专利名称：一种测定机体蛋白质合成率的方法
技术领域：
本发明涉及一种测定机体蛋白质合成率的方法，特别是涉及采用简化施加示踪氨基酸的方式来测定机体蛋白质合成率的方法。
背景技术：
在蛋白质代谢测定中凯氏定氮法得到了广泛应用，尤其在外科营养支持中取得较好效果，亦有采用放射性同位素法，前者精度不高，后者由于性质不稳定，衰变时所发射出的辐射对人体有害，二种方法都有一定的局限。
营养物质代谢中蛋白质代谢测定非常重要，因此迫切需要建立一种安全而有效的测定方法。稳定性同位素物理性质稳定，不具放射性，对机体无害，质谱仪定量精确，使得稳定性同位素的应用在国外日趋广泛。
目前常用的稳定性同位素蛋白质合成率测定法有二种，即“持续灌注法”(constantinfusion method简称持续法)和“冲击法”(flooding method)。前者又分为非首剂量及首剂量持续灌注法(prime dose constant infusion method)。
持续灌注法就是将一定量稳定同位素标记的氨基酸作为示踪剂(tracer)，通过静脉置管持续滴注，用量为能将示踪剂浓度维持在血浆中的该种氨基酸的5-10％即可，若事先施加首剂量则为首剂量持续灌注法，否则为非首剂量持续灌注法，持续时间就动物而言为6小时，人体4-20小时，多采用6小时。
冲击法即一次性注射大剂量示踪氨基酸，其中包括稳定性同位素标记氨基酸(tracer)及非标记同种氨基酸(tracee)，其用量一般是血浆游离氨基酸池中该氨基酸含量的数倍或更多，使得在短时间内各种游离氨基酸池中的该种氨基酸浓度趋于一致。测量时限为给药后，动物10分钟，人体1-2小时。
理论上讲，蛋白质合成率是可以通过某种标记氨基酸的蛋白质掺入率来实现，上述二种方法均可以进行这样的测定，并且都得到广泛的应用。二者各有优劣，其区别主要有以下几方面1.采用何种方式施加示踪氨基酸；2.所用示踪氨基酸的量；3.所需选择测量的前体；4.测量时间的设定。
持续法所需的标记氨基酸量很小，因此对整个机体及组织的蛋白质代谢影响很小或基本无影响，其要求是测量时限内前体池中的标记氨基酸处于上升时期的稳定状态，并且在其合成的蛋白质出现降解之前，据此要求，对于一些半寿期较长的蛋白质，此时限是可以控制的，而一些半寿期较短的蛋白质就很难把握了，此时持续法就出现了不足，并且其测量时间较长，比冲击法明显延长，很显然在时限的选择上，持续法与冲击法相比，存在不足。在选择测定前体方面，持续法远较冲击法复杂得多。
持续法前体选择如图1所示进入血液中的示踪氨基酸，需经过细胞膜转运载体运输到细胞内，经过氨酰tRNA合成酶催化，形成氨酰tRNA，然后才能合成蛋白质。很显然，采取血浆作为前体是不合适的，因为事实上细胞内外的氨基酸浓度是有差异的，与细胞膜转运载体有关，进入细胞内的氨基酸并非都用于蛋白质合成，比如有一部分氨基酸用于氧化供能，同时也有一少部分蛋白质降解的氨基酸参与了蛋白质合成，因此只有氨酰tRNA才是蛋白质合成的真正前体，已有方法可以测出氨酰tRNA中的示踪氨基酸丰度。实际操作中，氨酰tRNA中的示踪氨基酸丰度是很难测定的，一是因为氨酰tRNA半寿期很短暂，不稳定，离体后很快失活，再者是由于氨酰tRNA组织中含量很低，取材所需较大。因此寻找替代物就成了许多学者追求的目标，并取得了一些成果。例如在应用亮氨酸作为示踪剂时，经持续灌注后，α-KIC(α酮异己酸)可以替代氨酰tRNA。因为α-KIC只能由细胞内的亮氨酸通过转氨基产生并分泌到血浆中，亮氨酸是α-KIC唯一来源，故血浆α-KIC能反映细胞内亮氨酸水平，许多研究证明α-KIC的丰度比细胞内游离氨基酸更接近于氨酰tRNA的丰度。骨骼肌中富含支链氨基酸，所以α-KIC多被用于测定骨骼肌蛋白质合成。同样VLDL(极低密度脂蛋白)中的载脂蛋白B100，只能由肝脏合成几分泌，常用于测定肝脏蛋白质的合成。
通过以上分析，不难看出，持续法的优点是使用的示踪氨基酸量少，同时可测定整个机体蛋白质转换。不足之处是持续时间长，需维持代谢稳定状态，同时直接前体氨酰tRNA的丰度不易直接测量。
冲击法使用时，大剂量示踪氨基酸被一次性注入机体，短时即可充满机体的各种游离氨基酸池，包括血浆、细胞内及前体池，它们的示踪氨基酸浓度趋于一致，因此可测定血浆丰度来替代前体池，从而简化了前体池丰度的测定，缩短了实验时间，并且使得短时间重复测量成为可能。该法自发现以来得到了广泛应用。当然该法亦有不足，大量氨基酸进入体内，势必对机体蛋白质代谢产生影响，可能促进蛋白质的合成或降解。测量时间短也可能存在不足，有研究提示大剂量灌注氨基酸后半小时，血浆氨基酸呈现快速升高，以上二种因素都可影响测量结果。
对同一组织而言，二种方法所测结果存在差异，冲击法所测得的FSR(分数合成率)往往比持续法高，其间的可能原因有1.在前体选择方面，持续法的直接前体很难测量，大多选择替代物，但二者之间并不完全一致，误差由此产生。冲击法设计细胞内外及氨酰tRNA中示踪氨基酸浓度一致，事实上并没有测出三者之间的确切关系，有学者证实冲击法实验结束前细胞内示踪氨基酸浓度比血浆低，比如在肝脏，肠道可低20％左右，如应用血浆丰度计算，误差在所难免。2.冲击法测量较短，没有消除时间间隔。持续法测量时间较长，半寿期比较短的蛋白质在测量期间已出现降解，计算时未予考虑，同样可出现误差。3.冲击法实施时，大量氨基酸进入体内引起蛋白质出现代谢变化，如上文述及的亮氨酸促进蛋白质合成，其可能机理是(1)增加氨酰tRNA的稳定性，即使示踪氨基酸浓度不变，仍能促使示踪氨基酸掺入蛋白质增加。(2)刺激胰岛素分泌，继发诱导蛋白质合成。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、高效、准确度高的测定机体蛋白质合成率的方法。
本发明的技术方案是根据冲击法与持续法的优缺点，通过分析施加示踪氨基酸的方式、所用示踪氨基酸的量、所需选择测量的前体以及测量时间的设定，结合两种测量方法的优点，设计出施加示踪氨基酸方式采取冲击法方式一次性大剂量静脉注射的简化施加稳定性同位素标记的示踪氨基酸方式(不同的是无须添加非标记示踪氨基酸，直接采用大鼠骨骼肌游离氨基酸15N丰度而非血浆中的游离氨基酸L-15N丰度)，时间选择方面结合持续法的特点，测量时间设定为20-60分钟，这样可以兼顾两种方法的优点。
本发明的目的是通过下列措施实现的一种测定机体蛋白质合成率的方法，它采用一次性注射适当剂量的用稳定性同位素标记的示踪氨基酸，20-60分钟后分别测定机体骨骼肌游离及结合的示踪氨基酸中稳定性同位素的丰度，根据下列公式(该公式是本领域技术人员公知的)计算出FSR(分数合成率)。
FSR=EB(t)-EB(0)∫0tEF(t)dt]]>
FSR分数合成率(Fractional synthesis rate)单位时间内某种氨基酸掺入的比率，FSR的高低即表示蛋白质合成的速度，常用％.h-1或％.day-1单位表示。其中EB(0)、EB(t)为实验起始及实验过程中t时间的结合氨基酸(所测蛋白质)中稳定性同位素的丰度，EF系前体池氨基酸中稳定性同位素的丰度，即代表游离的示踪氨基酸中稳定性同位素的丰度。
所述的测定机体蛋白质合成率的方法，其中所用的示踪氨基酸为L型氨基酸。
所述的测定机体蛋白质合成率的方法，其中所用的L型示踪氨基酸为赖氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸。
所述的测定机体蛋白质合成率的方法，其中所用的L型示踪氨基酸为亮氨酸。
所述的测定机体蛋白质合成率的方法，其中稳定性同位素采用13C或15N。
所述的测定机体蛋白质合成率的方法，其中测量最佳时限为30分钟。
所述的测定机体蛋白质合成率的方法，其中一次性注射示踪氨基酸的剂量为0.5-1.5mmol/Kg。
所述的测定机体蛋白质合成率的方法，其中一次性注射示踪氨基酸的剂量为1.0mmol/Kg。
所述的测定机体蛋白质合成率的方法，其中一次性注射示踪氨基酸静脉的方式采用静脉注射。
本发明的有益效果蛋白质代谢测定传统的方法比较(1)凯氏定氮法取材量大(以克为单位)，精度差(仅精确至0.1g)。
(2)放射性同位素法精度高，但对机体有害(无论是受试者还是测试者都同样可能有害)，需要有防护设备，标本须特殊处理，否则对环境造成污染。
(3)稳定性同位素法安全，稳定性同位素机体本身存在，标本最低0.5mg即可测出，可精确到千分之五(0.005)，无污染。
本发明建立了一种对机体无害、快速、敏感、简便易行的结合了稳定性同位素法中持续灌注法和冲击法优点的测定蛋白质合成率的方法。
图1为示踪氨基酸在细胞内外代谢示意图。
图2为不同时项大鼠骨骼肌游离氨基酸15N丰度。
图3为不同时项大鼠骨骼肌结合氨基酸15N丰度。
图4为不同剂量组大鼠骨骼肌游离氨基酸15N丰度。
图5为不同剂量组大鼠骨骼肌结合氨基酸15N丰度。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1一次性静脉注射[L-15N]亮氨酸1.0mmol/Kg，30分钟后分别测定大鼠骨骼肌游离及结合的示踪氨基酸15N的丰度，根据公式计算出分数合成率。
具体步骤(1)一次性静脉注射[L-15N]亮氨酸1.0mmol/Kg；(2)30分钟后取材，经过标本处理制备质谱测定样本(处理方法及测定方法均为本领域普通技术人员公知方法)；(3)测定骨骼肌游离及结合的示踪氨基酸15N的丰度EB(0.5)和EF(0.5)(0.5指0.5小时即30分钟)测得EB(0.5)＝0.382，EB(0)＝0.364，EF(0.5)＝0.622，EF(0)＝0.364，而EB(0)＝EF(0)＝0.364(自然丰度)；(4)计算EB(t)-EB(0)＝EB(0.5)-EB(0)∫0tEF(t)=[(EF(0.5)+EF(0))/2]*(0.5/24)]]>EB(t)-EB(0)＝EB(0.5)-EB(0)＝0.382-0.364＝0.018∫0tEF(t)dt=[(EF(0.5)+EF(0))/2]*(0.5/24)=[(0.622+0.364)÷2]×0.02083=0.01027]]>根据公式FSR=EB(t)-EB(0)∫0tEF(t)dt]]>FSR＝0.018÷0.01027＝1.7527(％.day-1)实施例2 参数选择1)时相选择通过较小剂量静脉注射施加示踪氨基酸，继而追踪不同时相大鼠骨骼肌游离及结合氨基酸15N丰度(结果见图2、3)。图2显示，不同时相大鼠骨骼肌游离氨基酸15N丰度在0-30分钟15N丰度几呈直线上升，半小时骨骼肌游离氨基酸15N丰度达峰值0.482atoms％，轻度下降后1-4小时得以维持，随后逐渐下降，至12小时降为0.369atoms％，接近自然丰度0.364atoms％。图3显示，不同时相大鼠骨骼肌结合氨基酸15N丰度在0-30分钟15N丰度亦呈直线上升，半小时骨骼肌结合氨基酸15N丰度达峰值0.373atoms％，随后逐渐下降，半小时至12小时15N丰度下降并不明显，12小时降为0.369atoms％，仍高于自然丰度0.364atoms％。
结果表明，根据丰度变化趋势，不论游离还是结合氨基酸15N丰度，其峰值时间均为30分钟，因此测量时间设定首选30分钟。
2)剂量选择不同剂量相同时相施加[L-15N]亮氨酸大鼠骨骼肌15N丰度不同剂量组大鼠骨骼肌游离氨基酸15N丰度，随着一次性注射[L-15N]亮氨酸剂量的增加，游离氨基酸15N丰度增加明显(结果见图4)。不同剂量组大鼠骨骼肌结合氨基酸15N丰度同样随着一次性注射[L-15N]亮氨酸剂量的增加，结合氨基酸15N丰度亦增加，但不如游离氨基酸15N丰度增加明显(结果见图5)。
不同剂量组大鼠骨骼肌游离氨基酸15N丰度，随着一次性注射剂量的增加而增加，结合氨基酸15N丰度亦随着注射剂量增加，但不如游离氨基酸15N丰度增加明显。
不同剂量相同时相施加[L-15N]亮氨酸后大鼠骨骼肌蛋白质合成率随着一次性注射[L-15N]亮氨酸剂量的增加，FSR(蛋白质分数合成率)亦增加，注射[L-15N]亮氨酸1.0mmol/Kg与0.5mmol/Kg，0.5mmol/Kg与0.25mmol/Kg组间均有显著差异，但1.0mmol/Kg与2.0mmol/Kg二组无显著差异(结果见表1)。
结果表明，剂量在1.0mmol/Kg以上，FSR并不随施加[L-15N]Leucine剂量的加大而显著增加，因此在测定大鼠骨骼肌蛋白质合成率时，1.0mmol/Kg的剂量为首选。
表1不同剂量大鼠骨骼肌蛋白质合成率
注0.25组与0.5组比较#p＜0.01；0.5组与1.0组*p＜0.01；1.0组与2.0组△p＞0.053)前体选择不同剂量组血浆与骨骼肌游离氨基酸15N丰度的比较注射[L-15N]亮氨酸1.0mmol/Kg及2.0mmol/Kg两组中骨骼肌游离氨基酸15N丰度均显著高于同组血浆中游离氨基酸15N丰度(结果见表2)。
表2不同剂量大鼠血浆与骨骼肌游离氨基酸15N丰度的比较
注与肌肉比较，*p＜0.01实验测定的血浆游离氨基酸15N丰度与骨骼肌游离氨基酸15N丰度差异显著，很显然选择血浆中游离氨基酸丰度为前体是不合适的。当然直接前体应是氨酰tRNA，但后者丰度不易直接测量，故而可直接采用大鼠骨骼肌游离氨基酸15N丰度。
4)示踪氨基酸选择常用示踪氨基酸均系L型氨基酸，最常用的为亮氨酸(13C或15N标记)，其次赖氨酸，甘氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸皆有一定应用。亮氨酸是必需氨基酸，骨骼肌蛋白质合成时亮氨酸需要量大，且15N标记亮氨酸技术比较成熟，故选择亮氨酸作为示踪氨基酸。
权利要求
1.一种测定机体蛋白质合成率的方法，其特征在于它采用一次性注射适当剂量的用稳定性同位素标记的示踪氨基酸，20-60分钟后分别测定机体骨骼肌游离及结合的示踪氨基酸中稳定性同位素的丰度，计算出蛋白质分数合成率即可。
2.根据权利要求1所述的测定机体蛋白质合成率的方法，其特征在于所用的示踪氨基酸为L型氨基酸。
3.根据权利要求2所述的测定机体蛋白质合成率的方法，其特征在于所用的L型示踪氨基酸为赖氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸。
4.根据权利要求3所述的测定机体蛋白质合成率的方法，其特征在于所用的L型示踪氨基酸为亮氨酸。
5.根据权利要求1所述的测定机体蛋白质合成率的方法，其特征在于稳定性同位素采用13C或15N。
6.根据权利要求1所述的测定机体蛋白质合成率的方法，其特征在于测量最佳时限为30分钟。
7.根据权利要求1所述的测定机体蛋白质合成率的方法，其特征在于一次性注射示踪氨基酸的剂量为0.5-1.5mmol/Kg。
8.根据权利要求7所述的测定机体蛋白质合成率的方法，其特征在于一次性注射示踪氨基酸的剂量为1.0mmol/Kg。
9.根据权利要求1所述的测定机体蛋白质合成率的方法，其特征在于一次性注射示踪氨基酸静脉的方式采用静脉注射。
全文摘要
本发明公开了一种测定机体蛋白质合成率的方法。该方法采用一次性注射适当剂量的稳定性同位素标记的示踪氨基酸，20－60分钟后分别测定机体骨骼肌游离及结合的示踪氨基酸中稳定性同位素的丰度，计算出分数合成率即可。该方法简单易行、快速、高效、精确度高。
文档编号G01N33/00GK1723841SQ20051004112
公开日2006年1月25日 申请日期2005年7月21日 优先权日2005年7月21日
发明者李幼生, 周济宏, 曹澄亚, 朱明芳, 韩勇, 黎介寿 申请人:中国人民解放军南京军区南京总医院