专利名称：波长转换双分子信标的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物制品的研制及肿瘤的早期诊断试剂，特别涉及一种波长转换双分子信标。
背景技术：
根据荧光共振能量转移现象(FRET)设计的分子信标(Molecule Beacon，MBs)是一种敏感性很强、特异性很高、操作极为简单方便的新的分子生物学方法(Mitchell，P.Turning the spotlight on cellular imaging.Nat.Biotechmol.，2001，19，1013-1017.)。近年来分子信标研究得到了迅速发展，并已广泛应用于实时监测聚合酶链反应、基因突变的快速分析、DNA/RNA的检测、DNA/RNA杂交的动力学研究，以及DNA/蛋白相互作用研究等，其应用领域仍在不断拓展(Tyagi S，Bratu DP，Kramer FR.Multicolormolecular beacons for allele discrimination.Nat Biotechnol 1998，1649-53.)。该方法通过设计一段与特定核酸互补的寡聚核苷酸探针，使其空间结构呈柄环状。其中环序列是与靶核酸互补的探针，柄的一端连接一个荧光分子，另一端连接荧光淬灭分子。当靶序列不存在或不能完全互补时，分子信标仍呈柄环结构，柄部的荧光分子与淬灭分子非常接近(7～10nm)，荧光分子发出的荧光被淬灭分子吸收并以热的形式散发，此时检测不到荧光信号；当有靶序列存在时，分子信标的环序列与靶序列特异性结合，形成稳定的双链体，荧光分子因此与淬灭分子分开，荧光分子发出的荧光不能被淬灭分子吸收，从而可以检测到荧光。
为保证分子信标的高敏感性，可研究设计使用双分子信标来降低假阳性率。其中一个分子信标的荧光分子称供体荧光(信标供体)，另一个分子信标的荧光分子称受体荧光(信标受体)。设计这一对分子信标与靶分子mRNA序列的相邻区互补，使两个分子信标的荧光分子位于荧光共振能量传递作用区(4～6nm)。当刺激供体荧光时，两个荧光基团间发生荧光共振能量传递作用，这时可以检测到受体荧光的特异性荧光光谱。由于双分子信标检测阳性必须是两个分子信标都与靶分子完全杂和互补，受体荧光发射的荧光才能被检测到，这就降低了因为单分子信标进入活细胞被核酸酶降解或被与核酸结合的蛋白打开环柄结构时出现假阳性的发生率(Tyagi.S，Salvatore A.E.Marras and Kramer FR.Wavelength-shifting molecularbeacons.Nat Biotechnol 2000，181191-1196.)。为了保证两个分子信标的受体和供体荧光分子间的距离固定，分子信标连接荧光分子的柄结构也必须参与同靶分子杂和，从而保证两个分子信标在完全互补杂和后它们之间的距离保持恒定。
有研究用波长转换分子信标来解决同时检测多个分子信标时需要多个激发光源问题(Tyagi.S，Salvatore A.E.Marras，and Kramer FR.Wavelength-shifting molecularbeacons.Nat Biotechnol 2000，181191-1196.)。通过在探针柄结构的一端连接两个荧光分子——荧光供体分子(绿色)和荧光受体分子(红色)。当反应体系中无相应互补靶分子时，由于荧光分子与淬灭剂互相接近，给予单色光源激发后，荧光供体分子产生的荧光被淬灭剂淬灭。当反应体系中存在相应的互补靶分子，探针与靶分子杂交，荧光供体分子与淬灭剂分开。在单色光源的激发下，荧光供体分子吸收能量产生荧光，通过荧光共振能量传递作用将能量传递给荧光受体分子使之发出荧光。在检测中只需改变不同的荧光受体分子，而不需要改变激发光源就能实现多个分子信标的同时检测。
临床中肿瘤的检测不仅需要较高的灵敏性，还要具有较高的特异性。尽管分子信标具有较高的敏感性，但分子信标进入细胞后有被细胞中的核酸酶降解或环柄被核酸结合蛋白打开的可能，因而出现假阳性(Mitchell，P.Turning the spotlight oncellular imaging.Nat.Biotechmol.，2001，19，1013-1017.)。应用单个分子信标检测肿瘤的特异性较低，因此常需两个分子信标检测一个靶分子，同时检测一种肿瘤的两种靶分子，能够提高应用分子信标检测肿瘤的特异性。在使用携带不同荧光分子的多个分子信标同时进行检测时，要求有多种不同的激发光源，使得同时检测多个靶分子时不能够做到方便、快捷，而且由于多种激发光源本身的特性，导致荧光分子的荧光强度不能达到最大。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供了一种特异性强、灵敏度高，方便、快捷、实用的波长转换双分子信标。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是包括信标供体和信标受体，两对分子信标中的信标供体采用相同的荧光分子，两对分子信标中的信标受体的荧光分子采用德州红和FITC、荧光黄和EADNS或四甲基罗丹明和cy3，且此信标受体的荧光分子应与信标供体的荧光分子不同。
本发明信标供体的荧光分子为荧光素、香豆素、德州红、FITC、荧光黄、EADNS、四甲基罗丹明或cy3。
本发明的波长转换双分子信标，首先是同时使用两组分子信标同时检测一种肿瘤的两个靶分子，既具备了分子信标的高敏感性，还保持了其高特异性。其次，在检测中只使用一种激光光源，为临床应用分子信标试剂检测肿瘤提供了可能性。
图1是本发明波长转换分子信标原理图；图2是本发明波长转换双分子信标检测同一细胞中的不同靶分子的示意图。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明作进一步详细说明。
参见图1，当分子信标未与靶分子3结合时，荧光照射所激发的绿色荧光会被淬灭剂淬灭，检测不到荧光。当分子信标与能够完全互补的靶分子3相遇时，由于寡核酐酸链具有相互反应的特性而完全结合，在分子信标与靶分子结合后，荧光4照射信标供体1时，信标供体1产生的绿色荧光通过FRET作用于信标受体2，就可以观察到信标受体2的强烈的红色荧光。
实施例1波长转换双分子信标，在检测一个细胞的两个靶分子3时，两对分子信标中的信标供体1均采用荧光素，两对分子信标中的信标受体2采用德州红和FITC。
实施例2波长转换双分子信标，在检测一个细胞的两个靶分子3时，两对分子信标中的信标供体1均采用香豆素，两对分子信标中的信标受体2采用荧光黄和EADNS。
实施例3波长转换双分子信标，在检测一个细胞的两个靶分子3时，两对分子信标中的信标供体1均采用德州红，两对分子信标中的信标受体2采用荧光黄和EADNS。
实施例4波长转换双分子信标，在检测一个细胞的两个靶分子3时，两对分子信标中的信标供体1均采用荧光黄，两对分子信标中的信标受体2采用四甲基罗丹明和cy3。
实施例5波长转换双分子信标，在检测一个细胞的两个靶分子3时，两对分子信标中的信标供体1均采用四甲基罗丹明，两对分子信标中的信标受体2采用德州红和FITC。
实施例6波长转换双分子信标，在检测一个细胞的两个靶分子3时，两对分子信标中的信标供体1均采用荧光黄，两对分子信标中的信标受体2采用德州红和FITC。
实施例7波长转换双分子信标，在检测一个细胞的两个靶分子3时，两对分子信标中的信标供体1均采用荧光素，两对分子信标中的信标受体2采用德州红和FITC。
本发明可以用两对分子信标共同检测同一个靶细胞中的两个靶分子3，采用一种单一激发光源4刺激信标供体1的供体荧光，根据激发出的不同信标受体2的荧光而确定活细胞中存在何种靶分子3，这种设计不仅由于应用双分子信标检测同一个靶分子而降低了分子信标检测可能出现的假阳性，而且只使用一种激发光源就能达到检测多个靶分子的目的，真正做到特异性强、灵敏度高，方便、快捷、实用。比如在检测膀胱肿瘤脱落细胞时，可以设计检测癌细胞中的Survivin和H-ras mRNA，每一个mRNA对应着1对分子信标，将这2对分子信标中的信标供体都连接上荧光素，信标受体分别连接德州红和FITC。在将分子信标与待检脱落细胞作用后，仅仅用488nm一种波长的荧光照射，如果待检细胞中只存在Survivin mRNA，待检细胞会发出红色荧光；如果待检细胞中只存在H-ras mRNA，待检细胞会发出蓝色荧光；如果待检细胞中上述两种mRNA都不存在，检测细胞不发荧光；如果检测细胞中上述2种mRNA都存在，则可以同时在一个细胞中检测到2种荧光(红和蓝色)。这种设计不仅由于应用双分子信标检测同一个靶分子而降低了分子信标检测可能出现的假阳性，而且只使用一种激发光源就能达到检测多个靶分子的目的，真正做到特异性强、灵敏度高，方便、快捷、实用。
参见图2，当双分子信标与靶分子3结合后，使用同一波长的荧光4照射待检细胞，当待检细胞内存在相应的靶分子3时，信标供体1产生的黄色荧光通过FRET作用到相应的信标受体2的荧光，就可以同时检测到信标受体强的绿色和橙色荧光。
权利要求
1.一种波长转换双分子信标，包括信标供体[1]和信标受体[2]，其特征在于两对分子信标中的信标供体[1]采用相同的荧光分子，两对分子信标中的信标受体[2]的荧光分子采用德州红和FITC、荧光黄和EADNS或四甲基罗丹明和cy3，且此信标受体[2]的荧光分子应与信标供体[1]的荧光分子不同。
2.根据权利要求1所述的波长转换双分子信标，其特征在于所说的信标供体[1]的荧光分子为荧光素、香豆素、德州红、FITC、荧光黄、EADNS、四甲基罗丹明或cy3。
全文摘要
一种波长转换双分子信标，包括信标供体和信标受体，两对分子信标中的信标供体采用相同的荧光分子，两对分子信标中的信标受体的荧光分子采用德州红和FITC、荧光黄和EADNS或四甲基罗丹明和cy3，且此信标受体的荧光分子应与信标供体的荧光分子不同。本发明首先是同时使用两组分子信标同时检测一种肿瘤的两个靶分子，既具备了分子信标的高敏感性，还保持了其高特异性。其次，在检测中只使用一种激光光源，为临床应用分子信标试剂检测肿瘤提供了可能性。
文档编号G01N21/76GK1696668SQ20051004282
公开日2005年11月16日 申请日期2005年6月16日 优先权日2005年6月16日
发明者贺大林, 赵军, 何辉 申请人:西安交通大学