的干涉测量技术已经被提出。由于空气波动和机械振动自然地出现在任何干涉仪中的相位噪声使与光学领域相关联的相位的定量恢复变成实践中的具体挑战。优选的实施方案包括相关的波长以便克服这个障碍。
此外，已经为全场相位成像以耗时的数字计算为代价推荐以辐射照度迁移方程为基础的非干涉测量技术。和激光辐射一起使用空间光波调制以获得λ/30灵敏度的相位图像。自动移相的数字式记录干涉显微镜(DRIMAPS)是利用传统的干涉显微镜提供生物样品的相位图像的方法。虽然在DRIMAPS中没有采取预防最终限制任何相位测量技术的灵敏度的相位噪声的措施，但是这个仪器应用于细胞生物学的潜力已被证实。
本发明的优选实施方案包括作为用于生物学研究的新仪器的低相干性相衬显微镜(LCPM)。这种技术把传统的光学显微镜转变成以非常好的准确性和极低的噪声为特色的定量相衬显微镜。这项技术的原理依赖相干分解把与光学图像相关联的电磁场分解成它的空间平均的和在空间上变化的电磁场，这些电磁场能可控制地相对于对方移相。令E(x，y)是假定在整个空间域上静止的复数像场。这个场能被表示成E(x，y)＝E0+E1(x，y) (57)
其中E0是空间平均值，E1是E在空间变化的组份。因此，任何图像都能被视为平面波(平均电磁场)和空间上变化的电磁场之间的干涉现象的结果。人们应该注意到，作为中心正确定理的结果，E0和E1能在图像的每个点中被比作电磁场E的零-和高-空间频率组份。所以，这两个空间组份能通过完成傅立叶分解很容易被分开和被独立地进行相位调制。
实验组件是在图67中描绘的。倒装显微镜(Axioert35，ZeissC0.)用来使样品在图像平面IP成像。由超级发光二极管发出的低相干性电磁场(中心波长在范围800-850中，例如，λ0＝824nm、带宽Δλ＝21nm，或者作为替代λ0＝809nn、Δλ＝20nm)被用于透射法。为了保证照明电磁场的全空间相干性，光波被耦合到单模光纤之中而且随后用光纤准直仪准直。从图像显现出来的光线痕迹用点线和连续线分别表示对应于电磁场E0和E1的不偏斜光波和高空间频率组份。为了把像场分解成方程式57中描述的组份，傅立叶透镜FL(50cm焦距)被放在距图像平面IP焦距的地方。人们在图67中能看到，在IP处形成的显微镜图像似乎是用作为用于照明的光纤末端的显微镜图像的虚拟点光源(VPS)照明的。所以，为了在FL的后焦平面获得像场的精确的(相位和振幅)傅立叶变换，校正透镜CL被放置在平面IP处。CL的焦距是这样的，以致VSP在无限远处成像；因此，样品的新图像保持它的位置和放大倍数，而且它似乎是用平面波照明的。在FL的傅立叶平面中，零空间频率组份E0在光轴上聚焦，而高频组份E1是离轴分布的。为了控制E0和E1之间的相位延迟，可编程的相位调制器(PPM)(Hamamatsu Co.)被放在傅立叶平面之中。PPM由光学编址的二维液晶阵列组成，它由于双折射性质在其表面反射的光波的相位范围内提供精确控制。在PPM表面上最小的可设定地址的面积是20×20μm2或作为替代是26×26μm2，而相位控制的动态范围在一个波长或2π范围内是8位。该PPM能以空间分辨方式修正入射电磁场的相位(操作的相位模式)或振幅(振幅模式)，取决于偏振片P相对于液晶主轴的取向。被PPM反射的光波通过FL往回传播，并且在分光镜BS上反射之后被放在IP的共轭位置的CCD收集。因此，在缺乏PPM调制时，在IP处图像的精确的相位和振幅复制品被CCD记录。高空间频率组份的相位是按四个π/2增量连续地增加的，而且由此产生的辐照度分布能用CCD记录。PPM上的相位调制和CCD的采集速率是靠使用，例如，LabVIEW(美国国家仪器公司)的计算机PC同步的。使用标准的4-帧相移干涉测量法，E1和E0之间的相位差Δ能被测量。它能被展示作为重要数量与像场相关联的空间相位分布有如下的表达式。
φ(x,y)=tan-1[β(x,y)sin[Δφ(x,y)]1+β(x,y)cos[Δφ(x,y)]]---(58)]]>在方程式58中，因子β代表两个电磁场组份的振幅比，β(x，y)＝|E1(x，y)|/|E2|。参数β被测量，从而与π/2波平面(振幅模式)一样操作有选择地完成两个空间频率组份滤波的PPM。因此，使用方程式58，给定的透明样品的空间相位分布能被唯一地重新获得。傅立叶平面中同轴调制面积的最佳数值被发现是160×160μm2，而在同一平面与光学系统相关联的基于FWHM强度的衍射斑点有大约100μm的直径。由于方程式58的数字计算事实上是刻不容缓的，所以相位图像重新获得的速度只受PPM的刷新率限制，该刷新率在一个实施方案中是8Hz。然而，总的技术速度能通过使用诸如铁电液晶之类其它的空间调制器被潜在地增加。
为了证明它实现定量相位成像的潜力，LCPM技术被应用于研究各种不同的标准样品。图68A和68B展示从聚苯乙烯微球成像获得的这种测量结果的实例。粒子直径是由制造商(DukeScientific)提供的3±0.045μm。为了更好地模拟透明的生物样品，球体浸没在100％丙三醇中然后被夹在两个盖玻片之间。在粒子和周围介质之间实现的折射指数差是Δn＝0.12。在没有PPM上的调制的情况下，获得图68A展示的典型的透射强度图像。人们能看到这幅图像的反差由于样品的透明度非常不令人满意。图68B展示用上述的程序大纲获得的LCPM图像。在这里，所获得的反差实质上是比较高的，而第三维(Z轴)提供关于样品厚度的定量信息。使用通过图68B展示的球体中心的轮廓描绘，从对应的直径获得的数值是2.97±7.7％，这与制造商指出的数值很好地一致。现有的误差可能是光束质量不完美和溶液中存在的潜在杂质造成的。
LCPM工具被进一步用来形成活生物细胞的相位图像。图69A展示HeLa癌细胞有丝分裂最后阶段的定量相位图像。人们应该注意到，细胞被培养介质包围着，在成像之前生活在典型的培养条件下没有任何附加的准备。先前已指出经过生物细胞传播的电磁场累积的相位延迟与细胞的非水质量成比例。因此，定量的相位图像应该在诸如有丝分裂、细胞生长和死亡之类各种不同的细胞生理学阶段的细胞运动学自动分析方面找到重要的应用。
全血涂片的相位图像被展示在图69B中。样品是通过简单地把一小滴健康志愿者的新鲜全血夹在两个盖玻片之间制备的。人们能看到红血球(RBC)众所周知的扁圆形状被恢复。考虑血色素相对于血浆的折射指数的简单分析很容易提供关于细胞体积的定量信息。RBC分析中的这种细节水平当前仅仅适用于电子和原子力显微镜。非侵入的光学技术有可能提供病理快速筛选程序，因为众所周知的是RBC形状往往是细胞健康的好指标。除此之外，这项依照本发明优选实施方案的技术能监测的RBC细胞膜和周围蛋白质的复杂动态性质，是血液凝结的原因。
为了评估仪器对抗相位噪声的稳定性并最终定量描述它的灵敏度，使只装了培养介质(没有细胞)的细胞容器在100分钟的时间周期里按15秒的间隔成像。图69C展示与包含在视场中的某点相关联的瞬时相位起伏的实例。相位数值是在0.6×0.6μm2的面积上的平均值，它代表显微镜的横向分辨率极限。这些起伏的标准偏差有0.15nm的数值，等价于λ/5500。结果证明LCPM仪器的非凡的灵敏度。表征仪器特色的极低的噪声能用两个相干的电磁场在空间上彼此重叠并且受类似的在干涉项中最终被抵消的相位噪声影响的光程中传播这一事实解释。与激光辐射相反，低相干性电磁场的使用有利于该方法的灵敏度，因为在各种不同的组份上的多重反射可能形成的条纹被消除。
因此，本发明的优选实施方案包括以高准确性和λ/5500水平的灵敏度为特征的低相干性相衬显微镜。关于活的癌细胞和红血球的初步结果暗示所述的装置和方法有潜力变成用于生物学系统的结构和动力学研究的有价值的工具。通过把传统的光学显微镜并入该系统组件，依照本发明的优选实施方案的仪器以高度的多功能性和特别容易使用为特征。
权利要求不应该被错误地当作局限于所描述的次序或元素，除非对那种效果另有说明。所以，所有出现在权利要求书及其等价文件的范围和精神范围内的实施方案都在本发明的权利要求范围内。
权利要求
1.一种用来测量经过一部分媒介物的光波的相位的方法，该方法包括下述步骤提供光波的第一波长；沿着第一光程和第二光程引导第一波长的光波，第一光程延伸到要测量的媒介物上，而和第二路径在路径长度方面经历改变；以及探测来自媒介物的光波和来自第二光程的光波，以便测量通过媒介物上两个分开的点的光波的相位改变。
2.根据权利要求1的方法，其中所述媒介物包含生物组织的样品。
3.根据权利要求1的方法，进一步包括至少提供光电二极管阵列和与光电二极管耦合的纤维束之一以使样品的相位在众多位置同时成像。
4.根据权利要求1的方法，进一步包括频移第二光程中的光波的步骤。
5.根据权利要求1的方法，进一步包括借助至少两个光电探测器探测相位变化的步骤。
6.根据权利要求1的方法，进一步包括提供发射第一波长的氦氖激光光源。
7.根据权利要求1的方法，进一步包括提供低相干光源。
8.根据权利要求1的方法，进一步包括提供在基准平面和样品之间的第一间隙和在第二基准平面和第三基准平面之间的第二间隙。
9.根据权利要求8的方法，进一步包括经历位移的第一反射表面和与低相干性来源光学耦合的第二反射表面。
10.根据权利要求1的方法，进一步包括使用偏振区分样品间隙信号和基准间隙信号的步骤。
11.根据权利要求1的方法，进一步包括把样品放在第一反射表面和第二反射表面之间。
12.一种双光束测量系统，其中包括光源；把来自光源的光波分成在第一光程上的第一组份和在第二光程上的第二组份的分光镜；改变第一光程长度的第一活动反射表面；改变第二光程长度的第二活动反射表面；把来自第一光程和第二光程的光波引向要测量的媒介物的合成器。
13.根据权利要求12的系统，其中所述合成器包括偏振光束分光镜。
14.根据权利要求12的系统，其中所述合成器把来自第一光程和第二光程的光波引向有通过间隙与第二反射表面分开的第一反射表面的基准面。
15.根据权利要求12的系统，其中要测量的媒介物包括放在第一反射表面和第二反射表面之间的组织。
16.根据权利要求15的系统，其中所述的组织包含神经组织。
17.根据权利要求12的系统，进一步包括使来自第一光程的光波聚焦在媒介物的第一侧面上而且使来自第二光程的光波聚焦在在媒介物的第二侧面上的透镜系统。
18.根据权利要求1的系统，进一步包括把光波引向第一偏振探测器和第二偏振探测器的第二合成器。
19.根据权利要求1的系统，其中来自第一路径的光波被引向有第一偏振组份的媒介物和有第二偏振组份的基准面。
20.根据权利要求19的系统，其中来自第二路径的光波被引向有与来自第一路径的光波正交的偏振作用的媒介物。
21.根据权利要求20的系统，其中从第二路径引向基准面的光波与从第一路径引向基准面的光波正交。
22.根据权利要求15的系统，其中所述组织包括癌组织。
23.根据权利要求12的系统，其中所述光源包括低相干光源。
24.根据权利要求12的系统，进一步包括光纤耦合器。
25.一种用来测量通过一部分样品的光波的相位特性的方法，该方法包括下述步骤提供分别由第一光源和第二光源产生的第一信号和第二信号，第二光源是低相干光源；沿着第一光程和第二光程引导第一信号和第二信号；改变第一光程和第二光程之间的路径长度差；产生指示第一和第二信号与它们之间的光程延迟之和的输出信号；在干涉仪锁定调制频率下调制输出信号；以及借助干涉仪锁定相位的时间变化确定与样品相互作用的光波的相位。
26.根据权利要求25的方法，其中第一信号和第二信号是低相干性信号。
27.根据权利要求25的方法，进一步包括通过使用混频器或锁定放大器之一解调第一信号。
28.根据权利要求25的方法，进一步包括用电子学方法产生干涉仪锁定相位。
29.一种用来测量通过一部分样品的光波的相位的系统，其中包括产生第一信号的第一光源；干涉仪，干涉仪产生第二信号，第二信号具有由于时间延迟与第一信号分开的两个脉冲的；来自干涉仪与样品联系的第一光程，和来自干涉仪与基准面联系的第二光程；以及探测器系统，该探测器系统测量分别来自样品和基准面的第一和第二信号和从样品和基准面反射的光波之间的干涉的第一外差信号；并且探测指示样品反射相对于基准反射的相位的外差信号的相位。
30.根据权利要求29的系统，其中第一信号是低相干性信号。
31.根据权利要求29的系统，其中第一光源是超级发光二极管和多模激光二极管之一。
32.根据权利要求29的系统，其中干涉仪进一步包括第一路径和第二路径，第二路径有声光调制器。
33.根据权利要求29的系统，进一步包括包含光学纤维的光路。
34.根据权利要求29的系统，进一步包括有至少5nm带宽的低相干性信号。
35.根据权利要求29的系统，其中所述系统包括隔震的外差式Michelson干涉仪。
36.根据权利要求29的系统，其中所述的干涉仪进一步包括附着到平移台上的可控制地调节光程长度差的反射镜。
37.根据权利要求29的系统，其中所述的探测器系统包括探测来自样品的反射信号的第一探测器和探测来自基准面的反射信号的第二探测器。
38.一种用来使样品成像的方法，该方法包括下述步骤照明样品，源于样品上的点的光波有低频空间组份和高频空间组份；沿着共向光程使高频率空间组份与低频空间组份相干以产生第一强度信号；移动低频空间组份的相位以产生第一相移低频率空间组份；沿着共向光程使高频空间组份与第一相移低频率空间组份相干以产生第二强度信号；移动低频空间组份的相位以产生第二相移低频空间组份；沿着共向光程使高频空间组份与第二相移低频空间组份相干以产生第三强度信号；移动低频空间组份的相位以产生第三相移低频空间组份；沿着共向光程使高频空间组份与第三相移低频空间组份相干以产生第四强度信号；至少部份地以第一强度信号、第二强度信号、第三强度信号和第四强度信号为基础产生样品上的点的相位图像。
39.根据权利要求38的方法，进一步包括如下步骤通过对样品上众多的点重复权利要求1的步骤，从而产生样品的相位图像。
40.根据权利要求38的方法，其中所述的照明步骤包括使用透射照明来照明样品。
41.根据权利要求38的方法，其中所述的照明步骤包括使用反射照明来照明样品。
42.根据权利要求38的方法，其中所述的照明步骤包括用透射和反射照明两者照明样品。
43.根据权利要求38的方法，其中所述的照明步骤包括用超级发光光源照明样品。
44.根据权利要求38的方法，进一步包括控制至少一个高频空间组份的振幅的步骤。
45.根据权利要求38的方法，进一步包括控制至少一个低频空间组份和相移低频空间组份的振幅的步骤。
46.根据权利要求38的方法，其中每个移相步骤都把相位变化低频空间组份的相位充分地偏移π/2。
47.根据权利要求38的方法，其中产生相位图像的步骤至少部份地以下面的等式为基础 其中 而Iimage(x，y；δ)是在样品表面上通过高频空间组份与相移δ的低频空间组份的相干产生的点(x，y)的强度信号，β＝I1/I0代表与高频空间组份相关联的强度I1和与低频空间组份相关联的强度I0之比。
48.根据权利要求39的方法，其中所述的产生样品相位图像的步骤包括产生相位灵敏度大于大约λ/1000的样品相位图像。
49.根据权利要求39的方法，其中所述样品包括生物组织。
50.根据权利要求40的方法，其中所述样品包括半导体晶片。
51.一种非接触式光学测量有反射表面的样品的方法，该方法包括下述步骤提供产生第一信号的第一光源；使用双光束干涉仪产生第二信号，第二信号具有借助时间延迟与第一信号分开两个脉冲；提供从干涉仪与样品联系的第一光程和从干涉仪与基准面联系的第二光程；以及测量分别来自样品和基准面的第一和第二信号的第一外差信号，和来自样品和基准面的反射光波之间的干涉；和探测指示样品反射相对于基准面反射的相位的外差信号的相位。
52.根据权利要求51的方法，其中所述的第一信号是低相干性信号。
53.根据权利要求51的方法，其中所述的第一光源是超级发光二极管和多模激光二极管之一。
54.根据权利要求51的方法，其中所述干涉仪进一步包括第一路径和第二路径，第二路径有声光调制器。
55.根据权利要求51的方法，进一步包括包含光纤的光路。
56.根据权利要求51的方法，其中所述样品是一部分神经细胞。
57.根据权利要求51的方法，其中所述干涉仪包括隔震的外差式Michelson干涉仪。
58.根据权利要求51的方法，其中所述干涉仪进一步包括附着到平移台上可控制地调节光程长度差的反射镜。
59.根据权利要求51的方法，其中所述的测定步骤包括有探测从样品反射的信号的第一探测器和探测从基准面反射的信号的第二探测器的探测器系统。
60.根据权利要求51的方法，其中所述样品包括生物组织。
61.根据权利要求51的方法，进一步包括提供探测样品机械变化的显微镜。
62.根据权利要求61的方法，其中所述样品包括至少单神经元和单层细胞之一。
63.根据权利要求61的方法，其中所述的显微镜包括双焦点显微镜。
64.一种用来使样品光学成像的光纤探头，其中包括有近端、远端和基准光学表面的外壳；在外壳近端与光源耦合的光纤；以及在外壳远端的折射率渐变透镜，以致所述探头的数值孔径提供来自样品的散射表面的有效的光波聚集。
65.根据权利要求64的探头，进一步包括把光纤探头安装在平移式载物台上至少完成二维相位成像和三维共焦相位成像之一的系统。
66.根据权利要求65的探头，其中所述平移式载物台包括扫描压电转换器。
67.根据权利要求64的探头，其中所述探头的数值孔径在大约0.4到0.5的范围内。
68.根据权利要求64的探头，其中所述探头在活体内使生物组织成像。
69.根据权利要求64的探头，其中所述的基准表面是光纤上的表面。
70.根据权利要求64的探头，其中所述的基准表面在折射率渐变透镜上。
71.一种非接触式光学测量眼睛的方法，该方法包括下述步骤提供产生第一信号和第二信号的光源；提供来自与眼睛联系的干涉仪的第一光程和来自与基准面联系的干涉仪的第二光程；以及响应第一信号和第二信号用分别从眼睛和基准面返回的光波测量第一外差信号；以及确定指示从眼睛返回的光波相对于从基准面返回的光波的相位的第一外差信号的相位。
72.根据权利要求71的方法，其中所述的第一信号是低相干性信号。
73.根据权利要求71的方法，其中所述的光源是超级发光二极管和多模激光二极管之一。
74.根据权利要求71的方法，其中所述的干涉仪进一步包括第一路径和第二路径，第二路径有声光调制器。
75.根据权利要求71的方法，进一步包括包含光学纤维的光路。
76.一种用来使材料成像的光波调制系统，其中包括光源；透镜系统；空间光波调制器；探测与材料相互作用的光波的相位变化的探测器。
77.根据权利要求76的系统，其中所述探测器形成组织的诊断图像。
78.根据权利要求76的系统，其中所述透镜系统包括傅立叶透镜。
79.根据权利要求76的系统，进一步包括与空间光波调制器和探测器连接的处理器。
80.根据权利要求76的系统，进一步包括与所述系统光学耦合的低相干光源。
81.根据权利要求76的系统，进一步包括与所述系统光学耦合的激光器。
82.一种用来测量神经元活动的系统，其中包括光源；使来自光源的光波与有神经纤维的组织耦合的光学系统；以及收集来自神经纤维的光波的探测器。
83.根据权利要求82的系统，其中所述系统包括测量与组织相互作用的光波的相位变化的干涉仪。
84.根据权利要求82的系统，进一步包括基准面以及第一和第二偏振探测器。
85.根据权利要求82的系统，其中所述光源包括低相干光源。
全文摘要
本发明的优选实施方案主要涉及相位测量系统，所述系统通过若干策略的组合处理相位噪声问题，上述策略包括但不限于共向光程干涉测量法、定相位基准、主动稳定和差动测量。实施方案涉及用光使小生物体成像的光学装置。这些实施方案能适用于例如细胞生理学和神经科学领域。这些优选实施方案以相位测量和成像技术的原理为基础。使用相位测量和成像技术的科学动机起源于，举例来说，亚微米水平的细胞生物学，它能不受限制地包括发育异常、细胞通讯、神经元传输和遗传密码执行的成像源。亚细胞组份的结构和动态仍然不能在它们的自然状态使用现有的方法和技术(举例来说，包括X射线和中子散射)来进行普遍研究。反之，有纳米分辨率的以光波为基础的技术允许在其自然状态下研究细胞结构。因此，本发明的优选实施方案包括以干涉测量法和/或相位测量的原理为基础的系统并且被用来研究细胞生理学。所述系统包括使用光学干涉仪测量相位的低相干性干涉测量法(LCI)原理，或其中使用细胞组分之内的干涉的光波散射光谱学(LSS)的原理，或在替代方案中，LCI和LSS的原理能结合起来获得本发明的系统。
文档编号G01N21/41GK1826518SQ200480020838
公开日2006年8月30日 申请日期2004年6月18日 优先权日2003年6月19日
发明者克里斯托弗·M·方严, 加布里埃尔·波普斯克, 杨昌辉, 亚当·P·沃克斯, 拉曼查德·R·戴萨瑞, 迈克尔·S·费尔德 申请人:麻省理工学院